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Germinación asimbótica y regeneración basada en explantes de hojas de la orquídea medicinal en peligro de extinción Hemipilia cucullata a partir de semillas maduras

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DOI:

10.3791/68541

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19 de septiembre de 2025

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1Zhejiang Province Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism and Regulation, College of Life Sciences and Medicine, Zhejiang Sci-Tech University, 2Laboratory of Systematic & Evolutionary Botany and Biodiversity, College of Life Sciences, Zhejiang University

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para optimizar la germinación asibiótica de semillas, el desarrollo de plántulas y el alargamiento de brotes en Hemipilia cucullata. El protocolo también permite la inducción de cuerpos similares a protocormos a partir de explantes de hojas estériles, lo que facilita la propagación in vitro eficiente para la conservación y el uso sostenible de esta orquídea medicinal en peligro de extinción.

Resumen

Hemipilia cucullata (Orchidaceae) es una orquídea terrestre ampliamente valorada por sus propiedades medicinales y atractivo ornamental, sin embargo, sus poblaciones silvestres están en peligro debido a la degradación del hábitat, la baja viabilidad de las semillas y el éxito limitado de la polinización. Para apoyar su conservación y utilización sostenible, este estudio desarrolló un protocolo optimizado para la germinación asibiótica de semillas maduras, el desarrollo de protocormos, el alargamiento de brotes y la inducción de cuerpos similares a protocormos (PLB) a partir de explantes de hojas estériles. Las semillas cultivadas en medio líquido 1/2 MS suplementado con 0,5 mg/L de NAA mostraron una tasa de germinación de 72 ± 6%, significativamente mayor que el testigo (46%) y el medio sólido (31%), iniciándose la germinación aproximadamente 21 días antes en cultivo líquido. Los protocormos se subcultivaron en medio B5 que contenía 0,5 mg/L de BA, 0,2 mg/L de NAA y 100 mL/L de agua de coco, lo que condujo a una proliferación eficiente. Después de 5-6 semanas, las plántulas se transfirieron a un medio de elongación de brotes (B5 suplementado con 0,5 mg / L de BA y 1 mg / L de NAA), donde exhibieron un alargamiento robusto de los brotes y una formación de hojas saludables. Para la inducción de PLB, la tasa de inducción más alta (44,3 ± 5,1%) se logró en medio de EM que contenía BA (3 mg / L) y NAA (0,2 mg / L). Este protocolo integral y reproducible puede ser una plataforma eficaz para la propagación a gran escala y la conservación ex situ de H. cucullata, ofreciendo un valioso apoyo para los esfuerzos de recuperación de esta orquídea en peligro de extinción.

Introducción

Hemipilia cucullata (L.) Y.Tang, H.Peng & T.Yukawa, comúnmente conocida como orquídea neottiana cuculada, es una orquídea terrestre silvestre nativa de la templada Eurasia y está ampliamente distribuida desde Polonia hasta Japón1. Inicialmente clasificada en el género Neottianthe, esta especie fue reasignada recientemente al género Hemipilia, sección Neottianthe, según la evidencia molecular2. La planta crece a partir de tubérculos subterráneos y alcanza hasta 30 cm de altura, produciendo flores rosadas o de color rojo púrpura dispuestas en una espiga unilateral. Debido a la forma elegante y la atractiva coloración de sus flores, posee un importante valor ornamental. Además, toda la planta es reconocida como una hierba medicinal en varios países, donde se utiliza ampliamente para diversos fines terapéuticos, incluido el tratamiento de afecciones cardíacas, la mejora de la circulación sanguínea, el alivio de hematomas y la promoción de la curación de fracturas 3,4. Estudios fitoquímicos recientes han identificado varias antocianinas en esta especie, como la cianidina 3-oxalilglucósido, el crisantemo y la cianina, que poseen propiedades antioxidantes y vasoprotectoras y pueden contribuir a sus efectos medicinales 5,6.

Actualmente, las poblaciones silvestres de H. cucullata enfrentan amenazas por la pérdida de hábitat y las perturbaciones ambientales, lo que lleva a una severa disminución de la población y, en algunas áreas, lleva a la especie al borde de la extinción 3,7,8. Sin embargo, la conservación de esta especie es particularmente desafiante debido a las dificultades en su propagación natural. En la naturaleza, H. cucullata se reproduce tanto clonal como sexualmente, pero ambos modos son ineficientes. La propagación clonal natural es lenta y poco frecuente, mientras que la reproducción sexual está limitada por el escaso éxito de la polinización y la baja viabilidad de las semillas 9,10. Además, las investigaciones de campo han revelado una estructura de edad marcadamente desequilibrada, con escasez de individuos juveniles y reclutamiento natural limitado, especialmente en condiciones de estrés antropogénico o pirogénico 7,8,11. Las semillas de H. cucullata, como muchas orquídeas, son diminutas, carecen de endospermo y requieren socios fúngicos específicos para la germinación, lo que complica aún más la regeneración natural. En consecuencia, a pesar de su amplia distribución geográfica, el tamaño de la población y la estructura de edad de las poblaciones silvestres están disminuyendo, y los riesgos de extinción local están aumentando7. Por lo tanto, el establecimiento de un método eficiente para la propagación rápida artificial es esencial tanto para la conservación de los recursos de germoplasma como para la utilización sostenible de esta especie de orquídea.

Entre las técnicas de propagación disponibles, la germinación simbiótica, que se basa en la asociación con hongos micorrícicos de orquídeas, puede simular de cerca los procesos naturales, pero a menudo es difícil de estandarizar debido a su dependencia de los socios fúngicos específicos de la especie 12,13,14. Por el contrario, la germinación asibiótica ofrece una alternativa más simple y reproducible que se utiliza ampliamente en sistemas de cultivo de tejidos de orquídeas15. Aunque se han desarrollado protocolos de germinación asibiótica y propagación rápida para varias orquídeas medicinales como Bletilla, Dendrobium y Cypripedium 16,17,18,19, todavía se requiere una optimización específica de la especie de los medios de cultivo y las condiciones de cultivo de tejidos para H. cucullata.

En este estudio, utilizamos semillas maduras de H. cucullata obtenidas a través de la polinización cruzada manual de individuos silvestres (Figura 1A) en el Monte Tianmu en el este de China (30°20′ N, 119°22′ E) para establecer y optimizar un protocolo efectivo para la germinación asimbótica de semillas, el desarrollo de plántulas y el alargamiento de brotes. Además, desarrollamos un sistema de regeneración a partir de explantes de hojas mediante inducción de PLB, contribuyendo así a la conservación y cultivo de esta orquídea medicinal en peligro de extinción.

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Protocolo

NOTA: Antes de comenzar el experimento, use equipo de protección personal, incluidos guantes, una bata de laboratorio y gafas de seguridad. Realice todos los procedimientos bajo una campana de flujo laminar para la esterilidad. Manipule el etanol y el hipoclorito de sodio con precaución y elimine los desechos según las normas de seguridad del laboratorio.

1. Esterilización de cápsulas y extracción de semillas

  1. Coloque la cápsula en un vaso de precipitados. Agregue 1-2 gotas de detergente y enjuague bien con agua del grifo para eliminar los contaminantes de la superficie.
  2. Lave la cápsula con agua corriente durante 5 minutos. Absorba el agua superficial con papel absorbente estéril.
  3. Transfiera la cápsula a un banco de trabajo estéril para una mayor desinfección.
  4. Sumerja la cápsula en etanol al 75% (v/v) durante 30 s.
  5. Esterilice la cápsula sumergiéndola en 50 ml de solución de hipoclorito de sodio al 20% (v / v) (diluida de una lejía comercial que contenga ~ 5% de cloro disponible), con la adición de 2 gotas de detergente para lavavajillas doméstico sin diluir durante 10-12 min.
  6. Enjuague la cápsula cinco veces con agua destilada estéril para eliminar el desinfectante residual.
  7. Con un bisturí estéril, retire aproximadamente 1 mm tanto del ápice como de la base (extremo del pedicelo) de la cápsula.
  8. Haga una pequeña incisión en el extremo superior de la cápsula para exponer las semillas. Coloque la cápsula en una placa de Petri estéril para la extracción de semillas.

2. Preparación del medio de cultivo

  1. Preparar 1/2 medio líquido MS: Utilizar la mitad de las concentraciones de macronutrientes del medio MS estándar, conservar todos los demás componentes como en el medio MS, añadir 20 g/L de sacarosa y ácido α-naftalenacético (NAA, 0,5 mg/L) y ajustar el pH a 5,8.
  2. Después de hervir, dispense el medio en botellas de cultivo de 500 ml inmediatamente (el número de botellas se puede ajustar de acuerdo con la escala de propagación deseada).
  3. Colocar el medio dispensado en un autoclave y esterilizar a 121 °C durante 15 min. Después de la esterilización, retire el medio del autoclave y déjelo enfriar a temperatura ambiente antes de usarlo.

3. Germinación de semillas

  1. Use fórceps estériles para dispersar uniformemente aproximadamente 500-600 semillas en cada botella de medio (preparado en el paso 2.3). Deje que las semillas absorban agua y se asienten en el fondo del medio líquido.
  2. Mantener los cultivos a 25 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y una intensidad lumínica de 36 μmol·m-2·s-1.
  3. Observe la germinación de las semillas semanalmente, registre los cambios morfológicos y tome fotografías para documentación.
  4. Después de aproximadamente 12 semanas, cuando la mayoría de las semillas hayan germinado, cuente el número de semillas germinadas y calcule la tasa de germinación. Use un asa de inoculación estéril para recolectar al azar un asa llena de medio líquido que contenga semillas. Transfiera las semillas muestreadas a una placa de Petri o portaobjetos de vidrio y observe bajo un microscopio estereoscópico.
  5. Cuente el número de semillas que han formado protobulbos como germinadas. Calcule la tasa de germinación utilizando la siguiente fórmula:
    Tasa de germinación (%) = (Número de semillas germinadas/Número total de semillas en la muestra) × 100.

4. Subcultivo y proliferación de protocormos

  1. Prepare el medio de proliferación complementando el medio B5 (3,21 g/L) con agua de coco (100 mL/L), 6-bencilaminopurina (BA, 0,5 mg/L) y NAA (0,2 mg/L). Añadir 20 g/L de sacarosa y 7,3 g/L de agar, y ajustar el pH a 5,8.
  2. Después de hervir, dispense el medio en botellas de cultivo de 150 ml inmediatamente (el número de botellas se puede ajustar de acuerdo con la escala de propagación deseada).
  3. Colocar el medio dispensado en un autoclave y esterilizar a 121 °C durante 15 min. Deje que el medio se enfríe a temperatura ambiente antes de usarlo.
  4. Transfiera asépticamente 10-15 protobulbos germinados (0,3-1 cm de tamaño) por botella al medio de cultivo preparado en el paso 4.3.
  5. Después de un período de cultivo de 5 semanas, evalúe el estado de proliferación y registre el número de protobulbos recién formados por botella.
  6. Continúe cultivando los protocormos proliferados durante 4-6 semanas adicionales para permitir el desarrollo en plántulas con ápice visible de brotes y estructuras similares a rizoides antes de la transferencia para el alargamiento de los brotes.
    NOTA: Mantener los cultivos a 25 °C, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y una intensidad lumínica de 36 μmol·m-2·s-1.

5. Alargamiento de los brotes

  1. Prepare el medio para el alargamiento de los brotes suplementando el medio B5 (3,21 g/L) con BA (0,5 mg/L) y NAA (1 mg/L). Añadir 20 g/L de sacarosa y 7,3 g/L de agar, y ajustar el pH a 5,8.
  2. Después de hervir, dispense el medio en botellas de cultivo de 150 ml (el número de botellas se puede ajustar de acuerdo con la escala de propagación deseada).
  3. Seleccione plántulas sanas (de 1-2 cm de tamaño, sin ennegrecimiento obvio o amarilleo completo) para el alargamiento de los brotes. Con pinzas esterilizadas y enfriadas, transfiera asépticamente de 8 a 12 plántulas a cada frasco de cultivo de 150 ml que contenga medio fresco preparado en el Paso 5.1. Asegúrese de que las plántulas se distribuyan uniformemente dentro de cada botella.
  4. Después de un período de alargamiento de brotes de 5 semanas, seleccione plántulas con brotes completamente desarrollados y hojas sanas para el muestreo de explantes de hojas.
    NOTA: Mantener los cultivos a 25 °C, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y una intensidad lumínica de 36 μmol·m-2·s-1.

6. Inducción de PLB a partir de explantes de hojas

  1. Prepare el medio de inducción de PLB complementando el medio basal MS (4,43 g/L) con BA (3 mg/L) y NAA (0,2 mg/L). Añadir 20 g/L de sacarosa y 7,3 g/L de agar, y ajustar el pH a 5,8.
  2. Después de hervir, dispense el medio en botellas de cultivo de 150 ml (el número de botellas se puede ajustar de acuerdo con la escala de propagación deseada).
  3. Seleccione plántulas sanas después de 5 semanas de alargamiento de brotes (paso 5.4). Extirpe las hojas estériles completamente expandidas, retire la región apical y los márgenes, y corte cada hoja en segmentos de aproximadamente 0,5 cm × 0,5 cm con un bisturí estéril en condiciones asépticas.
  4. Coloque los 10 segmentos de hojas en el medio de inducción PLB con la superficie adaxial hacia arriba, asegurando un contacto firme con la superficie del medio.
  5. Después de 5 semanas de cultivo, evalúe el número de PLB inducidos con éxito y calcule la tasa de inducción (%). Además, registre la altura promedio de los brotes (cm) y el número de brotes formados por explante.
    NOTA: Mantener los cultivos a 25 °C, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y una intensidad lumínica de 36 μmol·m-2·s-1.

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Resultados

Los pasos del protocolo presentados en este estudio representan la metodología optimizada desarrollada a través de una serie de experimentos comparativos destinados a mejorar la germinación asimbiótica de semillas, la proliferación de protocormos, el alargamiento de brotes y la inducción de PLB en H. cucullata. Por ejemplo, en la selección de PGR para promover la germinación de semillas, NAA mejora el desarrollo embrionario y la absorción de agua, mientras que BA promueve la diferenciación de yemas y la división...

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Discusión

Las cápsulas de orquídeas suelen contener numerosas semillas, a menudo superiores a diez mil, pero su germinación natural es extremadamente limitada debido a la ausencia de endospermo y su alta dependencia de asociaciones fúngicas simbióticas y señales ambientales específicas20. Por lo tanto, los protocolos de germinación asimbótica se han adoptado ampliamente para evitar estas limitaciones y permitir una propagación eficiente de las plántulas en condiciones contr...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1/2 MS Sales base con vitaminasCoolaberReferencia PM1061
6-BencilaminopurinaTecnología bioquímica Shanghai Macklin Co., Ltd.1214-39-7
Poder de agarBeijing Chembase Technology Co., Ltd.1400
Banco limpioEquipo de purificación de Suzhou Co., Ltd.SW-CJ-2G
Agua de cocoBUEN AGRICULTORhttps://e.tb.cn/h.6F8GTrHG7pif7Tj?tk=jFTyVPU3OBs
DetergenteLiby Ciencia y Tecnología6920174756784
Gamborg B5 MedianoLaboratorios de FitotecnologíaG398
Botella de vidrioMorebetter Biotechnology Co., Ltd.MBT-BL-240
Murashige y Sales basales basales de SkoogLaboratorios de FitotecnologíaM519
PipetaEppendorf3123000268
Balanza de precisiónMETTLER TOLEDO30834109
SPSSCorporación de máquinas comerciales internacionalesSoftware utilizado para pruebas de significación estadística
SacarosaReactivo químico Sinopharm Co., Ltd.20210802
TidiazurónTecnología bioquímica Shanghai Macklin Co., Ltd.51707-55-2
Ácido &alfa;-naftalenacéticoTecnología bioquímica Shanghai Macklin Co., Ltd.86-87-3

Referencias

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