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Artículo de método

Organoides córneos derivados de iPSC específicos para pacientes para investigar trastornos corneales asociados a aniridias

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DOI:

10.3791/68556

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28 de julio de 2026

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1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Izmir International Biomedicine and Genome Institute, Dokuz Eylül University, 3Department of Medical Biology and Genetics, Faculty of Medicine, Dokuz Eylül University

En este artículo

Resumen

Describimos un protocolo para generar organoides corneanos a partir de iPSCs derivados de pacientes con aniridia, creando un modelo específico para cada paciente para estudiar trastornos corneales. Estos organoides imitan características estructurales y funcionales clave, proporcionando una plataforma in vitro fiable para investigar mecanismos de enfermedades, probar posibles tratamientos y avanzar en enfoques regenerativos personalizados para enfermedades oculares anteriores.

Resumen

Los aniridos son un trastorno ocular congénito raro caracterizado por la ausencia parcial o total del iris, y a menudo se asocian con opacación corneal y deficiencia de células madre limbales. Las mutaciones genéticas subyacentes, que afectan principalmente al gen PAX6, interrumpen tanto el desarrollo como la función de la córnea. Las características oculares más comunes, además de los defectos del iris, son nistagmo, hipoplasia foveal, cataratas, glaucoma y queratopatía asociada a aniridias (AAK). Aunque los modelos in vivo ofrecen valiosas perspectivas sobre la patología de la aniridia, los modelos in vitro derivados de pacientes son cruciales para investigar los mecanismos de la enfermedad y evaluar posibles terapias. En este estudio, presentamos un modelo in vitro AAK utilizando células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas del paciente. Nuestro protocolo implica la diferenciación escalonada de iPSCs en células similares a epiteliales corneales dentro de organoides tridimensionales autoensamblados, que imitan el microambiente corneal nativo. Mediante la optimización de las condiciones de cultivo de diferenciación, generamos con éxito organoides corneales que albergan poblaciones celulares corneales distintas, recapitulando los atributos estructurales y funcionales clave de la córnea humana.

Introducción

La córnea es un tejido avascular y transparente que forma la capa más externa del ojo, compuesta principalmente por tres capas: una capa epitelial externa, una capa estromalical que contiene una matriz extracelular rica en colágeno poblada por queratocitos, y una capa celularendotelial 1. La córnea desempeña un papel esencial en la visión al proteger las estructuras oculares internas y refractar la luz.

Los aniridos son un trastorno panocular congénito raro causado principalmente por mutaciones heterocigotas en el gen de caja emparejada 6 (PAX6), un regulador maestro del desarrollo ocular, y se caracteriza por la ausencia parcial o total deliris 2. Además de la hipoplasia o ausencia del iris, la mayoría de los pacientes desarrollan anomalías corneales progresivas conocidas colectivamente como queratopatía asociada a aniridia (AAK), que incluyen defectos epiteliales, disfunción de células madre limbales, alteraciones estromales y opacación progresiva de la córnea, que finalmente conducen a deterioro visual. La AAK afecta aproximadamente al 78%–90% de los pacientes con aniridia, con una gravedad crecientecon el tiempo 3. Nuestro objetivo era establecer un protocolo detallado y reproducible para generar organoides corneanos a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de aniridios para modelar alteraciones corneales relevantes para la enfermedad in vitro. Aunque los modelos animales y los estudios ex vivo han proporcionado valiosas perspectivas sobre la patogénesis de aniridios, las diferencias específicas de cada especie y el acceso limitado al tejido del paciente limitan su relevancia traslacional.

Los organoides derivados de iPSC en humanos han surgido como sistemas in vitro potentes para modelar el desarrollo humano y la enfermedad 4,5. Los organoides córneos, en particular, permiten la generación de estructuras tridimensionales similares a tejidos que se asemejan más a la arquitectura corneal nativa, incluyendo la organización epitelial estratificada, las interacciones estromal-epiteliales y la deposición de matrices extracelulares, en comparación con los cultivos monocapa bidimensionales convencionales, que carecen de organización espacial, interacciones fisiológicas célula-célula y complejidad microambiental 4,5. Se han reportado varias estrategias de diferenciación, incluyendo enfoques basados en SEAM y progenitores oculares, que generan tejidos similares a la córnea a partir deiPSCs 6. Estos enfoques suelen implicar una fase inicial de inducción del linaje ocular, seguida de una especificación progresiva del tejido y selección de poblaciones heterogéneas de progenitores oculares. Crear organoides corneanos ofrece la oportunidad de estudiar diferentes tipos celulares presentes en el tejidocorneal 7,8. Además, los organoides corneanos derivados de iPSC en pacientes con aniridia permiten el estudio del trasfondo genético de la enfermedad y ofrecen una oportunidad única para estudiar aniridia.

En el protocolo actual, tanto las líneas de iPSC de tipo silvestre como las derivadas de aniridia están sometidas a una estrategia de diferenciación idéntica y multietapa, que implica exposición secuencial a la diferenciación (DM), diferenciación retiniana (RDM) y medios de diferenciación corneal (CDM) durante un periodo prolongado de cultivo de semanas. Un paso experimental crítico es la transición del cultivo adherente a las condiciones de suspensión, durante las cuales se mantienen regiones similares a la córnea seleccionadas para promover la autoorganización epitelial.

Aunque este enfoque apoya la generación reproducible de estructuras epiteliales similares a la córnea, adecuadas para la modelización comparativa de enfermedades, no recapitula completamente características complejas in vivo como la inervación neural o la organización completa del nicho limbal, que deben considerarse al evaluar la aplicabilidad del método.

En este contexto, describimos un protocolo estandarizado para generar organoides corneanos a partir de iPSCs derivados del paciente que portan mutaciones PAX6 asociadas a aniridias. Es importante destacar que la estrategia de diferenciación en sí no se modifica entre líneas de tipo salvaje y derivadas de aniridia; en cambio, los fenotipos específicos de la enfermedad emergen del trasfondo genético específico del paciente dentro de un marco experimental uniforme.

En conjunto, este método proporciona una plataforma robusta y reproducible para estudiar el desarrollo corneal y los mecanismos de enfermedades asociadas a aniridias, y puede servir como base para futuros estudios mecanicistas y traslacionales.

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Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del comité de ética. El estudio ha sido registrado en la base de datos del Registro de Células Madre Pluripotentes Humanas (hPSCreg), y las aprobaciones éticas han sido documentadas bajo el Ministerio de Enseñanza Superior, de la Investigación y la Innovación (MESRI; IE-2018-967)9. Los iPSC se designan con los códigos AAKIPSi001-A (AAK1), AAKIPSi002-A (AAK2), AAKIPSi003-A (AAK3) y WT (de donantes de salud). Además, el comité de ética de la Universidad Hacettepe ha aprobado el uso de esta investigación, como indica el número de referencia 16969557-1213. Las líneas celulares humanas utilizadas en este estudio requirieron autorización regulatoria nacional en el momento de la adquisición. La aprobación se concedió en un marco de consorcio en el que uno de los autores participó. Aunque el presente manuscrito no está directamente relacionado con ese proyecto del consorcio, los materiales biológicos utilizados fueron obtenidos y autorizados dentro de ese marco ético. Por ello, la aprobación de esta universidad fue citada adecuadamente para garantizar la total transparencia regulatoria. Todos los detalles relacionados con los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales. Todos los procedimientos experimentales se realizaron dentro de un gabinete de flujo laminar (BSL-2) para mantener un ambiente estéril. Este sistema garantiza que todos los materiales y equipos utilizados en el estudio estén adecuadamente esterilizados, minimizando así el riesgo de contaminación y garantizando la integridad de los resultados experimentales.

1. Generación de organoides corneanos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC)

  1. Mantenimiento y cultivo inicial de células madre pluripotentes humanas inducidas por pacientes de aniridia (AAK1, AAK2, AAK3)10 bajo medios condicionados libres de alimentación (Figura 1)
    1. Prepara lo siguiente con antelación: Recubre un pozo en una placa de 6 pozos con 1 mL de una solución de matriz extracelular (ECM) helada a una concentración de 0,1 mg/mL. Este procedimiento de recubrimiento debe realizarse sobre hielo, no para solidificar el ECM, y debe dejarse incubar a 37 °C durante un mínimo de 30 minutos, siguiendo las instrucciones del fabricante para asegurar una preparación adecuada del sustrato.
    2. Descongelar una alícua criopreservada de 1 x 106 hiPSC (WT, AAK1, AAK2, AAK3). No descongeles completamente las células congeladas; en su lugar, se permite que la suspensión celular congelada en el criovial se descongele hasta que aproximadamente la mitad del volumen permanezca congelada.
    3. Transfiera inmediatamente la suspensión parcialmente descongelada a 1 mL de medio de mantenimiento completo a temperatura ambiente (RT) que contenga un inhibidor de proteína quinasa asociada a Rho (ROCK) de 10 μM, pre-aliquotado en un tubo de 15 mL. No uses ninguna pipeta durante la transferencia.
    4. Centrifuga a 300 x g durante 5 minutos y descarta el sobrenadante.
    5. Luego resuspende las células en 1 mL de medio de mantenimiento completo que contenga un inhibidor de ROCK de 10 μM.
    6. Determina la densidad celular con exclusión de azul de tripán. Cuenta las células usando un hemocitómetro tras la tinción de viabilidad con azul de tripán. Brevemente, mezcla 20 μL de suspensión de celda 1:1 con 20 μL de azul tripán al 0,4%, seguido de la adición de 60 μL de PBS, resultando en una dilución final 1:5 de la suspensión original de celdas. De esta mezcla, carga 10 μL en la cámara del hemocitómetro. Contar las células viables (azul tripán-negativo) en cuatro grandes cuadrados. Calcula el número medio de celdas por cuadrado y multiplícala por 5 (factor de dilución por suspensión de celdas) y 10.000 para determinar la concentración final de la celda (células/mL).
      Celdas/mL = (Recuento medio de celdas por cuadrado) x 5 x 104
    7. Siembra las células sobre un pozo ECM prerecubierto en una placa de 6 pozos, asegurando una densidad celular de 2 x 104 células/cm2 por pozo.
    8. Observa la morfología y la unión celular usando microscopía de contraste de fase a una ampliación de 10x. Luego, incubar las placas de 6 pozos a 37 °C con un 5% de CO₂ para asegurar condiciones óptimas de crecimiento.
      NOTA: El inhibidor de ROCK solo debe usarse durante la noche durante la expulsión o descongelación de las células. Durante los cambios diarios de medio, añade el medio suavemente a lo largo de la pared del pozo. Evita calentar el medio de mantenimiento completo en un baño maria; en su lugar, equilibra el medio a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de usarlo.
  2. Fase de diferenciación espontánea (Día 0 – 2)
    1. Prepara el medio de diferenciación (DM) mezclando lo siguiente: Reemplazo sérico KnockOut al 8% (KSR), 1x aminoácidos no esenciales (NEAA), 1x Glutamax, 1x Penicilina-Estreptomicina y Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F-12).
    2. Una vez que los cultivos de hiPSC alcanzan aproximadamente el 70%–80% de confluencia, para inducir la diferenciaciónespontánea 8, aspirar suavemente y descartar completamente el medio, luego reemplazarlo diariamente por 1 mL de DM fresco por pozo hasta el día 3, cuando se inicia la fase de diferenciación retiniana según el calendario experimental.
  3. Fase de diferenciación retiniana (Día 3 – 47)
    NOTA: El medio de diferenciación retiniana se utiliza durante períodos prolongados para permitir la formación de poblaciones heterogéneas de progenitores oculares.
    1. Prepara el medio de diferenciación retiniana (RDM) mezclando lo siguiente: 8% KSR, 1x NEAA, 1x Glutamax, 2% B27, 1x Penicilina-Estreptomicina y DMEM/F-12.
    2. Tras 2 días de diferenciación espontánea, refresca el medio de cultivo diariamente aspirando cuidadosamente el medio de DM y sustituyéndolo por 1 mL de medio RDM fresco por pozo. Continúa así durante un total de 30 días.
      NOTA: Se espera un aumento significativo en la densidad celular durante este periodo de 30 días. Es esencial realizar observaciones microscópicas de la densidad celular en diferentes áreas de cada pozo. Para evitar el levantamiento celular, hay que evitar lavarse y tener cuidado durante los cambios de medio. Añade el material a través de la pared del pozo. Equilibra el medio en RT durante 15 minutos antes de usarlo.
    3. Para el día 32, las células alcanzan un estado aparente de confluencia y forman agregados 2,5D multicapa. En esta etapa, inicia la transición al cultivo en suspensión raspando suavemente todo el pozo usando una punta de pipeta de 1000 μL. Durante este proceso, fragmenta la capa celular en pequeños grupos.
      NOTA: Aunque todas las células se liberan de la superficie de cultivo, los agregados 2,5D multicapa se recogen y transfieren preferentemente a cultivo en suspensión (Figura suplementaria 1), ya que su enriquecimiento favorece un autoensamblaje más rápido y la formación de organoides más grandes en comparación con células individuales o fragmentos monocapa.
    4. Inmediatamente después del raspado, recoge los grupos celulares resultantes y transfiere a placas de cultivo de 6 pozos de baja unión que contienen RDM para establecer las condiciones de cultivo en suspensión.
    5. Mantener las células en cultivo en suspensión durante 15 días adicionales, con reemplazo diario del medio usando 2 mL de RDM fresco por pozo. Durante los dos primeros días de cultivo en suspensión, evitar el cambio de medio para evitar la pérdida de pequeños grupos celulares. Durante el cultivo en suspensión, las células se autoorganizan gradualmente y dan lugar a estructuras 3D, transparentes, similares a la córnea, monitorizadas regularmente mediante microscopía de contraste de fase a aumentos 4x y 10x.
  4. Fase de diferenciación corneal (Día 48 – 90)
    1. Prepara el medio de diferenciación corneal (CDM) mezclando lo siguiente: 8% KOSR, 1x NEAA, 1x Glutamax, 1x N2-MAX, 1x Insulina-Transferrina-Selenio, 5 ng/mL FGF2, 10 ng/mL EGF y DMEM/F-12.
    2. Tras los primeros 15 días (del día 32 al día 47) de cultivo de suspensión en placas de baja fijación (37 °C, 5% CO₂), se sustituye el RDM por CDM manteniendo los agregados bajo condiciones de suspensión en el día 47. Renova el CDM día sí y día no con 2 mL por pozo, asegurando que los organoides estén siempre completamente sumergidos en el medio de cultivo. Durante este periodo, emergen progresivamente estructuras primordiales corneales (CP) transparentes y en forma de burbuja.
    3. Continuar el cultivo en suspensión en CDM hasta el día 90, permitiendo una mayor maduración y segregación espacial de regiones de CP transparentes a partir de compartimentos de tejido más opacos.
    4. En el Día 90, separar mecánicamente las regiones transparentes de la PC de los compartimentos de tejido más opacos utilizando pinzas y pinzas esterilizadas cuando se prefieran análisis posteriores específicos para la CP.
      NOTA: El aislamiento mecánico de las regiones CP se realiza cuando los análisis requieren específicamente estructuras enriquecidas con CP. Si otros compartimentos tisulares o la arquitectura general de organoides son de interés, los organoides pueden mantenerse intactos para preservar la heterogeneidad estructural.
    5. Continúa el cultivo en suspensión en CDM para estructuras CP aisladas o organoides intactos, dependiendo del objetivo experimental.

2. Caracterización de organoides corneales

  1. Evaluación morfológica y estructural de organoides
    1. Monitoriza regularmente los organoides de córnea usando microscopía de campo claro a aumentos 4x y 10x. Evalúa el tamaño, la transparencia y la morfología general en los puntos temporales definidos y documenta los cambios estructurales mediante la adquisición de imágenes.
  2. Caracterización basada en inmunofluorescencia
    1. Fijación organoide corneal
      1. Prepara soluciones de 4% de PFA y 30% de sacarosa antes de fijarlas. Toma el organoide de córnea del cultivo con una cuchara autoclavada. Transfiere el organoide al PFA al 4% en un tubo de 1,5 mL e incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente.
      2. Tras la incubación, descarta cuidadosamente el PFA del tubo sin dañar el organoide corneano. Añade 1 mL de solución de sacarosa al 30% al tubo y colócala a 4 °C. Después de 24 horas, preparar y etiquetar tubos de 5 mL y nitrógeno líquido para la fijación de OCT.
      3. Descarta cuidadosamente la solución de sacarosa del tubo. Transfiere el organoide al scooper estéril. Con una pipeta de 20 μL, retira cuidadosamente el exceso de solución de sacarosa del organoide.
      4. Vierte OCT en la tapa de tubo de 5 mL y coloca el organoide en el OCT. Usa otra cuchara estéril para transferir el organoide a la cápsula que contiene OCT.
      5. Añade OCT para cubrir la superficie del organoide corneano. Introduce los globos en el OCT con una aguja para obtener secciones claras del organoide.
      6. Cierra la tapa de los tubos de 5 mL y usa pinzas para sumergirlo en el nitrógeno líquido. Guarda las muestras a -20 °C hasta la sección.
      7. Seccionarlas a 5 μm de espesor usando un criostato y también almacenarlas a -20 °C hasta la tinción. Mantén un grosor de sección y una orientación de tejido constantes para asegurar una tinción reproducible.
    2. Tinción IF
      1. Para preparar secciones organoides de córnea para la tinción de FI, lava las láminas 3 veces con PBS-T (0,3% Triton X-100) en RT durante 10 minutos.
      2. Limpia la lámina con papel de seda y haz un borde con bolígrafo PAP. Añade una cantidad adecuada de solución bloqueante para cubrir completamente la sección del tejido (normalmente entre 100 y 200 μL por lámina, dependiendo del límite del bolígrafo PAP) e incubarla en RT durante 1 hora.
      3. Aspira la solución bloqueante y haz un borde con el bolígrafo PAP. Añade los 150 μl de soluciones primarias de Ab (PAX6, p63, OCT3/4, NANOG, Na+/K+-ATPasa, AQP1, CK3, CK5, CK14, CK19, N-cad, KERA, COLIV, las tasas de dilución se enumeran en la Tabla de Materiales) sobre la lámina e incubala en RT durante 1 hora.
      4. Lava 2 veces con PBS-T (0,3% Triton X-100) en RT durante 10 minutos. Haz el borde otra vez con un bolígrafo PAP.
      5. Añade los 150 μl de solución secundaria de Ab (Anti Rabbit-488, Anti Mouse-594, las tasas de dilución se indican en la Tabla de Materiales) sobre el portaobjetos e incuba a RT en condiciones oscuras durante 2 horas. Lava 2 veces con PBS-T (0,3% Triton-X) en RT durante 10 minutos. Limpia las correderas y monta con solución DAPI.
      6. Para iPSCs no diferenciados, realiza bloqueos y permeabilización tras la fijación y procede con la tinción usando el mismo protocolo. Visualiza muestras teñidas usando microscopía de fluorescencia o confocal a aumentos 4x y 10x.

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Resultados

Formación de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs)

Para evaluar la talleza de las iPSC humanas utilizadas en los experimentos, realizamos imágenes de campo claro, inmunotinción y análisis qRT-PCR. Evaluamos la expresión de marcadores clave de pluripotencia, incluyendo OCT3/4, SOX2 y NANOG, que son factores clave de transcripción necesarios para el mantenimiento de la pluripotencia y la autorrenovación en células madre...

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Discusión

El análisis comparativo entre organoides de control y aquellos derivados de pacientes con aniridia revela defectos en la estratificación epitelial, deposición anormal de la matriz extracelular y expresión desregulada del genPAX6 9.

La tasa de crecimiento de los iPSC derivados de diferentes muestras de pacientes con aniridia, específicamente las líneas AAK1, AAK2 y AAK3, muestra variabilidad, lo que puede reflejar la diversidad ...

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Divulgaciones

Los autores no han revelado nada.

Agradecimientos

Este estudio está financiado por TÜBİTAK 121N276 y el Programa Conjunto Europeo sobre Enfermedades Raras, y parcialmente apoyado por la Unión Europea (Programa de Cátedra Horizon 2020 ERA, Proyecto RareBoost Grant nº: 952346). A.C.K. cuenta con el apoyo de la beca doctoral YÖK 100/2000 y las becas TÜBİTAK-BİDEB 2211A.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10 mL serological pipettesZA BioteknoLabselect SP-003-10
15 mL Conical Tubes Labselect CT-002-15A
2 mL serological pipettesLabselect Labselect SP-003-2
5 mL serological pipettesCleanteksBiofil GSP010005
50 mL Conical TubesGolden Gate CT-002-50
50 mL serological pipettesBIOFILLGSP020050
Anti Mouse 594Jackson Immuno715-585-150Rango de dilución: 1:100 - 1:800
Anti Rabbit 488 Jackson Immuno711-545-152Rango de dilución: 1:100 - 1:800
Autoclave VAPOUR-Line liteVWR chemicalsVAPOUR-Lineeco 25
B27 SupplementGIBCO12587010con vitamina A
Benchtop CentrifugeEppendorf5702
Benchtop microscope DMI1OlympusCKX41
Biological Safety Cabinets Class IIThermoSafe 2020
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA8806
CellBanker 1Worthington IndustriesLABS-20K
Coverslips 24 mm x 50 mmISOLAB280
Cryomatrix, OCTFisher Healthcare30226281
CryovialBioSigmaN403522
DAPINEOFROXX 1322
DAPINEOFROXX 15390.5 ug/mL
DMEM/F12 MediaGIBCO 31330-038
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS)Gibco141901441X
EGFGIBCOPHG0311
Ethanol 100%Sigma64-17-5
Ethanol 70%Sigma64-17-5Ethanol dilutions
Extracellular Matrix (ECM)Corning354277LDEV-free
FGF2GIBCOPHG0024
GlutaMaxGIBCO35050061
GoTaq Master MixPromegaM7123
IncubatorMemmert INCO 153 med44043
Insulin-Selenium-TransferrinGIBCO41400045
KnockOut Serum (KOSR)GIBCO10828028
Microtome RM2235LeicaRM2235
Mounting mediumabcamab104135
mTSER MediaSTEMCELL85850
Mutiwell Culture Plates (6-well)CORNING   3516
N2 SupplementR&DAR003
Non-essential amino acids (NEAA)LONZABE13-114E
P20, P200 and P1000 pipettesGilsonF167350
ParaffinVWR chemicals10048502
Paraformaldehyde Sigma-AldrichF8775
Primer Antibody Aquaporin mAbabcamab9566Rango de dilución: 1:50-1:200
Primer Antibody CK14Santa Cruz Biotechnology sc-53253Rango de dilución: 1:50-1:500
Primer Antibody CK19ProteinTech14965-1-APRango de dilución: 1:150-1:600
Primer Antibody CK3NOVUSNBP2-91997 0.1 MLRango de dilución: 1:50-1:200
Primer Antibody CK5Thermo MA517057Rango de dilución: 1:200-1:1000
Primer Antibody Collagen Type IVabcamab6586Rango de dilución: 1:100-1:500
Primer Antibody KeratocanBiossbs-11054RRango de dilución: 1:50-1:200
Primer Antibody Na/K - ATPaseSanta Cruz Biotechnologysc-21712Rango de dilución: 1:50-1:500
Primer Antibody N-Cadherinabcamab76011Rango de dilución: 1:50-1:500
Primer Antibody p63SANTACRUZ   sc-25268Rango de dilución: 1:50-1:500
Primer Antibody Pax6NovusNBP2-44576Rango de dilución: 1:50-1:200
RNA isolation kitMacherey–Nagel 740984.50
Rock Inihibitor (Y-27632)TOCRIS1254
SlidesStarFrostMBB-0302-55AAdhesive, ground
Stainless steel forceps no:5Sigma F6521-1EA
Stainless Stell Scalpel Sterile N 21Swann-Morton1033060
The OneScript Plus cDNA Synthesis Kit Applied Biological MaterialsG236
Triton-X100NEOFROXX 8500
TRIzol reagentThermo15596026
Trypan blueGIBCO15250061
Ultra low attachment (ULA) 6-well  plate Corning3471
Water bathNüveNb9

Referencias

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