Imágenes 3D de alta resolución y análisis de aprendizaje automático sin etiquetas de organoides intestinales mediante holotomografía de baja coherencia

Los organoides son versiones tridimensionales (3D) miniaturizadas de órganos cultivados a partir de células madre, capaces de recapitular características estructurales y funcionales clave de órganos reales in vitro¹. Los investigadores han desarrollado sistemas de organoides para una amplia gama de tejidos, incluidos el intestino, el cerebro, los pulmones, el hígado y el riñón, cada uno de los cuales demuestra la arquitectura autoorganizada y la diversidad de tipos celulares que recuerdan a su contraparte in vivo . Al reflejar la arquitectura de los órganos nativos y la complejidad multicelular, los organoides sirven como poderosos sistemas modelo para estudiar el desarrollo humano, la regeneración de tejidos^{y los mecanismos} de la enfermedad. Se han convertido en herramientas fundamentales para el modelado de enfermedades y el descubrimiento de fármacos, lo que permite a los investigadores explorar las vías de la enfermedad y probar nuevas terapias en tejidos 3D específicos del paciente en el laboratorio². En particular, los organoides también son prometedores en la medicina regenerativa³: los tejidos derivados de organoides se pueden injertar in vivo para reparar el daño, como se demostró con los organoides intestinales y hepáticos, lo que subraya su potencial para restaurar la función de los órganos⁴. Esta versatilidad hace que los organoides sean indispensables en la investigación biomédica moderna y la medicina personalizada.

Dada su composición multicelular y complejidad estructural 3D, capturar y analizar la dinámica de los organoides es crucial. Sin embargo, las técnicas de imagen convencionales enfrentan limitaciones significativas en la resolución de estructuras y dinámicas de organoides, a menudo produciendo instantáneas 2D que no representan su estado fisiológico completo⁵.

La microscopía de campo claro es un método no invasivo ampliamente utilizado para capturar organoides. Monitorea convenientemente el crecimiento y la morfología, pero proporciona un contraste limitado en muestras 3D sin teñir. Además, carece de seccionamiento óptico, lo que resulta en una mala resolución de las estructuras internas. Los organoides parecen en gran parte transparentes, lo que dificulta la detección de características finas debajo de la superficie⁶. El contraste de fase mejora la visibilidad al convertir los cambios de fase en diferencias de intensidad, revelando la arquitectura general (por ejemplo, un lumen central) sin manchas. A pesar de su utilidad para la observación en tiempo real, el contraste de fase sufre de artefactos de halo, baja resolución y profundidad de penetración limitada, lo que lo hace menos efectivo para^{organoides más} gruesos.

El corte en serie seguido de tinción de hematoxilina y eosina (H&E) e inmunotinción basada en anticuerpos se usa ampliamente para analizar la microestructura de organoides y la composición celular⁸. Las técnicas mejoradas de procesamiento de tejidos, como la inclusión de parafina fijada en formol (FFPE) y la criosección, mejoran la preservación de la morfología, y la FFPE ofrece resultados superiores⁹. La incorporación de organoides en hidrogeles como la agarosa y la centrifugación alinean varias muestras en una sola sección, lo que mejora la eficiencia del análisis. Las secciones teñidas con H&E de organoides tumorales derivados de pacientes reflejan la histología tumoral original, mientras que la tinción de inmunofluorescencia destaca marcadores como CK8 para la identificación celular¹⁰. Sin embargo, estas técnicas no pueden monitorear organoides vivos y pueden introducir artefactos como arrugas o deformaciones del tejido durante el corte.

La microscopía de fluorescencia confocal se usa ampliamente para la obtención de imágenes de organoides, produciendo secciones ópticas de alta resolución (submicrométricas) que permiten una visualización detallada de la arquitectura de los organoides y la composición celular^11,12. Sin embargo, las imágenes confocales de organoides 3D generalmente se limitan a capas superficiales (hasta 100 μm de profundidad) y pueden llevar mucho tiempo y ser fototóxicas debido a la iluminación láser de escaneo puntual¹³. La microscopía de fluorescencia de hoja de luz (LSFM) supera algunas de estas limitaciones al iluminar solo el plano de imagen, logrando imágenes volumétricas rápidas de organoides completos con un fotoblanqueo y fototoxicidad mínimos^14,15; sin embargo, esta técnica a menudo requiere la limpieza del tejido para obtener imágenes óptimas de muestras gruesas. Además, la profundidad de las imágenes LSFM está restringida por la dispersión de la luz y los desajustes del índice de refracción (RI), que pueden mitigarse mediante óptica adaptativa, imágenes multivista y longitudes de onda de excitación optimizadas¹⁶. El montaje de muestras también introduce deformaciones estructurales, mientras que los grandes conjuntos de datos 3D plantean desafíos computacionales en el almacenamiento y el análisis. Los avances recientes, incluidas las técnicas mejoradas de etiquetado genético, los nuevos reactivos de limpieza, la óptica adaptativa y el análisis de imágenes impulsado por IA, están abordando estas limitaciones, lo que hace que LSFM sea cada vez más factible para la investigación de organoides⁷.

A pesar de estos avances, las técnicas de imágenes de fluorescencia 3D plantean varios desafíos para el monitoreo a largo plazo de organoides vivos. En primer lugar, el uso del marcaje fluorescente introduce efectos fototóxicos y perturba los procesos biológicos, lo que plantea desafíos para estudios prolongados de imágenes en vivo¹⁷. En segundo lugar, el marcaje basado en anticuerpos sufre de una penetración limitada debido a las barreras de difusión dentro de las estructuras densas de los organoides, lo que requiere métodos avanzados de permeabilización y limpieza de tejidos, que tardan más de 10 días de incubación para el uso de anticuerpos primeros y secundarios¹⁸. En tercer lugar, la transfección y la expresión estable de proteínas fluorescentes en organoides siguen siendo ineficientes, ya que los enfoques convencionales de administración de genes luchan con entornos 3D¹⁹. En cuarto lugar, las técnicas de aclaramiento óptico, esenciales para la obtención de imágenes profundas, a menudo conducen a la pérdida de la señal de fluorescencia y la distorsión del tejido, lo que requiere protocolos de aclarado optimizados que equilibren la transparencia y la preservación de la fluorescencia²⁰.

Para abordar estas limitaciones, se ha introducido la holotomografía (HT) como una técnica para obtener imágenes de organoides vivos no marcados con alta resolución a lo largo del tiempo. También conocida como imágenes de fase cuantitativas en 3D, HT es una modalidad de alta resolución sin etiquetas que permite la visualización cuantitativa en tiempo real de los organoides mientras preserva su estado fisiológico nativo. El principio de la TH es análogo a la tomografía computarizada de rayos X; mediante la captura de múltiples imágenes de campo óptico 2D en diversas condiciones de iluminación, la distribución RI 3D de una muestra no etiquetada se reconstruye mediante la resolución de ecuaciones de onda inversa 21,22,23. La TH se ha aplicado ampliamente en varios campos biológicos, incluida la hematología^24,25, la condensación de fase en biología celular²⁶, la microbiología²⁷ y la histopatología²⁸. Más recientemente, su capacidad de imágenes 3D de alta resolución y sin etiquetas se ha utilizado cada vez más para la investigación de organoides 21,22,23,29, ofreciendo un enfoque no invasivo para estudiar su dinámica estructural y funcional.

En este estudio, presentamos un protocolo detallado para el uso de TH de baja coherencia en el monitoreo a largo plazo y sin etiquetas de organoides del intestino delgado (sIO) de ratón. Este método permite la visualización en tiempo real del crecimiento de los organoides y las respuestas a los fármacos durante 24 h, al tiempo que proporciona mediciones cuantitativas del volumen de los organoides, la densidad de proteínas y el contenido de proteínas, lo que facilita un análisis riguroso y basado en datos del comportamiento de los organoides. Para investigar las alteraciones morfológicas en los organoides, tratamos las muestras con cisplatino, un agente quimioterapéutico a base de platino conocido por inducir la apoptosis mediante la formación de enlaces cruzados de ADN e inhibir la replicación celular³⁰. Si bien las imágenes RI en 3D capturan detalles estructurales, el análisis sistemático es esencial para cuantificar la dinámica de los organoides. Para lograr esto, integramos ilastik, un kit de herramientas de segmentación basado en aprendizaje automático³¹ para diferenciar las regiones de organoides del fondo. Este protocolo describe el flujo de trabajo completo, incluida la preparación del cultivo de organoides, la adquisición de HT 3D, la segmentación basada en el aprendizaje automático y el análisis cuantitativo de los tomogramas RI. Al ofrecer un marco de imágenes escalable, reproducible y no invasivo, este enfoque establece un nuevo estándar para la investigación de organoides con amplias aplicaciones en el modelado de enfermedades, la medicina regenerativa y la detección de fármacos.

NOTA: Los detalles relacionados con todos los materiales, instrumentos y software utilizados en este protocolo se proporcionan en la Tabla de materiales. Se pueden utilizar productos equivalentes de diferentes fabricantes como alternativas. En la Figura 1 se presenta un proceso esquemático de todo el protocolo.

1. Preparación de la muestra

1. Preparación del medio de cultivo sIO
   1. Prepare el medio de cultivo disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esterilice el medio de cultivo filtrándolo a través de una unidad de filtro de 0,22 μm.
      NOTA: Si el medio se prepara completamente en condiciones estériles en una campana de cultivo celular y todos los componentes están preesterilizados (por ejemplo, provistos en frascos y viales estériles), es posible que no sea estrictamente necesaria la filtración a través de un filtro de 0,22 μm.
   2. Alícuota 15 ml de medio preparado en tubos de almacenamiento estériles. Caliente el medio alícuota a temperatura ambiente (15 - 25 °C) antes de usarlo en cultivo de organoides.
2. Descongelación de existencias de sIO
   1. Descongele rápidamente el caldo de organoides congelado en 2 minutos con un baño de agua a 37 °C. Transfiera la suspensión de organoides descongelada a un tubo de microcentrífuga y centrifugue a 150 x g durante 3 min para granular los organoides.
   2. Retire con cuidado el sobrenadante para eliminar el DMSO, minimizando los posibles efectos citotóxicos.
   3. Agregue medios y matriz extracelular (ECM) fresca en una proporción de 1:4 y pipetee suavemente para garantizar una resuspensión uniforme del gránulo. Dispense 15 μL por domo en cada pocillo de una placa de 48 pocillos. Mantenga la ECM en hielo para evitar la polimerización prematura.
   4. Coloque la placa boca abajo en una incubadora de_CO2 al 5% a 37 °C durante 1 h para permitir la polimerización de ECM. Después de la polimerización, agregue cuidadosamente 200 μL de medios nuevos a cada pocillo.
      NOTA: Este protocolo es compatible con varias placas de imágenes comerciales y placas de pocillos. Ajuste el volumen del medio de acuerdo con el tipo de pozo para asegurarse de que la cúpula ECM esté completamente sumergida.
3. Transferencia de sIO
   NOTA: Los organoides tienden a adherirse a las puntas de las pipetas. Para minimizar la adherencia, humedezca previamente las puntas de pipeta con el medio.
   1. Aspirar medio gastado. Agregue 200 μL de solución de recuperación celular a cada pocillo e incube a 4 °C durante 30 min para facilitar la degradación de ECM y la recuperación de organoides.
   2. Recoja la suspensión de organoides mediante un pipeteo suave y transfiérala a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 150 x g durante 3 min, luego retirar con cuidado el sobrenadante.
   3. (Opcional) Para pasar como células individuales, realice uno de los siguientes métodos de disociación:
      1. Método enzimático: Agregue 100 μL de solución de disociación unicelular al pellet e incube a 37 °C, incubadora al 5% de CO₂ durante 1-2 min. Agregue 150 μL de medio para neutralizar. Realice pipeteos o golpecitos suaves. Centrifugar a 150 x g durante 3 min y retirar el sobrenadante, dejando solo el pellet.
         NOTA: Evite la sobreincubación, ya que la exposición prolongada puede ser muy perjudicial para las células.
      2. Disociación mecánica: Vuelva a suspender el pellet en 200 μL de medio de cultivo. Con una pipeta P200, pipetea hacia arriba y hacia abajo 20x-30x para disociar mecánicamente los organoides en fragmentos más pequeños o células individuales. Centrifugar a 150 x g durante 3 min, luego aspirar el sobrenadante y retener el pellet.
   4. Agregue medios y ECM nuevos en una proporción de 1:4 y pipetee suavemente para garantizar una resuspensión uniforme del gránulo. Dispense 15 μL por domo en cada pocillo de una placa de 48 pocillos.
   5. Coloque la placa boca abajo en una incubadora de_CO2 al 5% a 37 °C durante 1 h para permitir que la ECM polimerice.
   6. Después de la polimerización, agregue 200 μL de medio de cultivo fresco a cada pocillo y llene los pocillos exteriores vacíos con PBS para evitar la evaporación. Reemplace el medio de cultivo cada 2-3 días y pase los organoides semanalmente. Ajuste el intervalo de paso de acuerdo con el tamaño deseado del organoide.
4. Tratamiento farmacológico
   1. Prepare una solución madre de cisplatino de 10 mM disolviendo 3,00 mg de cisplatino en polvo (MW ≈ 300,05 g/mol) en 1 ml de DMSO. Agite brevemente y proteja la solución de la luz usando tubos ámbar o envolviéndolos con papel de aluminio.
   2. Para preparar el medio de tratamiento, diluya el stock de cisplatino 10 mM 1:1.000 en medio de cultivo sIO completo para obtener una concentración final de 10 μM de cisplatino y 0,1% de DMSO.
   3. Para el control del vehículo, prepare DMSO al 0,1% en medio de cultivo para que coincida con la concentración final de DMSO sin cisplatino.
   4. Retire el medio gastado de los cultivos de sIO y reemplácelo suavemente con un medio que contenga cisplatino de 10 μM o un medio de control solo con DMSO.
   5. Después del tratamiento, transfiera las muestras a la incubadora del sistema de imágenes.

2. Imágenes de holotomografía de baja coherencia utilizando software operativo

1. Preparación de muestras para imágenes
   1. Dispense 15 μL de cúpula ECM organoide en el plato de imágenes con fondo de cubreobjetos #1.5 siguiendo el procedimiento descrito en los pasos 1.3.1-1.3.4. Coloque cada cúpula en el plato lo más cerca posible del centro para obtener imágenes óptimas.
   2. Antes de la polimerización, incube a temperatura ambiente durante 1 minuto para permitir que los organoides se asienten en el fondo.
   3. Coloque la placa boca abajo en una incubadora de_CO2 al 5% a 37 °C durante 1 h para polimerizar la ECM. Luego, agregue suavemente suficiente medio de cultivo para sumergir completamente los organoides.
      NOTA: Ajuste el volumen medio para asegurarse de que los organoides estén completamente sumergidos de acuerdo con el tamaño del plato de imágenes con fondo de cubreobjetos.
   4. A los 5 días después del paso, lave la muestra 2x-3x con PBS inmediatamente antes de la obtención de imágenes para eliminar los residuos y reducir los artefactos ópticos.
2. Configuración de imágenes
   1. Encienda el controlador ambiental para mantener la viabilidad de la muestra. La unidad de control de la cámara ajusta automáticamente la temperatura a 37 °C y la concentración de_CO2 al 5%.
   2. Presione el botón Door en la parte frontal del instrumento para abrir la puerta. Agregue agua para formar una capa delgada dentro del pozo de la cámara para evitar que los medios de cultivo se sequen.
   3. Coloque el plato de imágenes en un soporte de vaso adecuado, insértelo en la cámara de imágenes y asegúrelo con un pasador para evitar movimientos. Asegúrese de que el plato esté firmemente sujeto al soporte del recipiente sin inclinarlo.
   4. Cierre la puerta del instrumento con el botón Door para bloquear la interferencia de la luz externa.
   5. Inicie el software TomoStudio X e inicie sesión. Haga clic en Iniciar para abrir la ventana principal.
   6. Haga clic en Agregar proyecto en la esquina superior izquierda y asigne parámetros experimentales (por ejemplo, nombre del proyecto, tipo de medio, tipo de muestra, etc.). El panel de muestras se creará automáticamente. Asegúrese de que se asigne el tipo de medio correcto para el uso de la instancia de instancia reservada adecuada en el experimento.
   7. Haga clic en el pocillo deseado en el panel y haga clic en Crear en la parte superior para registrar los pocillos como muestras.
   8. Haga clic en Configuración de ROI en la esquina superior derecha para definir la región de interés (ROI) en el plato. Una vez configurados todos los parámetros, haga clic en Ejecutar experimento en la esquina inferior derecha para abrir la ventana de adquisición de imágenes.
   9. Haga clic en Cargar recipiente en la esquina superior derecha. Aparecerá una imagen de campo claro. Ajuste la posición Z usando los botones +Z y -Z para enfocar.
   10. En la pestaña Imagen única, ajuste el tamaño del ROI. Capture organoides dentro de un campo de visión de 160 μm x 160 μm y adquiera pilas axiales de hasta 140 μm de profundidad. Para organoides más grandes, adquiera varios tomogramas RI y cose imágenes seleccionando la casilla de verificación Imágenes de mosaico en la parte inferior.
   11. Vaya a la pestaña Imágenes de lapso de tiempo para configurar imágenes a largo plazo. Establezca la duración y el tiempo de intervalo según sea necesario. En este experimento, las imágenes de lapso de tiempo se realizaron a intervalos de 10 minutos durante un período de 24 h, y el análisis se realizó a intervalos de 2 h durante la misma duración.
   12. Haga clic en el icono Escanear para capturar la ubicación actual del ROI. Centre manualmente la cúpula ECM utilizando imágenes de campo claro. Haga clic en el botón BF para ajustar los valores de intensidad y exposición para las imágenes de campo claro.
   13. Seleccione ROI moviendo el cuadro ROI que aparece en el panel Vista previa. Una vez que se encuentre el ROI deseado, haga clic en Agregar punto en la parte inferior. Aparecerá la lista de puntos de imagen.
   14. Haga clic en Adquirir para iniciar la creación de imágenes. Se adquirirán los datos de imagen sin procesar.
3. Adquisición de imágenes
   NOTA: Este proceso genera un archivo común de Tomocube (TCF) a partir de datos de imagen sin procesar. Los datos de imagen sin procesar deben procesarse en un archivo TCF, que contiene varios tipos de imágenes, como un tomograma RI y una proyección de intensidad máxima. El tomograma RI representa la distribución 3D RI de la muestra, y la proyección de intensidad máxima muestra el valor más alto de RI para cada posición lateral en el plano XY.
   1. Arrastre y suelte archivos de imagen RAW en el servidor de procesamiento HTX. Haga clic en Procesar para generar un archivo TCF a partir del archivo de imagen sin procesar.
   2. Para ver los tomogramas de RI generados en el archivo TCF, utilice TomoAnalysis Viewer, MATLAB o Python. Para ver un archivo TCF en MATLAB, utilice funciones como h5info y h5read. Del mismo modo, en Python, use el paquete h5py para leer archivos H5.

3. Análisis de imágenes

1. Segmentación de imágenes basada en aprendizaje automático
   1. Exporte el archivo de imagen TCF al formato HDF5 (Archivo de codificación suplementario 1) para asegurarse de que los datos estén en un formato multidimensional compatible con ilastik.
   2. Abra ilastik y navegue hasta Archivo > nuevo proyecto. Seleccione Clasificación de píxeles en la sección Flujos de trabajo de segmentación. Guarde el archivo de proyecto en un directorio designado.
   3. Cargue el archivo HDF5 navegando a 1. Ficha Datos de entrada. Haga clic en Agregar nuevo archivo, seleccione el conjunto de datos H5 adecuado y asegúrese de que se asignan los canales de imagen correctos.
   4. Vaya a 2. Pestaña Selección de características para seleccionar características relevantes (Color/Intensidad, Borde, Textura) para optimizar la segmentación.
      NOTA: La selección de características puede variar en función del dataset y las características de la imagen. Para el análisis actual, las características seleccionadas incluyeron: Color/Intensidad (σ = 1,60), Borde (σ = 3,50) y Textura (σ = 1,60). Es posible que se requiera una optimización basada en un enfoque heurístico dependiendo de la complejidad de la imagen. Alternativamente, la función Sugerir características > Ejecutar selección de características en ilastik se puede utilizar para identificar un conjunto óptimo de parámetros.
   5. En 3. Entrenar, etiquetar regiones organoides y no organoides aplicando pinceladas de distintos colores. Para mejorar la fidelidad de la segmentación, anote cuidadosamente las regiones alrededor de los límites.
   6. Haga clic en Actualización en vivo para obtener una vista previa de los resultados de la segmentación y realizar los ajustes necesarios.
   7. Navega hasta 4. Exportación de predicciones. En la Selección de origen, elija Segmentación simple para exportar las predicciones etiquetadas. Haga clic en Exportar todo, asegurándose de que el formato de salida esté establecido en .h5 o .tiff, según los requisitos de análisis posteriores.
2. Análisis cuantitativo de características
   NOTA: Este paso de protocolo se ejecuta en MATLAB, con cada procedimiento detallado en el archivo de codificación complementario 2.
   1. Al combinar el tomograma RI con la imagen de máscara, cree una imagen RI enmascarada que incluya solo la región organoide.
   2. Usando la imagen RI enmascarada, calcule parámetros cuantitativos como el volumen de organoides, la densidad de proteínas y el contenido de proteínas.
      1. Volumen: calcule el volumen total del organoide multiplicando el número de píxeles de la máscara segmentada por la resolución de píxeles para X, Y y Z. Calcule el número de píxeles contando todos los valores de vóxel en la matriz de máscara etiquetada con organoides, utilizando la función integrada de MATLAB Sum.
         NOTA: La resolución de píxeles está determinada por el sistema de imágenes y se puede encontrar en el grupo de atributos 3D de > de datos dentro de la estructura HDF5.
      2. Densidad de proteínas: Calcule la densidad de proteínas restando el valor de RI medio del RI medio del organoide y dividiéndolo por el incremento del índice de refracción de proteínas.
         1. RI del medio: Mida el RI del medio circundante utilizando un refractómetro antes del análisis.
         2. Valor medio de RI: Determine el RI medio del organoide promediando los valores de RI de los vóxeles ubicados dentro de la máscara del organoide.
         3. Incremento del índice de refracción de proteínas (α): Utilice una constante empírica previamente informada derivada de estudios de incremento del índice de refracción.
      3. Contenido de proteína: Calcule el contenido total de proteína multiplicando el volumen determinado en el Paso 3.2.2.1 por la densidad de proteína obtenida en el Paso 3.2.2.2.

La Figura 1 ilustra el flujo de trabajo esquemático para imágenes 4D y análisis cuantitativo de sIO. Este protocolo permite obtener imágenes en vivo continuas y una evaluación integral de los sIO a través de un proceso de cuatro pasos: cultivo, imágenes 4D, procesamiento de imágenes y análisis cuantitativo (Figura 1D).

Después de un período de incubación de 5 días, los sIO maduros se transfirieron a placas de imágenes con fondo de cubreobjetos para su visualización mediante holotomografía (HT) de baja coherencia (Figura 1A). Esta técnica de imagen reconstruye los tomogramas RI a través de un algoritmo de deconvolución (Figura 1B), lo que permite obtener imágenes de alta resolución y sin etiquetas de organoides vivos.

El procesamiento de imágenes se realizó posteriormente utilizando un enfoque de segmentación asistido por aprendizaje automático, lo que facilitó una delineación estructural precisa (Figura 1C). Primero, los tomogramas RI sin procesar se convirtieron al formato HDF5 para compatibilidad con ilastik, una herramienta interactiva de segmentación basada en aprendizaje automático. Dentro de ilastik, la clasificación a nivel de vóxel se entrenó para generar máscaras de organoides que identificaron selectivamente la estructura de los organoides. Estas máscaras se multiplicaron por las imágenes RI originales para extraer imágenes RI enmascaradas que excluían el fondo, aislando solo la región organoide para el análisis.

A partir de estas imágenes RI enmascaradas, el volumen de organoides se calculó contando el número de vóxeles clasificados como organoides y multiplicándolos por las dimensiones de los vóxeles. La densidad proteica se calculó restando el IR del medio del IR medio de la región organoide y dividiéndolo por una constante de incremento de RI proteica (α = 0,185 mL/g)32,33. Finalmente, el contenido total de proteína se obtuvo multiplicando la densidad de proteína por el volumen del organoide.

Este enfoque cuantitativo basado en RI, combinado con la segmentación impulsada por el aprendizaje automático, permitió el monitoreo dinámico y sin etiquetas de parámetros morfológicos y biofísicos como el volumen, la densidad de proteínas y el contenido a lo largo del tiempo (Figura 1D). Estas mediciones revelaron claras diferencias entre los sIO tratados con vehículo y cisplatino, lo que destaca la utilidad de este marco para estudiar las respuestas estructurales y funcionales inducidas por fármacos en organoides vivos.

A través del corte óptico de tomogramas RI reconstruidos, visualizamos con éxito la intrincada microarquitectura interna de los sIO, identificando distintos tipos de células epiteliales, incluidas las células de Paneth, las células caliciformes y las células enteroendocrinas (Figura 2A-D). Los cortes XY de alta resolución de los tomogramas RI proporcionaron una clara diferenciación de estos tipos de células en función de sus distintas propiedades RI y características morfológicas.

Las células de Paneth (Figura 2B) fueron identificables por sus altos valores de IR y gránulos secretores densamente empaquetados, que son característicos de su función antimicrobiana dentro de la cripta intestinal34. Las células caliciformes (Figura 2C) mostraron una morfología alargada y se caracterizaron por vesículas llenas de moco, que juegan un papel crucial en la formación de la capa mucosa protectora35. Las células enteroendocrinas (Figura 2D) exhibieron estructuras compactas con un contraste RI distinto, consistente con su papel secretor de hormonas en el epitelio intestinal 36,37,38. Estos resultados demuestran la capacidad de las imágenes HT sin etiquetas para resolver la composición celular y la microarquitectura de los sIO con resolución subcelular. Este enfoque de imágenes no invasivo y de alta resolución proporciona una herramienta avanzada para estudiar la organización estructural y las características funcionales de los organoides intestinales, lo que facilita la evaluación cuantitativa en tiempo real de la diferenciación epitelial y la heterogeneidad celular.

Para evaluar los cambios morfológicos inducidos por fármacos, los organoides fueron tratados con cisplatino, un agente quimioterapéutico conocido por desencadenar apoptosis y alteración estructural30. Los tomogramas RI 3D reconstruidos permitieron la visualización de alta resolución de la morfología de los organoides, revelando claras diferencias estructurales entre los sIO tratados con cisplatino y vehículos a múltiples profundidades de corte óptico (Figura 3A, B).

Para cuantificar aún más estas diferencias, realizamos un análisis cuantitativo exhaustivo de los parámetros clave de los organoides, incluido el volumen, la densidad de proteínas y el contenido total de proteínas. Dada la relación lineal entre RI y densidad de proteínas en muestras biológicas39,40, calculamos la densidad de proteínas dentro de los sIO para evaluar posibles cambios de composición. Al integrar mediciones de volumen y densidad de proteínas, cuantificamos con éxito el contenido de proteína seca de los sIO, proporcionando una comprensión más profunda de la composición de los organoides y la respuesta al tratamiento farmacológico. Los resultados demostraron un mayor volumen de organoides y contenido total de proteínas, y una menor densidad de proteínas en los sIO tratados con cisplatino en comparación con el grupo tratado con vehículo a los 10 minutos después del tratamiento (Figura 3C-E).

Mientras que las imágenes 3D en un solo punto de tiempo revelaron diferencias morfológicas entre los dos grupos, las imágenes de lapso de tiempo en vivo permitieron un seguimiento continuo de los cambios celulares dinámicos, proporcionando información más profunda sobre las respuestas inducidas por fármacos. Durante un período de 24 horas, se adquirieron imágenes de lapso de tiempo cada 10 minutos (Video complementario 1, Video complementario 2) y se tomaron mediciones cuantitativas a los 10 minutos después del tratamiento y luego a intervalos de 2 horas a partir de entonces. Durante el período de 24 horas, los sIO tratados con vehículos mantuvieron la integridad estructural y exhibieron un crecimiento continuo (Figura 4A), mientras que los sIO tratados con cisplatino sufrieron un deterioro estructural progresivo (Figura 4B). En particular, los organoides tratados con cisplatino mostraron colapso de criptas, aumento de la disociación celular y contracción gradual, lo que sugiere un efecto citotóxico dependiente del tiempo.

Este enfoque de seguimiento longitudinal proporcionó una evaluación más completa de la degradación celular, capturando cambios dinámicos en tiempo real en lugar de depender de instantáneas morfológicas estáticas. Los resultados refuerzan la importancia de las imágenes en vivo en el estudio de los efectos inducidos por fármacos, particularmente en la evaluación de la progresión del daño celular y los cambios en la arquitectura del tejido a lo largo del tiempo.

El análisis cuantitativo confirmó estas tendencias. En el grupo tratado con vehículo, los sIO exhibieron un aumento gradual en el volumen y el contenido total de proteínas, consistente con el crecimiento y la proliferación normales. Por el contrario, los sIO tratados con cisplatino mostraron una reducción significativa en ambos parámetros, lo que indica una pérdida y degradación celular progresiva (Figura 4C, E). La densidad de proteínas se mantuvo relativamente estable en los sIO tratados con vehículos, lo que sugiere la preservación de la composición celular, mientras que en los sIO tratados con cisplatino, la densidad de proteínas disminuyó con el tiempo, lo que apunta a una pérdida de integridad celular y la acumulación de espacio extracelular debido a la exfoliación celular (Figura 4D).

Estos hallazgos destacan la efectividad de las imágenes de HT para proporcionar información cuantitativa de alta resolución sobre la respuesta inducida por fármacos en organoides vivos. Este enfoque de imágenes no invasivo y sin etiquetas sirve como una poderosa plataforma para el análisis de la respuesta a los fármacos en tiempo real, lo que permite una evaluación precisa y dinámica de las adaptaciones estructurales y bioquímicas en modelos de organoides.

Figura 1: Flujo de trabajo para imágenes 4D y análisis cuantitativo de organoides del intestino delgado (sIO). (A) Cultivo de organoides: los sIO maduros se introdujeron en domos de ECM y se sembraron en placas de imágenes cinco días antes de la obtención de imágenes. (B) Adquisición de imágenes 4D: imágenes de lapso de tiempo mediante holotomografía de baja coherencia. Las tres dimensiones espaciales (x, y, z) capturan detalles estructurales, mientras que la cuarta dimensión (Tiempo, t) permite el seguimiento dinámico del proceso. (C) Procesamiento de imágenes: las imágenes adquiridas se someten a una segmentación basada en el aprendizaje automático, generando máscaras para la evaluación cuantitativa. (D) Análisis cuantitativo: se miden los parámetros clave de los organoides, incluidos el volumen, la densidad de proteínas y el contenido de proteínas, para permitir el monitoreo longitudinal y el análisis comparativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Visualización de alta resolución de estructuras subcelulares en sIOs. (A) Imagen tomográfica representativa de un sIO, destacando sus estructuras subcelulares. Identificación de (B) célula de Paneth, (C) célula caliciforme y (D) célula enteroendocrina. Barra de escala: 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis estructural y cuantitativo en 3D de sIO tratados con vehículo o cisplatino. (A, B) Reconstrucciones renderizadas en 3D y cortes axiales a diferentes profundidades (z = 21 μm, 42 μm, 63 μm) de sIO tratados con vehículo y tratados con cisplatino. (C-E) Análisis cuantitativo de parámetros clave de organoides, incluido (C) volumen, (D) densidad de proteínas y (E) contenido de proteínas, sIO tratados en vehículos y cisplatino. Barra de escala: 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis cuantitativo a largo plazo de la respuesta a los fármacos en los sIO. (A,B) Imágenes de lapso de tiempo de los sIO tratados con vehículos y tratados con cisplatino, capturando los cambios morfológicos durante un período de 24 h. Se observan diferencias en la integridad estructural y la organización celular entre las dos condiciones. Barra de escala: 50 μm. Adaptado de la Ref.29. (CC BY 4.0). (C-E) Análisis cuantitativo a largo plazo de (C) volumen, (D) densidad de proteínas y (E) contenido de proteínas a lo largo del tiempo. Se trazan los cambios relativos en estos parámetros, con la línea de puntos representando el valor de referencia. Los sIO tratados con vehículos exhiben un crecimiento sostenido y estabilidad estructural, mientras que los sIO tratados con cisplatino muestran una reducción progresiva en el volumen y el contenido de proteínas, lo que indica efectos citotóxicos inducidos por fármacos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo de codificación complementario 1: Preprocesamiento de datos sin procesar. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación complementario 2: Análisis cuantitativo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de video complementario 1: Video de lapso de tiempo de organoides tratados con vehículos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de video complementario 2: Video de lapso de tiempo de organoides tratados con cisplatino. Haga clic aquí para descargar este archivo.

M.J.L., J.H.L., S.M.L. y Y.K.P. tienen intereses financieros en Tomocube Inc., una empresa que comercializa instrumentos de holotomografía e imágenes de fase cuantitativa.