Method Article

Imágenes 3D de alta resolución y análisis de aprendizaje automático sin etiquetas de organoides intestinales mediante holotomografía de baja coherencia

DOI:

10.3791/68529

⸱

August 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Stem Cell and Regenerative Biology, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2Division of Pulmonary and Allergy Medicine, Department of Internal Medicine, Chungnam National University Hospital, 3Department of Physics, KAIST, 4KAIST Institute for Health Science and Technology, KAIST, 5Tomocube Inc., 6Center for Genome Engineering, Institute for Basic Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentamos un protocolo paso a paso para imágenes tridimensionales, sin etiquetas y de alta resolución de organoides mediante holotomografía de baja coherencia. Este protocolo detalla la preparación del cultivo de organoides, la adquisición de imágenes y el análisis computacional de imágenes, lo que permite la visualización en tiempo real de la dinámica estructural y las respuestas a los fármacos en organoides vivos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las imágenes precisas y sin etiquetas de los organoides intestinales son cruciales para estudiar su morfología, dinámica de crecimiento y respuestas a los estímulos ambientales. La holotomografía (HT) proporciona una visualización tridimensional (3D) de alta resolución de organoides vivos sin necesidad de marcadores fluorescentes, lo que minimiza la fototoxicidad y preserva la integridad de la muestra. Las imágenes basadas en fases en tiempo real permiten un seguimiento continuo y sin etiquetas de los cambios estructurales y funcionales. Al utilizar el índice de refracción como contraste de imagen intrínseco, este método permite la cuantificación de propiedades biofísicas como el volumen, la densidad de proteínas y el contenido de proteínas. Los datos de imágenes se procesan aún más a través de la segmentación impulsada por el aprendizaje automático y la extracción de características para respaldar un análisis consistente y de alto rendimiento. Este protocolo detalla el flujo de trabajo experimental completo para emplear HT de baja coherencia en la investigación de organoides, que cubre la preparación de organoides, la adquisición de imágenes y el análisis de datos basado en el aprendizaje automático. Al integrar la segmentación computacional y las evaluaciones cuantitativas, este enfoque permite una evaluación imparcial de las propiedades clave de los organoides, incluida la viabilidad, la organización estructural y la respuesta a los fármacos. La capacidad de capturar cambios morfológicos en tiempo real con resolución subcelular hace que este protocolo sea altamente aplicable a estudios basados en organoides en medicina regenerativa, modelado de enfermedades y detección farmacéutica. La metodología paso a paso descrita aquí facilita la reproducibilidad y la amplia adaptación a través de diferentes sistemas de organoides.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los organoides son versiones tridimensionales (3D) miniaturizadas de órganos cultivados a partir de células madre, capaces de recapitular características estructurales y funcionales clave de órganos reales in vitro1. Los investigadores han desarrollado sistemas de organoides para una amplia gama de tejidos, incluidos el intestino, el cerebro, los pulmones, el hígado y el riñón, cada uno de los cuales demuestra la arquitectura autoorganizada y la diversidad de tipos celulares que recuerdan a su contraparte in vivo . Al reflejar la arquitectura de los órganos nativos y la complejidad multicelular, los organoides sirven como poderosos sistemas modelo para estudiar el desarrollo humano, la regeneración de tejidosy los mecanismos de la enfermedad. Se han convertido en herramientas fundamentales para el modelado de enfermedades y el descubrimiento de fármacos, lo que permite a los investigadores explorar las vías de la enfermedad y probar nuevas terapias en tejidos 3D específicos del paciente en el laboratorio2. En particular, los organoides también son prometedores en la medicina regenerativa3: los tejidos derivados de organoides se pueden injertar in vivo para reparar el daño, como se demostró con los organoides intestinales y hepáticos, lo que subraya su potencial para restaurar la función de los órganos4. Esta versatilidad hace que los organoides sean indispensables en la investigación biomédica moderna y la medicina personalizada.

Dada su composición multicelular y complejidad estructural 3D, capturar y analizar la dinámica de los organoides es crucial. Sin embargo, las técnicas de imagen convencionales enfrentan limitaciones significativas en la resolución de estructuras y dinámicas de organoides, a menudo produciendo instantáneas 2D que no representan su estado fisiológico completo5.

La microscopía de campo claro es un método no invasivo ampliamente utilizado para capturar organoides. Monitorea convenientemente el crecimiento y la morfología, pero proporciona un contraste limitado en muestras 3D sin teñir. Además, carece de seccionamiento óptico, lo que resulta en una mala resolución de las estructuras internas. Los organoides parecen en gran parte transparentes, lo que dificulta la detección de características finas debajo de la superficie6. El contraste de fase mejora la visibilidad al convertir los cambios de fase en diferencias de intensidad, revelando la arquitectura general (por ejemplo, un lumen central) sin manchas. A pesar de su utilidad para la observación en tiempo real, el contraste de fase sufre de artefactos de halo, baja resolución y profundidad de penetración limitada, lo que lo hace menos efectivo paraorganoides más gruesos.

El corte en serie seguido de tinción de hematoxilina y eosina (H&E) e inmunotinción basada en anticuerpos se usa ampliamente para analizar la microestructura de organoides y la composición celular8. Las técnicas mejoradas de procesamiento de tejidos, como la inclusión de parafina fijada en formol (FFPE) y la criosección, mejoran la preservación de la morfología, y la FFPE ofrece resultados superiores9. La incorporación de organoides en hidrogeles como la agarosa y la centrifugación alinean varias muestras en una sola sección, lo que mejora la eficiencia del análisis. Las secciones teñidas con H&E de organoides tumorales derivados de pacientes reflejan la histología tumoral original, mientras que la tinción de inmunofluorescencia destaca marcadores como CK8 para la identificación celular10. Sin embargo, estas técnicas no pueden monitorear organoides vivos y pueden introducir artefactos como arrugas o deformaciones del tejido durante el corte.

La microscopía de fluorescencia confocal se usa ampliamente para la obtención de imágenes de organoides, produciendo secciones ópticas de alta resolución (submicrométricas) que permiten una visualización detallada de la arquitectura de los organoides y la composición celular11,12. Sin embargo, las imágenes confocales de organoides 3D generalmente se limitan a capas superficiales (hasta 100 μm de profundidad) y pueden llevar mucho tiempo y ser fototóxicas debido a la iluminación láser de escaneo puntual13. La microscopía de fluorescencia de hoja de luz (LSFM) supera algunas de estas limitaciones al iluminar solo el plano de imagen, logrando imágenes volumétricas rápidas de organoides completos con un fotoblanqueo y fototoxicidad mínimos14,15; sin embargo, esta técnica a menudo requiere la limpieza del tejido para obtener imágenes óptimas de muestras gruesas. Además, la profundidad de las imágenes LSFM está restringida por la dispersión de la luz y los desajustes del índice de refracción (RI), que pueden mitigarse mediante óptica adaptativa, imágenes multivista y longitudes de onda de excitación optimizadas16. El montaje de muestras también introduce deformaciones estructurales, mientras que los grandes conjuntos de datos 3D plantean desafíos computacionales en el almacenamiento y el análisis. Los avances recientes, incluidas las técnicas mejoradas de etiquetado genético, los nuevos reactivos de limpieza, la óptica adaptativa y el análisis de imágenes impulsado por IA, están abordando estas limitaciones, lo que hace que LSFM sea cada vez más factible para la investigación de organoides7.

A pesar de estos avances, las técnicas de imágenes de fluorescencia 3D plantean varios desafíos para el monitoreo a largo plazo de organoides vivos. En primer lugar, el uso del marcaje fluorescente introduce efectos fototóxicos y perturba los procesos biológicos, lo que plantea desafíos para estudios prolongados de imágenes en vivo17. En segundo lugar, el marcaje basado en anticuerpos sufre de una penetración limitada debido a las barreras de difusión dentro de las estructuras densas de los organoides, lo que requiere métodos avanzados de permeabilización y limpieza de tejidos, que tardan más de 10 días de incubación para el uso de anticuerpos primeros y secundarios18. En tercer lugar, la transfección y la expresión estable de proteínas fluorescentes en organoides siguen siendo ineficientes, ya que los enfoques convencionales de administración de genes luchan con entornos 3D19. En cuarto lugar, las técnicas de aclaramiento óptico, esenciales para la obtención de imágenes profundas, a menudo conducen a la pérdida de la señal de fluorescencia y la distorsión del tejido, lo que requiere protocolos de aclarado optimizados que equilibren la transparencia y la preservación de la fluorescencia20.

Para abordar estas limitaciones, se ha introducido la holotomografía (HT) como una técnica para obtener imágenes de organoides vivos no marcados con alta resolución a lo largo del tiempo. También conocida como imágenes de fase cuantitativas en 3D, HT es una modalidad de alta resolución sin etiquetas que permite la visualización cuantitativa en tiempo real de los organoides mientras preserva su estado fisiológico nativo. El principio de la TH es análogo a la tomografía computarizada de rayos X; mediante la captura de múltiples imágenes de campo óptico 2D en diversas condiciones de iluminación, la distribución RI 3D de una muestra no etiquetada se reconstruye mediante la resolución de ecuaciones de onda inversa 21,22,23. La TH se ha aplicado ampliamente en varios campos biológicos, incluida la hematología24,25, la condensación de fase en biología celular26, la microbiología27 y la histopatología28. Más recientemente, su capacidad de imágenes 3D de alta resolución y sin etiquetas se ha utilizado cada vez más para la investigación de organoides 21,22,23,29, ofreciendo un enfoque no invasivo para estudiar su dinámica estructural y funcional.

En este estudio, presentamos un protocolo detallado para el uso de TH de baja coherencia en el monitoreo a largo plazo y sin etiquetas de organoides del intestino delgado (sIO) de ratón. Este método permite la visualización en tiempo real del crecimiento de los organoides y las respuestas a los fármacos durante 24 h, al tiempo que proporciona mediciones cuantitativas del volumen de los organoides, la densidad de proteínas y el contenido de proteínas, lo que facilita un análisis riguroso y basado en datos del comportamiento de los organoides. Para investigar las alteraciones morfológicas en los organoides, tratamos las muestras con cisplatino, un agente quimioterapéutico a base de platino conocido por inducir la apoptosis mediante la formación de enlaces cruzados de ADN e inhibir la replicación celular30. Si bien las imágenes RI en 3D capturan detalles estructurales, el análisis sistemático es esencial para cuantificar la dinámica de los organoides. Para lograr esto, integramos ilastik, un kit de herramientas de segmentación basado en aprendizaje automático31 para diferenciar las regiones de organoides del fondo. Este protocolo describe el flujo de trabajo completo, incluida la preparación del cultivo de organoides, la adquisición de HT 3D, la segmentación basada en el aprendizaje automático y el análisis cuantitativo de los tomogramas RI. Al ofrecer un marco de imágenes escalable, reproducible y no invasivo, este enfoque establece un nuevo estándar para la investigación de organoides con amplias aplicaciones en el modelado de enfermedades, la medicina regenerativa y la detección de fármacos.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Los detalles relacionados con todos los materiales, instrumentos y software utilizados en este protocolo se proporcionan en la Tabla de materiales. Se pueden utilizar productos equivalentes de diferentes fabricantes como alternativas. En la Figura 1 se presenta un proceso esquemático de todo el protocolo.

1. Preparación de la muestra

  1. Preparación del medio de cultivo sIO
    1. Prepare el medio de cultivo disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esterilice el medio de cultivo filtrándolo a través de una unidad de filtro de 0,22 μm.
      NOTA: Si el medio se prepara completamente en condiciones estériles en una campana de cultivo celular y todos los componentes están preesterilizados (por ejemplo, provistos en frascos y viales estériles), es posible que no sea estrictamente necesaria la filtración a través de un filtro de 0,22 μm.
    2. Alícuota 15 ml de medio preparado en tubos de almacenamiento estériles. Caliente el medio alícuota a temperatura ambiente (15 - 25 °C) antes de usarlo en cultivo de organoides.
  2. Descongelación de existencias de sIO
    1. Descongele rápidamente el caldo de organoides congelado en 2 minutos con un baño de agua a 37 °C. Transfiera la suspensión de organoides descongelada a un tubo de microcentrífuga y centrifugue a 150 x g durante 3 min para granular los organoides.
    2. Retire con cuidado el sobrenadante para eliminar el DMSO, minimizando los posibles efectos citotóxicos.
    3. Agregue medios y matriz extracelular (ECM) fresca en una proporción de 1:4 y pipetee suavemente para garantizar una resuspensión uniforme del gránulo. Dispense 15 μL por domo en cada pocillo de una placa de 48 pocillos. Mantenga la ECM en hielo para evitar la polimerización prematura.
    4. Coloque la placa boca abajo en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante 1 h para permitir la polimerización de ECM. Después de la polimerización, agregue cuidadosamente 200 μL de medios nuevos a cada pocillo.
      NOTA: Este protocolo es compatible con varias placas de imágenes comerciales y placas de pocillos. Ajuste el volumen del medio de acuerdo con el tipo de pozo para asegurarse de que la cúpula ECM esté completamente sumergida.
  3. Transferencia de sIO
    NOTA: Los organoides tienden a adherirse a las puntas de las pipetas. Para minimizar la adherencia, humedezca previamente las puntas de pipeta con el medio.
    1. Aspirar medio gastado. Agregue 200 μL de solución de recuperación celular a cada pocillo e incube a 4 °C durante 30 min para facilitar la degradación de ECM y la recuperación de organoides.
    2. Recoja la suspensión de organoides mediante un pipeteo suave y transfiérala a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 150 x g durante 3 min, luego retirar con cuidado el sobrenadante.
    3. (Opcional) Para pasar como células individuales, realice uno de los siguientes métodos de disociación:
      1. Método enzimático: Agregue 100 μL de solución de disociación unicelular al pellet e incube a 37 °C, incubadora al 5% de CO2 durante 1-2 min. Agregue 150 μL de medio para neutralizar. Realice pipeteos o golpecitos suaves. Centrifugar a 150 x g durante 3 min y retirar el sobrenadante, dejando solo el pellet.
        NOTA: Evite la sobreincubación, ya que la exposición prolongada puede ser muy perjudicial para las células.
      2. Disociación mecánica: Vuelva a suspender el pellet en 200 μL de medio de cultivo. Con una pipeta P200, pipetea hacia arriba y hacia abajo 20x-30x para disociar mecánicamente los organoides en fragmentos más pequeños o células individuales. Centrifugar a 150 x g durante 3 min, luego aspirar el sobrenadante y retener el pellet.
    4. Agregue medios y ECM nuevos en una proporción de 1:4 y pipetee suavemente para garantizar una resuspensión uniforme del gránulo. Dispense 15 μL por domo en cada pocillo de una placa de 48 pocillos.
    5. Coloque la placa boca abajo en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante 1 h para permitir que la ECM polimerice.
    6. Después de la polimerización, agregue 200 μL de medio de cultivo fresco a cada pocillo y llene los pocillos exteriores vacíos con PBS para evitar la evaporación. Reemplace el medio de cultivo cada 2-3 días y pase los organoides semanalmente. Ajuste el intervalo de paso de acuerdo con el tamaño deseado del organoide.
  4. Tratamiento farmacológico
    1. Prepare una solución madre de cisplatino de 10 mM disolviendo 3,00 mg de cisplatino en polvo (MW ≈ 300,05 g/mol) en 1 ml de DMSO. Agite brevemente y proteja la solución de la luz usando tubos ámbar o envolviéndolos con papel de aluminio.
    2. Para preparar el medio de tratamiento, diluya el stock de cisplatino 10 mM 1:1.000 en medio de cultivo sIO completo para obtener una concentración final de 10 μM de cisplatino y 0,1% de DMSO.
    3. Para el control del vehículo, prepare DMSO al 0,1% en medio de cultivo para que coincida con la concentración final de DMSO sin cisplatino.
    4. Retire el medio gastado de los cultivos de sIO y reemplácelo suavemente con un medio que contenga cisplatino de 10 μM o un medio de control solo con DMSO.
    5. Después del tratamiento, transfiera las muestras a la incubadora del sistema de imágenes.

2. Imágenes de holotomografía de baja coherencia utilizando software operativo

  1. Preparación de muestras para imágenes
    1. Dispense 15 μL de cúpula ECM organoide en el plato de imágenes con fondo de cubreobjetos #1.5 siguiendo el procedimiento descrito en los pasos 1.3.1-1.3.4. Coloque cada cúpula en el plato lo más cerca posible del centro para obtener imágenes óptimas.
    2. Antes de la polimerización, incube a temperatura ambiente durante 1 minuto para permitir que los organoides se asienten en el fondo.
    3. Coloque la placa boca abajo en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante 1 h para polimerizar la ECM. Luego, agregue suavemente suficiente medio de cultivo para sumergir completamente los organoides.
      NOTA: Ajuste el volumen medio para asegurarse de que los organoides estén completamente sumergidos de acuerdo con el tamaño del plato de imágenes con fondo de cubreobjetos.
    4. A los 5 días después del paso, lave la muestra 2x-3x con PBS inmediatamente antes de la obtención de imágenes para eliminar los residuos y reducir los artefactos ópticos.
  2. Configuración de imágenes
    1. Encienda el controlador ambiental para mantener la viabilidad de la muestra. La unidad de control de la cámara ajusta automáticamente la temperatura a 37 °C y la concentración deCO2 al 5%.
    2. Presione el botón Door en la parte frontal del instrumento para abrir la puerta. Agregue agua para formar una capa delgada dentro del pozo de la cámara para evitar que los medios de cultivo se sequen.
    3. Coloque el plato de imágenes en un soporte de vaso adecuado, insértelo en la cámara de imágenes y asegúrelo con un pasador para evitar movimientos. Asegúrese de que el plato esté firmemente sujeto al soporte del recipiente sin inclinarlo.
    4. Cierre la puerta del instrumento con el botón Door para bloquear la interferencia de la luz externa.
    5. Inicie el software TomoStudio X e inicie sesión. Haga clic en Iniciar para abrir la ventana principal.
    6. Haga clic en Agregar proyecto en la esquina superior izquierda y asigne parámetros experimentales (por ejemplo, nombre del proyecto, tipo de medio, tipo de muestra, etc.). El panel de muestras se creará automáticamente. Asegúrese de que se asigne el tipo de medio correcto para el uso de la instancia de instancia reservada adecuada en el experimento.
    7. Haga clic en el pocillo deseado en el panel y haga clic en Crear en la parte superior para registrar los pocillos como muestras.
    8. Haga clic en Configuración de ROI en la esquina superior derecha para definir la región de interés (ROI) en el plato. Una vez configurados todos los parámetros, haga clic en Ejecutar experimento en la esquina inferior derecha para abrir la ventana de adquisición de imágenes.
    9. Haga clic en Cargar recipiente en la esquina superior derecha. Aparecerá una imagen de campo claro. Ajuste la posición Z usando los botones +Z y -Z para enfocar.
    10. En la pestaña Imagen única, ajuste el tamaño del ROI. Capture organoides dentro de un campo de visión de 160 μm x 160 μm y adquiera pilas axiales de hasta 140 μm de profundidad. Para organoides más grandes, adquiera varios tomogramas RI y cose imágenes seleccionando la casilla de verificación Imágenes de mosaico en la parte inferior.
    11. Vaya a la pestaña Imágenes de lapso de tiempo para configurar imágenes a largo plazo. Establezca la duración y el tiempo de intervalo según sea necesario. En este experimento, las imágenes de lapso de tiempo se realizaron a intervalos de 10 minutos durante un período de 24 h, y el análisis se realizó a intervalos de 2 h durante la misma duración.
    12. Haga clic en el icono Escanear para capturar la ubicación actual del ROI. Centre manualmente la cúpula ECM utilizando imágenes de campo claro. Haga clic en el botón BF para ajustar los valores de intensidad y exposición para las imágenes de campo claro.
    13. Seleccione ROI moviendo el cuadro ROI que aparece en el panel Vista previa. Una vez que se encuentre el ROI deseado, haga clic en Agregar punto en la parte inferior. Aparecerá la lista de puntos de imagen.
    14. Haga clic en Adquirir para iniciar la creación de imágenes. Se adquirirán los datos de imagen sin procesar.
  3. Adquisición de imágenes
    NOTA: Este proceso genera un archivo común de Tomocube (TCF) a partir de datos de imagen sin procesar. Los datos de imagen sin procesar deben procesarse en un archivo TCF, que contiene varios tipos de imágenes, como un tomograma RI y una proyección de intensidad máxima. El tomograma RI representa la distribución 3D RI de la muestra, y la proyección de intensidad máxima muestra el valor más alto de RI para cada posición lateral en el plano XY.
    1. Arrastre y suelte archivos de imagen RAW en el servidor de procesamiento HTX. Haga clic en Procesar para generar un archivo TCF a partir del archivo de imagen sin procesar.
    2. Para ver los tomogramas de RI generados en el archivo TCF, utilice TomoAnalysis Viewer, MATLAB o Python. Para ver un archivo TCF en MATLAB, utilice funciones como h5info y h5read. Del mismo modo, en Python, use el paquete h5py para leer archivos H5.

3. Análisis de imágenes

  1. Segmentación de imágenes basada en aprendizaje automático
    1. Exporte el archivo de imagen TCF al formato HDF5 (Archivo de codificación suplementario 1) para asegurarse de que los datos estén en un formato multidimensional compatible con ilastik.
    2. Abra ilastik y navegue hasta Archivo > nuevo proyecto. Seleccione Clasificación de píxeles en la sección Flujos de trabajo de segmentación. Guarde el archivo de proyecto en un directorio designado.
    3. Cargue el archivo HDF5 navegando a 1. Ficha Datos de entrada. Haga clic en Agregar nuevo archivo, seleccione el conjunto de datos H5 adecuado y asegúrese de que se asignan los canales de imagen correctos.
    4. Vaya a 2. Pestaña Selección de características para seleccionar características relevantes (Color/Intensidad, Borde, Textura) para optimizar la segmentación.
      NOTA: La selección de características puede variar en función del dataset y las características de la imagen. Para el análisis actual, las características seleccionadas incluyeron: Color/Intensidad (σ = 1,60), Borde (σ = 3,50) y Textura (σ = 1,60). Es posible que se requiera una optimización basada en un enfoque heurístico dependiendo de la complejidad de la imagen. Alternativamente, la función Sugerir características > Ejecutar selección de características en ilastik se puede utilizar para identificar un conjunto óptimo de parámetros.
    5. En 3. Entrenar, etiquetar regiones organoides y no organoides aplicando pinceladas de distintos colores. Para mejorar la fidelidad de la segmentación, anote cuidadosamente las regiones alrededor de los límites.
    6. Haga clic en Actualización en vivo para obtener una vista previa de los resultados de la segmentación y realizar los ajustes necesarios.
    7. Navega hasta 4. Exportación de predicciones. En la Selección de origen, elija Segmentación simple para exportar las predicciones etiquetadas. Haga clic en Exportar todo, asegurándose de que el formato de salida esté establecido en .h5 o .tiff, según los requisitos de análisis posteriores.
  2. Análisis cuantitativo de características
    NOTA: Este paso de protocolo se ejecuta en MATLAB, con cada procedimiento detallado en el archivo de codificación complementario 2.
    1. Al combinar el tomograma RI con la imagen de máscara, cree una imagen RI enmascarada que incluya solo la región organoide.
    2. Usando la imagen RI enmascarada, calcule parámetros cuantitativos como el volumen de organoides, la densidad de proteínas y el contenido de proteínas.
      1. Volumen: calcule el volumen total del organoide multiplicando el número de píxeles de la máscara segmentada por la resolución de píxeles para X, Y y Z. Calcule el número de píxeles contando todos los valores de vóxel en la matriz de máscara etiquetada con organoides, utilizando la función integrada de MATLAB Sum.
        NOTA: La resolución de píxeles está determinada por el sistema de imágenes y se puede encontrar en el grupo de atributos 3D de > de datos dentro de la estructura HDF5.
      2. Densidad de proteínas: Calcule la densidad de proteínas restando el valor de RI medio del RI medio del organoide y dividiéndolo por el incremento del índice de refracción de proteínas.
        1. RI del medio: Mida el RI del medio circundante utilizando un refractómetro antes del análisis.
        2. Valor medio de RI: Determine el RI medio del organoide promediando los valores de RI de los vóxeles ubicados dentro de la máscara del organoide.
        3. Incremento del índice de refracción de proteínas (α): Utilice una constante empírica previamente informada derivada de estudios de incremento del índice de refracción.
      3. Contenido de proteína: Calcule el contenido total de proteína multiplicando el volumen determinado en el Paso 3.2.2.1 por la densidad de proteína obtenida en el Paso 3.2.2.2.

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Results

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La Figura 1 ilustra el flujo de trabajo esquemático para imágenes 4D y análisis cuantitativo de sIO. Este protocolo permite obtener imágenes en vivo continuas y una evaluación integral de los sIO a través de un proceso de cuatro pasos: cultivo, imágenes 4D, procesamiento de imágenes y análisis cuantitativo (Figura 1D).

Después de un período de incubación de 5 días, los sIO maduros se transfirieron a placas de imágenes con fondo de cub...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La holotomografía presenta un enfoque poderoso para la obtención de imágenes de alta resolución sin etiquetas de organoides vivos, superando muchos desafíos asociados con las técnicas de imagen convencionales. En este protocolo, describimos una metodología integral para aplicar HT de baja coherencia a la investigación de sIO, lo que permite la visualización cuantitativa en tiempo real de la morfología de los organoides, la dinámica de crecimiento y las respuestas al tratamiento farmacoló...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.J.L., J.H.L., S.M.L. y Y.K.P. tienen intereses financieros en Tomocube Inc., una empresa que comercializa instrumentos de holotomografía e imágenes de fase cuantitativa.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea financiada por el gobierno coreano (MSIT) (RS-2024-00442348, RS-2024-00440577, 2022M3H4A1A02074314), el Instituto Coreano para el Avance de la Tecnología (KIAT) a través del programa de Investigación y Desarrollo Cooperativo Internacional (P0028463) y la subvención del Fondo Coreano para la Medicina Regenerativa (KFRM) financiada por el gobierno de Corea (el Ministerio de Ciencia y TIC y el Ministerio de Salud y Bienestar) (21A0101L1-12). La adquisición de datos fue realizada por M.J.L. y J.H.L., con J.H.L. responsable del procesamiento de datos y J.M.C. del análisis de datos. Todos los autores contribuyeron a la redacción del manuscrito. Extendemos nuestro agradecimiento a ChulMin Oh y Chungha Lee por sus valiosas discusiones técnicas y su ayuda con la preparación de la figura.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Placa de 48 pocillosCorning3548Plato de cultivo
Solución de recuperación celular Corning354253Degradación del matrigel 
CisplatinoSupelcoPHR1624N/A
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2650Vehículo
Tubo EppendorfCorningMCT-175-C-SN/A
Servidor de procesamiento HTXTomocube Inc., CoreaN/AServidor de procesamiento de datos
HT-X1Tomocube Inc., CoreaN/ASoftware operativo
IlastikN/AN/AKit de herramientas de segmentación basado en aprendizaje automático
Soporte de vaso de plato de imagenTomocube Inc., CoreaN/ASoporte para platos de imágenes
IntestiCult Medio de crecimiento de organoides (ratón)Tecnologías STEMCELL#06005Medio de cultivo prefabricado disponible comercialmente
MatlabMathWorksMatlab 2024aSoftware para el procesamiento de imágenes
MatrigelCorning356231ECM para organoides 3D
Millipore  Steritop  Filtro superior de botella de vacíoMerckS2GPT05RE0.22 μ M Unidad de filtro para esterilización media
Organoides intestinales de ratónTecnologías STEMCELL#70931N/A
RefractómetroATAGOR-5000Calculadora de índice de refracción
TomoDishTomocube Inc., Corea901002-02#1.5 Plato de imágenes con fondo de cubreobjetos
TomoStudio XTomocube Inc., CoreaN/ASoftware de imágenes
TripulanteGibco12604Disociación unicelular

References

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