Este estudio se centra en la inducción subcutánea in vivo de células luminiscentes de cáncer colorrectal en un modelo murino y la posterior medición de la luminiscencia mediante un sistema de imagen. El procedimiento tiene como objetivo establecer un modelo de crecimiento tumoral reproducible para el seguimiento en tiempo real y la evaluación terapéutica.
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Artículo de método
Inyección subcutánea de células de cáncer colorrectal humano en ratones desnudos atímicos para evaluar la eficacia antitumoral
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Resumen
Resumen
El cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales causas de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo, lo que pone de manifiesto la necesidad urgente de mejorar los modelos preclínicos para evaluar las posibles terapias. Los modelos animales son esenciales para dilucidar la biología tumoral y evaluar nuevas intervenciones terapéuticas. Los modelos de ratón ofrecen ventajas clave sobre los modelos existentes, como la manipulabilidad genética, la reproducción rápida, la rentabilidad y la disponibilidad de cepas inmunocompetentes e inmunodeficientes, lo que permite un modelado preciso de los cánceres humanos.
Este protocolo se centra en la inducción subcutánea de la línea celular bioluminiscente de cáncer colorrectal HCT-116 en un modelo murino inmunodeficiente, seguida de imágenes de bioluminiscencia no invasivas utilizando el sistema IVIS y el calibrador para monitorizar la progresión y el crecimiento del tumor. El uso de células luminiscentes proporciona un enfoque cuantificable en tiempo real para rastrear el desarrollo tumoral y la respuesta a las intervenciones terapéuticas, lo que reduce la necesidad de procedimientos invasivos. Se requiere una cohorte de ratones (n = 12) para la implantación de células tumorales, y se mide la intensidad de luminiscencia para establecer un modelo estandarizado para las pruebas terapéuticas. Por lo general, el volumen tumoral se calcula utilizando solo medidas de largo y ancho o ancho.
La metodología actual garantiza un establecimiento coherente del tumor al tiempo que minimiza la variabilidad°, lo que en última instancia mejora la fiabilidad de la evaluación preclínica. Los hallazgos de este estudio contribuirán a refinar los modelos tumorales para las pruebas de fármacos y mejorar el potencial traslacional de la investigación preclínica en aplicaciones clínicas. Mediante el empleo de técnicas de imagen avanzadas y un diseño experimental reproducible, este estudio tiene como objetivo mejorar la precisión y la eficiencia de la evaluación de fármacos in vivo para el tratamiento del cáncer colorrectal.
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es una importante carga para la salud mundial, y se encuentra entre las neoplasias malignas más prevalentes y mortales1. El desarrollo de modelos preclínicos fiables es esencial para evaluar nuevos enfoques terapéuticos, ya que los ensayos in vitro tradicionales no logran captar completamente la complejidad del crecimiento tumoral y la respuesta a los fármacos en un sistema vivo. Los modelos in vivo , en particular los modelos murinos, se han utilizado para proporcionar información valiosa sobre la biología tumoral, lo que permite a los investigadores evaluar la eficacia de posibles tratamientos en un entorno controlado.
El uso de células de CCR luminiscentes en modelos murinos representa un avance significativo en la investigación preclínica, ya que permite la monitorización no invasiva en tiempo real de la progresióntumoral 2. Este estudio tiene como objetivo establecer un protocolo estandarizado para la inducción de tumores subcutáneos y la obtención de imágenes IVIS para rastrear el crecimiento tumoral de manera dinámica. Se seleccionó un modelo de inyección subcutánea debido a su simplicidad técnica, reproducibilidad y facilidad de seguimiento longitudinal del tumor. Al aprovechar las imágenes de bioluminiscencia, los investigadores pueden obtener datos precisos y cuantificables sobre el desarrollo tumoral y las respuestas terapéuticas sin la necesidad de sacrificar animales enmúltiples puntos de tiempo.
El sistema de imagen IVIS es una potente herramienta para evaluar la carga tumoral con alta sensibilidad y especificidad, mejorando la reproducibilidad y la precisión de los estudios in vivo . Este estudio servirá como base para futuras evaluaciones terapéuticas, proporcionando un enfoque estandarizado y eficiente para las pruebas preclínicas de medicamentos para el tratamiento del cáncer colorrectal. Mediante el perfeccionamiento de los métodos de inducción tumoral y la implementación de técnicas de imagen avanzadas, esta investigación contribuye a cerrar la brecha entre las aplicaciones preclínicas y clínicas en oncología4.
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Protocolo
Los animales se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos de acuerdo con las directrices establecidas por el comité de ética del Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria (IMIB, Murcia) (n.º A13240502). Las inspecciones se realizaban semanalmente por personal cualificado en cumplimiento del R. D. 1201/2005.
1. Animales
NOTA: Todos los animales deben estar sujetos de forma segura antes de la inyección. Si se trabaja con ratones inmunodeficientes (es decir, ratones atímicos desnudos como Crl: NU(NCr)-Foxn1nu), es esencial mantener la esterilidad. El estudio actual utilizó 12 ratones desnudos atímicos, de 5 semanas de edad (20-22 g para las hembras y 22-26 g para los machos) al comienzo del experimento (50% para los hombres). Todos los procedimientos anestésicos y experimentales se realizaron en la Guía de Ética y Buena Práctica en Investigación del centro, con la aprobación del comité de ética institucional (Protocolo nº A13240502) y en cumplimiento de la legislación española (R.D. 1201/2005).
- Antes de iniciar el ensayo, aclimatar a los ratones, de 4 semanas de edad, al centro de animales durante aproximadamente 1 semana. Posteriormente, realice los siguientes procedimientos.
2. Preparación de la caldo de D-luciferina
- Prepare una solución de trabajo de 15 mg/mL de sustrato bioluminiscente de sal de potasio D-luciferina en solución salina tamponada con fosfato (PBS) precalentada en un tubo cónico dentro de un gabinete de bioseguridad. Invierta el tubo varias veces para homogeneizar bien la solución.
- Transfiera la solución a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm para la esterilización.
- Alicuente la solución esterilizada en microtubos opacos de 1 mL y almacene a -20 °C.
NOTA: Luciferin es sensible a la luz.
3. Preparación de la matriz extracelular
- Descongele el hidrogel de matriz extracelular (MEC) comercial sin rojo fenol durante la noche en hielo dentro de un refrigerador entre 2 °C y 8 °C5.
- El día de la inyección, mantener el ECM en hielo y, con una micropipeta P1000 preenfriada, introducir 200 μL de ECM en tubos estériles.
NOTA: Se recomienda el uso de microtubos de diámetro ancho. Minimice los cambios de temperatura y evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación. - Enfríe previamente las jeringas y las agujas en hielo antes de preparar las inyecciones para evitar cambios bruscos de temperatura de la MEC.
4. Desprendimiento de células y recuento
- Placa de células bioluminiscentes HCT-116 (línea celular ATCC CCL-247-LUC2) en matraces T75 unos días antes de la inducción tumoral para garantizar un número suficiente de células. Mantener el cultivo celular a 37 °C, 5% de CO2, y reemplazar el medio si es necesario6.
- El día del experimento, aspire el medio de cultivo con cuidado para evitar perturbar las células adherentes.
- Lavar las células con 8 mL de PBS estéril (precalentado a 30 °C en un baño de agua) para eliminar el suero residual.
- Añadir 2 mL por frasco de Tripsina-EDTA tibio (0,05%) e incubar a 37 °C durante 4-5 min. Monitoree el desprendimiento de células bajo un microscopio invertido. Si las células permanecen adheridas, golpee suavemente el costado del matraz para ayudar a su desprendimiento.
- Neutralice la tripsina agregando 10 mL de medio de crecimiento completo que contenga suero fetal bovino (FBS).
- Transfiera las células a un tubo cónico de 15 mL con una pipeta serológica de 10 mL. Enjuague los matraces con 2 ml adicionales de medio fresco para recoger las células restantes y agregue los lavados en el tubo de 15 ml.
- Centrifugar la suspensión celular a 200 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente el sobrenadante sin alterar la pellet de la célula.
- Vuelva a suspender suavemente el pellet de celda en 3 mL de medio de siembra para lograr una suspensión homogénea.
- Cuente las células en una cámara de Neubauer o en un contador automático de células. Determine la viabilidad celular mezclando 10 μL de la suspensión celular con 10 μL de azul de tripán y cuente las células viables bajo un microscopio invertido.
NOTA: Prepare un número suficiente de células para el estudio: al menos 3 × 106 células viables por ratón. - Resuspender las células en PBS estéril (precalentado a 30 °C en un baño de agua) y modificar la concentración de células viables a una concentración final de 2 × 107 células/mL con PBS. Preparar alícuotas de 200 μL.
5. Prepare los elementos del equipo y anestesiar a los animales.
- Encienda el sistema de imágenes al menos 4 horas antes de la toma de imágenes.
NOTA: Siga las instrucciones del sistema para permitir el paso de inicialización, incluido el ajuste de la configuración de la intensidad de la luz y el tiempo de exposición de la cámara en función de la relación señal-ruido. Esta configuración debe establecerse manualmente en función de las condiciones experimentales. - Pesar a los animales y calcular el volumen de D-luciferina que debe administrarse (200 μL de una solución de 15 mg/mL por cada 20 g del animal).
- Limpie y desinfecte las cámaras de imágenes y el gabinete.
- Identifique y sujete de manera segura a cada ratón para la anestesia.
NOTA: Use dos pares de guantes para proteger las manos de pinchazos accidentales con agujas durante la inyección subcutánea. - Anestesiar ratones con isoflurano al 2% en oxígeno a un flujo de 1,8-2,0 L/min. Encienda la bomba de succión simultáneamente con la bomba de anestesia.
6. Preparación de las células para la inyección
- Mezcle 200 μL de 2 × 107 células CRC bioluminiscentes/mL con 200 μL de ECM en un criovial dentro de una cabina de bioseguridad. Pipetear suavemente con una pipeta P1000 para evitar la formación de burbujas de aire y la disociación.
- Transfiera la mezcla de 400 μL a una jeringa de 1 mL, elimine las burbujas de aire y proceda inmediatamente a la inyección.
- Destapar la aguja de forma segura, manteniendo siempre la esterilidad de la aguja.
NOTA: Se recomienda utilizar agujas individuales para cada animal para minimizar la contaminación. Se utiliza una aguja nueva para cada ratón para prevenir la infección cruzada entre ratones. - Coloque una aguja de 25 g y ajuste el contenido de la jeringa a 200 μL, eliminando las burbujas de aire.
NOTA: Las inyecciones generalmente se realizan con 200 μL, lo que lleva a 2 × 106 células por inyección. - Deslice la aguja de nuevo en la tapa sin apretar sin manipular ni la tapa ni la aguja mientras el animal está sujeto.
7. Inducción de tumores subcutáneos
- Retire el ratón de la cámara una vez que esté anestesiado y coloque el hocico del animal en una salida que suministre el mismo anestésico.
NOTA: En nuestro caso, la boquilla se hizo con un guante. - Coloque al animal sobre su lado derecho sobre una superficie plana. Con las puntas de los dedos de la mano no dominante, pellizque y levante suavemente la piel del animal en el cuadrante inferior izquierdo.
- Antes de inyectar, aspire primero para asegurar la colocación adecuada de la aguja. Inserte la aguja biselada con la mano dominante, dos tercios en la piel levantada, paralela al cuerpo, teniendo mucho cuidado de no pincharse los dedos o perforar los guantes dobles.
NOTA: La colocación adecuada debe producir presión negativa y ninguna aspiración en el cubo de la aguja. - Inyecte el contenido de la jeringa (200 μL) en la piel levantada, justo entre los dos dedos. Sostenga brevemente antes de retirar la aguja lentamente. Retire la aguja después de la inyección subcutánea y deséchela de manera segura en un recipiente para objetos punzocortantes.
8. Inyección intraperitoneal de D-luciferina
- Antes de devolver el animal a la cámara de anestesia, administrar D-luciferina por vía intraperitoneal (IP) a una concentración de 150 mg/kg de peso corporal con la solución madre de 15 mg/ml en una jeringa de insulina de 30 g (200 μl por 20 g del animal).
NOTA: La inyección de hasta 0,5 mL es bien tolerada. - Sujeción manual, decúbito dorsal (con el abdomen hacia arriba), con el extremo craneal (cabeza) del animal apuntando hacia abajo. Permita que el contenido intestinal se mueva hacia abajo.
- Manteniendo la aguja con el lado del bisel hacia arriba y ligeramente inclinada a 15-20°, empuje la aguja dentro de la cavidad abdominal de modo que la punta de la aguja penetre justo en la pared abdominal del cuadrante abdominal inferior izquierdo del animal.
- Inyecte lentamente la D-luciferina en la cavidad intraperitoneal, retire la aguja y deséchela de manera segura.
- Coloque el ratón en la cámara de anestesia y deje que se estabilice durante aproximadamente 5 minutos. Después de 15 minutos, proceda con la obtención de imágenes in vivo .
NOTA: Construya una curva cinética de D-luciferina para cada nuevo modelo animal para determinar el tiempo pico de la señal. En nuestro caso, la emisión de luz alcanzó su punto máximo aproximadamente a los 15 minutos en imágenes in vivo .
9. Análisis de imágenes in vivo
- Coloque al animal completamente anestesiado en la cámara del sistema de imágenes, en el flanco derecho. Asegúrese de que el animal esté correctamente alineado con la cámara y la fuente de luz para capturar el área del tumor.
- Abra el software vinculado. Elija el modo de imagen visual o fotográfica para confirmar la posición del animal. Guarde los datos y cambie el nombre de la carpeta.
- Elija el modo de imagen de bioluminiscencia y configúrelo en automático. Capture imágenes de bioluminiscencia y monitoree la luz del tumor en la pantalla de la computadora.
- Una vez que se completen las imágenes, regrese al animal a su jaula y observe cualquier complicación.
- Realizar el postprocesamiento, primero escalar la luz bioluminiscente para que todos los tumores de los ratones muestren la misma escala, normalmente entre1e6 y1e8.
- Establezca una región de interés (ROI) alrededor del tumor para el análisis y cópiela para análisis posteriores. Mida la luz del ROI y exporte estos resultados para su posterior análisis. Pegar el ROI creado y copiado previamente del mismo tamaño para los tumores posteriores.
- Apague el sistema de acuerdo con las instrucciones del fabricante y limpie la cámara de imágenes. Apague las bombas de extracción y anestesia, junto con el flujo de oxígeno.
10. Medición del volumen tumoral
- Anestesiar a los animales con isoflurano para la medición del tumor. Coloque al animal en una posición estable y cúbrale la cabeza. Inmovilizar rápidamente al animal.
- Mida la longitud, la anchura y la profundidad del tumor con un calibrador digital calibrado.
NOTA: Realice las mediciones rápidamente, ya que el animal comenzará a despertar aproximadamente 1 minuto después de ser retirado de la cámara de anestesia. - Repita las mediciones y calcule un promedio.
- Calcule el volumen según la fórmula para tumores esféricos o elípticos:
Para tumores esféricos 7
(1)
Para tumores elipsoides 8
(2)
NOTA: Para minimizar el sesgo de medición, todas las mediciones tumorales dentro del estudio deben ser realizadas por el mismo operador. Además, debe tenerse en cuenta que el día de la inducción del tumor, la medición precisa suele ser un desafío porque la masa tumoral aún no está completamente solidificada.
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Resultados
Este protocolo permite la introducción de células humanas en un modelo de ratón inmunodeficiente, permitiendo el crecimiento de estas células tumorales in vivo, lo que siempre es más relevante fisiológicamente que in vitro. Es crucial garantizar que las condiciones experimentales sean lo más reproducibles posible, que los tumores contengan un número similar de células viables y que se implanten en un lugar comparable y consistentemente accesible.
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Discusión
El protocolo para la inducción subcutánea de células de cáncer colorrectal luminiscentes en un modelo de ratón desnudo atímico presenta un enfoque estandarizado y reproducible para la formación de tumores y el seguimiento en tiempo real. En primer lugar, es importante tener en cuenta que estos estudios suelen realizarse a lo largo de 28 días, y que las mediciones de luminiscencia se realizan el día de la inducción del tumor y, posteriormente, semanalmente. Por el contrario, las medicione...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales contrapuestos conocidos que puedan influir en el trabajo reportado en este estudio.
Agradecimientos
ACS y CNN pertenecen al "Programa de Doctorado en Ciencias de la Salud, Universidad Católica de Murcia (UCAM), Campus de los Jerónimos nº 135, Guadalupe 30107, Murcia, España" y cuentan con becas de doctorado de la UCAM. Los autores agradecen a las plataformas de Animalarios del IMIB (Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria, Murcia), donde se realizó el ensayo preclínico.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de microtubos opacos de 1 mL | Eppendorf | 30125215 | Almacenamiento de D-luciferina |
| Tubo cónico de 15 mL | Falcon, Thermo Fisher Scientific | 11507411 | Material de cultivo celular |
| Dulbecco avanzado' s Eagle Medio Modificado (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 1152046 | Reactivo de cultivo celular |
| Ratón desnudo atímico | Río Charles | Crl:NU(NCr)-Foxn1nu | Ratón desnudo inmunodeficiente |
| Células bioluminiscentes de cáncer de colon humano HCT116 | ATCC | CCL-247-LUC2 | HCT 116-Luc2 es ideal para la bioluminiscencia in vivo |
| D-luciferina Pierce | Thermo Fisher Scientific | 15215733 | Para la medición de bioluminiscencia |
| Matriz extracelular (ECM) | Corning | 356231 | Matriz Matrigel para invasión celular |
| Suero fetal bovino | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Reactivo de cultivo celular |
| Puntas de pipeta de filtro | Finntip, Thermo Fisher Scientific | 94056710 | Para evitar la formación de burbujas de aire |
| Jeringuilla de insulina 25 g 1 mL | Iberomed | JERINRAYS29 | Para la implantación de líneas celulares con HCT-116 |
| Jeringuilla de insulina 30 G 0,5 mL | DH Material médico | 9.41652E+15 | Para la administración de D-luciferina |
| Sistema de imagen IVIS con software Living Image | PerkinElmer/Revvity | 128201 | Escáner de bioluminiscencia y fluorescencia |
| Heparina Estericana de aguja | VWR | 612-0153 10 | Administración de D-luciferina y implantación de HCT-116 |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | VWR | 392-0042P | Solución de suspensión celular para el desprendimiento e implantación de HCT-116 |
| Tripsina-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 11590626 | Reactivo de cultivo celular |
| Matraz T-75, tratado con TC | STARLAB | CC7682-41 | Material de cultivo celular |
Referencias
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