In vivo Microscopía Confocal: Un Procedimiento Operativo Estándar para la Detección de Ácaros Demodex en el Margen del Párpado

Resumen

La microscopía confocal in vivo es una técnica de imagen prometedora con alta resolución. Presentamos el siguiente procedimiento para que los clínicos detecten Demodex en el margen del párpado in vivo.

Resumen

La infestación por ácaros Demodex puede causar inflamación del margen palpebral, y la blefaritis por Demodex podría dar lugar a una serie de afecciones oculares en casos clínicos. Numerosos médicos diagnostican la infestación ocular de los ácaros Demodex a través de la depilación de pestañas y la observación de las pestañas bajo microscopía óptica in vitro. Sin embargo, la presencia de ácaros residuales después de la extracción de pestañas y el dolor asociado con el procedimiento son limitaciones de la atención clínica estándar.

La microscopía confocal in vivo (IVCM) es una técnica de imagen no invasiva que permite a los médicos observar en detalle los ácaros Demodex en el borde del párpado sin depilación. Esta técnica permite un análisis indoloro que se puede completar en <30 min. A pesar de la creciente atención que se presta a este examen, puede ser inaccesible para muchos oftalmólogos sin una amplia experiencia. En este artículo se presenta un procedimiento operativo estándar para la visualización de ácaros Demodex en el margen del párpado con IVCM para promover una mayor adopción de este método en el trabajo clínico.

Introducción

La blefaritis es uno de los diagnósticos oftálmicos más frecuentes en la práctica clínica. La evidencia sugiere una asociación significativa entre la presencia de ácaros Demodex y la blefaritis¹. La infestación de ácaros implica tanto el daño directo causado por Demodex² como las respuestas inmunitarias desencadenadas por sus secreciones, que pueden actuar como vectores de bacterias y potencialmente contribuir al desarrollo de blefaritis³. La blefaritis por Demodex (DB) causa un espectro de eventos insatisfactorios, incluyendo daño a la córnea y a la superficie ocular¹, que impactan negativamente en la calidad de vida del paciente ^4,5.

Demodex es un ácaro parásito que habita en los folículos pilosos y las glándulas sebáceas, así como en las áreas cercanas a ellos⁶. La detección de Demodex en o alrededor de los folículos de las pestañas puede ayudar en el diagnóstico de DB⁷. El diagnóstico clínico de la DB implica la depilación de pestañas y la observación de Demodex bajo microscopía óptica. Sin embargo, se reconoce que muchos ácaros que residen en lo profundo del folículo pueden permanecer en el orificio después de la extracción de las pestañas ^8,9,10, lo que puede llevar a una subestimación del recuento de ácaros. La microscopía confocal in vivo (IVCM), una herramienta de imagen no invasiva en oftalmología, ofrece un enfoque alternativo para visualizar Demodex en o alrededor de los folículos de pestañas in vivo¹¹. Esta técnica proporciona una visión de las microestructuras de la superficie ocular y los párpados con una resolución similar a la histología¹¹. Los ácaros se pueden identificar visualmente en función de su morfología y motilidad características. Sin embargo, la MCIV puede presentar desafíos técnicos para los oftalmólogos que carecen de una amplia experiencia con esta modalidad de imagen¹².

Para facilitar la adopción de la MCIV en aplicaciones clínicas rutinarias, incluido el diagnóstico diferencial y el seguimiento de párpados sanos, así como de DB, proponemos un procedimiento operativo estándar (SOP) para la observación de ácaros Demodex en el margen del párpado. Este protocolo proporciona a los médicos un enfoque sistemático para la detección de ácaros in vivo.

Protocolo

Este protocolo se centra en el SOP utilizado para la observación de Demodex en el margen del párpado con IVCM (Figura 1). Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Oftalmológico de la Universidad Médica de Wenzhou (aprobación del IRB n.º H2023-022-K-20), y se eximió del requisito de consentimiento individual para este análisis retrospectivo debido a la naturaleza retrospectiva. Los procedimientos aquí descritos hacen referencia a las descripciones que se han reportado anteriormente 11,13,14,15,16.

Figura 1: El dispositivo de tomografía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Prepare el dispositivo y el programa

1. Encienda la computadora.
   1. Después de que aparezca el escritorio, cambie el interruptor basculante en la parte posterior del dispositivo de O a I. Busque el brillo verde del interruptor basculante que indica que el dispositivo está encendido antes de comenzar cualquier examen.
      NOTA: Encender el dispositivo antes de iniciar la computadora puede provocar una falla de conectividad.
   2. Inicie el software y establezca la configuración del programa antes del examen. En el menú Configuración , seleccione Opciones (Archivo complementario 1: Figura complementaria S1); A continuación, marque la casilla Mostrar números de imagen para mostrar el número de imagen de cada imagen. Además, marque la casilla Mostrar información sobre la salida para evitar el apagado involuntario del software.
      NOTA: La visualización de las miniaturas de las imágenes como iconos grandes facilita la observación directa de los resultados. No cambie la configuración con frecuencia.
2. Preparativos antes del examen
   1. Limpie la lente con toallitas limpiadoras de lentes. Desinfecte el reposacabezas y la mentonera con bolas de algodón empapadas en alcohol para evitar infecciones resultantes de gérmenes patógenos transmitidos por piezas sucias del dispositivo.
   2. Ajusta la mentonera. Asegúrese de que la posición horizontal de la mentonera sea correcta: presione juntas las dos palancas negras para tirar de la mentonera hacia adelante hasta que se enganche.
   3. Mueva la cámara hacia atrás. Gire el tornillo de ajuste para asegurarse de que se aleje del paciente antes del examen.
   4. Aplique una gota (aproximadamente 0,02 ml) de gel oftálmico a base de carbómero como gel de contacto en la superficie frontal de la lente del microscopio del dispositivo.
      NOTA: Asegúrese de que el gel de contacto esté libre de burbujas de aire y que solo se utilice una pequeña cantidad. Demasiado gel de contacto aplicado en la superficie frontal de la lente del microscopio del dispositivo puede fluir hacia el objetivo y adherirse a los componentes mecánicos, lo que provoca daños en el dispositivo.
   5. Retire una tapa estéril de polimetilmetacrilato (PMMA) desechable de su cubierta protectora y presione los lados de la tapa firmemente sobre la lente del microscopio del dispositivo sin tocar la superficie anterior de la tapa (Figura 2).
      NOTA: Para colocar correctamente el tapón de PMMA, asegúrese de que el gel de contacto esté en contacto con la superficie posterior del tapón sin burbujas de aire. Las tapas se almacenan en el contenedor específico para evitar daños en el paquete estéril. No use tapones con empaques dañados, ya que pueden conllevar el riesgo de infecciones durante el examen.
   6. Aplique una sola gota de sustituto de lágrimas en gel en la superficie frontal de la gorra como un puente de gel entre la tapa y el párpado (Figura 2).
      NOTA: Para evitar confusiones entre los geles, utilizamos el mismo gel oftálmico a base de carbómero para ambas aplicaciones: el sustituto de lágrimas en gel y el gel utilizado como agente entre la lente del microscopio y la tapa.
   7. Cree un nuevo archivo de paciente o seleccione un archivo de paciente existente.

Figura 2: El ajuste correcto de la aplicación de la tapa y el gel de PMMA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Preparar al paciente

NOTA: No realice este examen si la integridad de la córnea es cuestionable.

1. Para obtener la cooperación del paciente y minimizar los riesgos potenciales, explíquele lo siguiente:
   1. Asegúrele al paciente que el examen con el dispositivo es seguro aunque toque el párpado. Informar al paciente que su ojo será anestesiado con una gota de un anestésico tópico en el borde del párpado.
   2. Al comenzar el examen, pida al paciente que coloque la barbilla en la mentonera y apoye la frente contra el reposacabezas durante todo el procedimiento de examen para obtener la mejor calidad de imagen.
   3. Informe al paciente que el dispositivo se acercará a su párpado hasta que la tapa de PMMA lo toque. Asegúreles que no sentirán ningún dolor mientras el dispositivo toque su párpado, aunque sentirán el contacto con el tapón de PMMA. Pídales que le informen al médico de inmediato si sienten algún dolor durante el examen.
   4. Informar al paciente de que debe mantener la mirada fija mientras el clínico adquiere imágenes del margen del párpado para la observación del Demodex. Pídale al paciente que le informe al médico si siente alguna fatiga; Se les permitirá sentarse y descansar durante un rato antes de que continúe el examen. Se les informará una vez finalizado el examen.
2. Siga las instrucciones del envase del anestésico tópico y/o del gel ocular para evitar contraindicaciones del medicamento. Pregúntele al paciente si tiene alguna alergia para confirmar que las alergias del paciente no son contraindicaciones del anestésico tópico y/o el gel para los ojos.
   NOTA: Las reacciones alérgicas al anestésico tópico y/o al gel ocular pueden ocurrir como resultado de alergias no identificadas.
3. Aplique una gota de clorhidrato de proparacaína, un anestésico tópico, en el margen del párpado a examinar.
   NOTA: Si se produce una reacción alérgica, enjuague con solución salina inmediatamente.

3. Realizar un examen

1. Observa primero el ojo derecho. Mueva la cámara de escaneo hacia la izquierda desde el punto de vista del operador. OD se seleccionará automáticamente en la sección Configuración mediante el reconocimiento derecho-izquierdo de la cámara.
2. Mueva la cámara CCD hacia la izquierda. Gire la lente del objetivo de la cámara CCD para ajustar la imagen de la cámara CCD (la imagen de control) perpendicularmente al eje óptico de la cámara láser del escáner.
3. Iniciar un nuevo examen.
   1. Observe el cuadro de diálogo Datos de examen y, en la pestaña Datos de examen , seleccione Tomógrafo de retina de Heidelberg-Córnea en la lista desplegable Dispositivo (Archivo complementario 1: Figura complementaria S2) y observe el cuadro de diálogo Configuración del módulo de córnea que aparece.
   2. Seleccione FOV 400 de la lista desplegable Lente de campo y haga clic en Aceptar para confirmar (Archivo complementario 1: Figura complementaria S3).
   3. Espere hasta que se abra la ventana de adquisición ; Se muestran la imagen en vivo de la cámara láser de escaneo y la imagen de control. Si no se muestra la imagen de control, asegúrese de que el cable de la cámara CCD esté conectado correctamente a la cámara CCD y, a continuación, reinicie la ventana de adquisición.
4. Establezca los factores en la ventana de adquisición (Archivo complementario 1: Figura complementaria S4): seleccione 1x de la lista desplegable Factor de zoom CCD para establecer el tamaño de la imagen de control. Marque la casilla Brillo automático y la casilla Automático para controlar automáticamente el brillo de las imágenes en vivo y controlar. Sin embargo, si el control automático de brillo está desactivado, utilice el control deslizante para controlar el brillo del control y las imágenes en vivo. Compruebe que se ha seleccionado el tipo de escaneo de la sección para que se adquiera y almacene una sola imagen cada vez que se pulse el pedal.
5. Adquirir una imagen de referencia.
   1. Antes de iniciar una adquisición, desactive el control automático de brillo y mueva el control deslizante hacia la izquierda para ajustar el brillo de la imagen. Ajuste el plano focal con el pin de ajuste para que el reflejo brillante inicial se muestre en la imagen en vivo de la cámara láser de escaneo después de oscurecer, lo que indica la superficie anterior de la tapa de PMMA.
      NOTA: El microscopio permite ajustes focales de 10 μm.
   2. Haga clic en Restablecer en la sección Posición de enfoque [μm] y espere a que el valor de la posición de enfoque [μm] cambie a 0; La imagen actual se indica como imagen de referencia. Desactive el restablecimiento automático y marque la casilla Brillo automático ; El brillo de la imagen en vivo se controlará automáticamente.
   3. Si se muestran líneas discontinuas en lugar de valores en la sección Posición de enfoque [μm], o si los valores mostrados no cambian a pesar de los ajustes en el plano focal, asegúrese de que el cable de la lente del microscopio esté conectado correctamente.
      NOTA: La posición de enfoque [μm] para paquimetría muestra la posición del plano focal de la imagen que se muestra actualmente en micras. Si el plano focal se mueve posteriormente, la ubicación real del plano focal se calcula con respecto a la posición de la imagen de referencia.
6. Eleve o baje la altura de la mesa de examen para el paciente. Coloque la barbilla del paciente en la mentonera y la frente contra el reposacabezas (Figura 3A, B). Ajuste la elevación de la mentonera a través del tornillo de ajuste negro designado del dispositivo para que los párpados superiores del paciente se alineen con las marcas rojas en la columna del reposacabezas.
7. Dígale al paciente que mire hacia abajo por delante de la fuente de luz fija del puntero y que mantenga la mirada fija (Figura 3A, B).
   NOTA: El movimiento de los ojos durante la recolección de imágenes puede resultar en una mala calidad de la imagen y daños en la superficie ocular.
8. Use un hisopo de algodón para voltear el párpado superior, exponiendo completamente la raíz de la pestaña y el margen palpebral. Coloque el reflejo del rayo láser a nivel del párpado superior del paciente girando el tornillo de ajuste del dispositivo. Mueva la cámara láser de escaneo lentamente hacia el margen del párpado superior del paciente hasta que toque suavemente el centro del capuchón de PMMA verticalmente (Figura 3C). Si el paciente reporta molestias, haga una pausa y verifique la alineación de la tapa de PMMA.
   NOTA: No ejerza demasiada presión sobre el párpado del paciente. El contacto entre el capuchón de PMMA y el párpado del paciente debido a un puente de gel insuficiente, al movimiento de los ojos y la cabeza del paciente y/o a un movimiento demasiado fuerte de la cámara del operador podría lesionar la superficie ocular y el párpado.
9. Escanee cuidadosamente la raíz de la pestaña desde el lado temporal hacia el lado nasal del margen del párpado con diminutos movimientos horizontales del margen palpebral, lo que permite la evaluación de las pestañas y sus folículos. Escanee y adquiera imágenes girando la lente del microscopio del dispositivo en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario a las agujas del reloj, modifique el plano de enfoque gradualmente para observar todo el folículo y la raíz de las pestañas, y tome nota de las diferentes profundidades que se muestran en la imagen en vivo de la cámara láser de escaneo. Adquiera imágenes escaneando de seis a diez folículos pilosos de pestañas por ojo, con muestras distribuidas en las regiones temporal, media y nasal del margen del párpado.
   NOTA: Si se muestra un pequeño reflejo en la imagen en vivo de la cámara láser de escaneo y persiste al cambiar la posición del plano focal, esto puede indicar la presencia de burbujas de aire en el gel de contacto. Para resolver este problema, renueve el gel de contacto.
10. Guarde las imágenes manualmente y registre todas las imágenes sospechosas de ácaros Demodex presionando el pedal. Habilite la retroalimentación de audio del pedal para verificar que la adquisición de imágenes se haya realizado correctamente. Si no se muestran estructuras palpebrales y solo se ven capas límite altamente reflectantes en la imagen en vivo de la cámara láser de escaneo, esto puede indicar que el contacto entre el capuchón de PMMA y el margen del párpado del paciente está interrumpido. Para resolver este problema, vuelva a alinear la cámara hasta que la tapa de PMMA toque correctamente el margen del párpado del paciente.
11. Si la imagen en vivo aparece borrosa, distorsionada o no muestra la estructura del folículo piloso, estos problemas pueden indicar que el paciente está moviendo la cabeza o parpadeando. Recuérdele al paciente que se concentre en la luz de fijación para minimizar el movimiento. Si es posible, ajuste el brillo, el plano focal y la posición de escaneo para mejorar la calidad de la imagen.
12. Si es necesario ajustar la cámara láser de escaneo o si el paciente experimenta fatiga o dolor, pídale al paciente que se siente, mueva la cámara láser de escaneo hacia atrás y vuelva a ajustar la cámara. Si el paciente continúa experimentando molestias durante el examen y no muestra signos de alivio de los síntomas después del descanso, suspenda y reprograme el procedimiento para garantizar la seguridad del paciente.
13. Si un paciente es examinado varias veces a lo largo del día, almacene todas las imágenes en la misma pestaña de examen en la ventana de visualización de imágenes.
14. Examine el ojo izquierdo, mueva la cámara hacia la derecha desde el punto de vista del operador y espere a que se seleccione automáticamente el sistema operativo . Retire la tapa de PMMA del dispositivo, coloque una nueva tapa de PMMA en la lente del microscopio del dispositivo y repita los pasos anteriores.

Figura 3: Posicionamiento del paciente. (A,B) El paciente está colocado. (C) La tapa se está ajustando para tocar el párpado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Después del examen

1. Abandonar el examen; Asegúrese de que las imágenes de los folículos de pestañas estén almacenadas y que las imágenes adquiridas se muestren en la ventana de visualización de imágenes. De lo contrario, es posible que se haya producido un error en la adquisición de la imagen o que los datos no se hayan guardado. En primer lugar, descarte posibles fallos de funcionamiento del equipo, como problemas de conexión de software o fallos de los pedales. Después de solucionar el problema, explique la situación al paciente y repita el examen.
2. Pida al paciente que no se frote los ojos después del examen hasta que el efecto de la anestesia local haya disminuido.
3. Retire la tapa de PMMA del dispositivo.
4. Limpie la lente del microscopio con toallitas limpiadoras de lentes.
5. Seleccione Ordenar por tiempo de adquisición (rápido) en el cuadro de diálogo Opciones y observe las imágenes adquiridas de los folículos de las pestañas mostradas en orden desde el lado temporal hasta el nasal (Archivo suplementario 1: Figura suplementaria S5), el orden de escaneo de la raíz de la pestaña a lo largo del margen del párpado. Revise todas las imágenes, seleccione las imágenes de alta calidad para el análisis (Figura 4) y elimine las imágenes de baja calidad. Pida a un observador que evalúe las imágenes para detectar la presencia de ácaros y registre el número de folículos de pestañas con ácaros Demodex en total para cada ojo.
   NOTA: Las imágenes de alta calidad muestran una morfología clara del ácaro, y la porción del ácaro fotografiada debe ser lo más grande posible, idealmente superior a 100 μm. Si no se dispone de imágenes de alta calidad, se requiere una evaluación independiente por parte de un segundo observador. Si los resultados de los dos observadores son inconsistentes, un tercer observador debe resolver la discrepancia y establecer el resultado final para su inclusión en el informe.
6. Cree informes colocando la imagen de alta calidad desde el lado temporal hasta el lado nasal en la caja de luz del informe. De las plantillas de informes y formatos de conteo de ácaros (consulte el Archivo complementario 2), seleccione una plantilla de informe adecuada para describir los resultados en función de los hallazgos del examen.

Figura 4: Demodex en el interior del folículo de las pestañas (Imágenes: 400 μm x 400 μm). (A)Se observan tres ácaros Demodex dentro del folículo (flecha amarilla) y una sola pestaña está marcada (flecha blanca). (B) Se observan cinco ácaros Demodex dentro del folículo (flecha amarilla) y una sola pestaña (flecha blanca). Dado que los ácaros pueden migrar a diferentes profundidades, las imágenes en un solo plano focal pueden capturar porciones fragmentadas de ácaros individuales, lo que resulta en una representación morfológica incompleta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Apague el dispositivo después del trabajo todos los días

1. Después de cerrar todos los cuadros de diálogo y ventanas, cierre el software.
2. Apague la computadora.
3. Apague el dispositivo cambiando el interruptor basculante en la parte posterior del dispositivo de I a O. Para obtener un rendimiento óptimo del sistema y la seguridad de los datos, primero apague el software y luego apague el dispositivo.
   NOTA: El dispositivo no debe mantenerse encendido continuamente durante demasiado tiempo, especialmente durante más de un día completo.
4. Mantenga regularmente el sistema de alimentación ininterrumpida (SAI) conectado al equipo y garantice su correcto funcionamiento para evitar la pérdida de datos o el mal funcionamiento del dispositivo causado por cortes de energía repentinos.
5. Realice copias de seguridad periódicas, como el uso de almacenamiento conectado a la red (NAS).

Resultados

Siguiendo el POE descrito anteriormente, examinamos a los pacientes con sospecha de infestación por Demodex en 2024. Además, comparamos los datos de 2023 cuando no se había aplicado este POE. Como se muestra en la Figura 5, el número de pacientes que se sometieron a la IVCM para la detección de Demodex en 2024 es significativamente mayor que el año anterior. Este POE permite el examen de pacientes de diferentes edades, desde los 4 años hasta los 92 años.

Discusión

El ectoparásito Demodex es uno de los parásitos más comunes en los seres humanos. Estos ácaros viven en los folículos de las pestañas, las glándulas de Meibomio (MG) y las glándulas sebáceas y son transparentes, de forma alargada y miden entre 0,15 y 0,4 mm de longitud¹⁷. La IVCM realizada con el dispositivo proporciona imágenes en tiempo real de 400 μm x 400 μm con una resolución lateral de 1 μm/píxel y un aumento de 800x. A través de IVCM, se pueden adq...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Gel oftálmico a base de carbómero, Vidisic	Bausch y Lomb, Berlín, Alemania	8187195
Heidelberg Eye Explorer Software	Heidelberg Engineering GmbH, Heidelberg, Alemania	Versión 1.3.3.0
Tomógrafo de retina Heidelberg III	Heidelberg Engineering GmbH, Heidelberg, Alemania	HRT3-08398
Clorhidrato de proparacaína	Laboratorios Alcon, Fort Worth, TX, EE. UU.	8387271
TomoCap	Heidelberg Engineering GmbH, Heidelberg, Alemania	18829	Tapa de PMMA