El diseño y la aplicación de péptidos inhibidores para la regulación rápida a la baja in vitro de los niveles de modificaciones postraduccionales en un sitio específico

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que describe las especificaciones de diseño, los estándares de control de calidad y el sistema de verificación funcional de TAT-PIP, un péptido inhibidor de modificación postraduccional.

Resumen

Las proteínas son los principales ejecutores de las actividades vitales y están reguladas a nivel transcripcional, traduccional y de modificación postraduccional (PTM). Además, el PTM representa un mecanismo más complicado para regular las actividades de las proteínas, ya que una proteína generalmente tiene varios tipos de PTM y múltiples sitios para un PTM específico. La transfección de plásmidos o lentivirus y adenovirus podría utilizarse en el cribado inicial del sitio PTM funcionalmente importante entre todos los sitios identificados; Sin embargo, estos métodos siempre se enfrentan a retos como la baja eficiencia en la entrada de células y tejidos, los costes largos y elevados, la posible reacción inmunitaria, etc. Para abordar esto, recientemente desarrollamos y empleamos con éxito un tipo de péptido recombinado llamado TAT-PIP, péptido inhibidor de PTM conjugado con TAT. TAT-PIP consta de un módulo TAT que facilita la entrada de células y tejidos y un módulo PIP que regula específicamente a la baja el PTM en sitios específicos a través de una unión competitiva. Aquí, presentamos un protocolo que describe las especificaciones de diseño, los estándares de control de calidad y el sistema de verificación funcional de TAT-PIP. En la sección de diseño, describimos la consistencia, la longitud opcional, la especificidad y la conservación de TAT-PIP. A continuación, presentamos los requisitos de pruebas de calidad de TAT-PIP, que garantizan su eficacia y seguridad. En la aplicación de la parte TAT-PIP, introdujimos la prueba de gradiente de concentración de TAT-PIP, el proceso de incubación de las células ensayadas y la posterior detección fenotípica. En resumen, describimos un método efectivo para el cribado de sitios PTM mediante la eliminación selectiva de un sitio específico y la observación del fenotipo resultante para inferir su función. Debido a su bajo costo sintético y alta eficiencia, este método supera las limitaciones de las tecnologías existentes, como la transfección de plásmidos.

Introducción

Las proteínas son los principales ejecutores de las actividades vitales, y sus procesos de regulación biológica involucran dos aspectos centrales de la regulación de la expresión génica: la transcripción génica y la traducción del ARNm. Sin embargo, durante las últimas décadas, la modificación postraduccional (PTM) se ha convertido en otro mecanismo indispensable para regular las funciones celulares¹. La fosforilación, el PTM más conocido por los investigadores, desempeña un papel particularmente importante en las funciones fisiológicas. Por ejemplo, después de que la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) es fosforilada por la quinasa MEK en los sitios Thr202 y Tyr204, su conformación cambia, exponiendo el sitio activo, que activa las proteínas diana posteriores, como los factores de transcripción². Por el contrario, cuando el Ser9 N-terminal de GSK-3β es fosforilado por la quinasa Akt/PKB, su bolsillo de unión al sustrato se bloquea, lo que lleva a una pérdida de la actividad de la quinasa³. La ubiquitinación es otro PTM importante que regula varios procesos celulares a través de la unión covalente de moléculas de ubiquitina a proteínas sustrato. La ubiquitina contiene 7 residuos de lisina (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) y una metionina N-terminal (M1). El enlace de las cadenas de ubiquitina en diferentes sitios imparte diferentes destinos a las proteínas del sustrato. La función principal de la ubiquitinación ligada a K48 es marcar las proteínas del sustrato para su degradación por el proteasoma⁴. Por el contrario, la función principal de la ubiquitinación ligada a K63 es participar en la transducción de señales no degradativas, como la reparación del daño en el ADN, las respuestas inflamatorias y la endocitosis⁵. En los últimos años, con el rápido avance de las tecnologías proteómicas, se ha descubierto un número cada vez mayor de nuevos PTM. Más allá de la acetilación clásica, se han identificado nuevas acilaciones como la propionilación, la crotonilación y la glutarilación⁶. En el campo de las modificaciones de histonas, la lactosilación de histonas interfiere con la modificación del ARN m⁶A y la homeostasis del microambiente inmune⁷. En el campo de las modificaciones no histonas, la reducción de la crotonilación de ATP5O es un factor perjudicial importante en la regulación negativa del metabolismo de los fosfolípidos⁸.

La realización de investigaciones sobre PTM requiere avanzar sistemáticamente en el análisis del proteoma PTM⁹. Este campo abarca dos grandes direcciones de investigación: el análisis de los perfiles de PTM a nivel de todo el proteoma y la identificación exhaustiva de los sitios PTM de una proteína específica. Aunque la espectrometría de masas moderna puede identificar eficazmente varios tipos de PTM y los sitios específicos, la detección y validación de sitios funcionales clave sigue siendo un desafío científico central que restringe el progreso de la investigación. El establecimiento de estrategias eficientes de selección de sitios es el primer paso para resolver la función de los sitios regulatorios clave. Los métodos tradicionales implican la construcción de plásmidos mutantes para sitios específicos (mutaciones inactivadoras, mutaciones activadoras), su introducción en células diana mediante técnicas de transfección in vitro y la evaluación sistemática de cambios en indicadores fenotípicos como la proliferación celular, la apoptosis y el estrés oxidativo. Sin embargo, esta estrategia se enfrenta a importantes obstáculos técnicos en modelos celulares transcripcionalmente silentes, como los ovocitos y los sistemas de cultivo primario de tejidos. Aunque el sistema de transducción lentiviral o de adenovirus puede superar parcialmente el problema de la eficiencia de la transfección, su aplicación enfrenta dos desafíos: altos costos económicos y baja eficiencia de penetración de partículas virales en modelos de tejido in vitro . Mientras que la estrategia de construcción de ratones knock-in mutantes es extremadamente duradera y costosa. En general, es urgente que se desarrollen estrategias económicas y eficientes para la selección inicial de sitios PTM funcionalmente importantes.

En los últimos años, nuestro equipo ha desarrollado y empleado con éxito una técnica rápida de regulación negativa de PTM llamada TAT-PIP, péptido inhibidor de PTM conjugado con TAT, basado en la inhibición competitiva de polipéptidos. Su principal ventaja es su universalidad y alta eficiencia para realizar el cribado preliminar de sitios PTM funcionalmente importantes, lo que proporciona una base crucial para análisis en profundidad de los mecanismos moleculares de los sitios PTM clave. Este estudio dilucida sistemáticamente el marco principal y el proceso de implementación de TAT-PIP, y demuestra su efectividad en la regulación del nivel de PTM en un sitio específico a través de datos experimentales representativos.

Protocolo

1. Diseño de la secuencia TAT-PIP

NOTA: TAT-PIP consta de dos partes de péptidos (Figura 1): La parte N-terminal es TAT, CYGRKKRRQRRR, que permanece sin cambios para cada TAT-PIP y puede ayudar a ingresar de manera eficiente a células cultivadas in vitro o tejidos in vivo ; la parte C-terminal es una secuencia polipeptídica alrededor del sitio PTM específico (Figura 1, generalmente lisina en el símbolo "K", resaltado en rojo) de una proteína objeto. La longitud de PIP es de aproximadamente 10-15 residuos de AA (si es más largo, el costo aumenta; si es más corto, la especificidad disminuye significativamente).

1. Optimice la secuencia de PIP a través del análisis de voladura (Figura 2).
   1. Inicie sesión en https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, haga clic en la búsqueda de blastp para secuencias de proteínas.
   2. Copie la secuencia de proteína objetivo en la ventana Entrar en la secuencia de consulta .
   3. En elegir búsqueda, seleccione la opción Bases de datos estándar . Seleccione la opción blastp (proteína-proteína BLAST) en la selección del programa. Finalmente, haga clic en el botón BLAST (Figura 2B).
   4. Seleccione los segmentos peptídicos con la máxima especificidad como PIP candidatos.
2. Realizar una comparación de homología entre humanos y ratones para el PIP final.
   1. Inicie sesión en https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, haga clic en la búsqueda de blastp para secuencias de proteínas.
   2. Copie las secuencias de la proteína de las especies humanas y de ratón y péguelas en el cuadro de secuencia de entrada.
   3. Haga clic en el botón Enviar para obtener los resultados.
   4. Seleccione un PIP con una homología del 100% entre el humano y el ratón (Figura 2C).
3. Determine la composición del TAT-PIP, que consiste en el TAT N-terminal y el PIP C-terminal.

2. Síntesis y verificación de la calidad de TAT-PIP

1. Seleccione una empresa con amplia experiencia en proyectos para garantizar una pureza de péptidos no inferior al 98% con espectrometría de masas, evitando impurezas que puedan afectar a experimentos posteriores.
   NOTA: El nivel de endotoxinas del polipéptido debe ser de ≤10 y debe estar libre de patógenos.

3. La aplicación del TAT-PIP

1. Utilice agua ultrapura libre de patógenos para disolver TAT-PIP y lograr una concentración de stock de 10 mg/mL. Dispense el caldo en tubos pequeños para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, lo que causará una desnaturalización parcial.
   NOTA: La adición de un 1% de dimetilsulfóxido (DMSO) ayudará a proteger la estructura del TAT-PIP.
2. Trate las células con TAT-PIP.
   1. Cultivo de células 293T de riñón embrionario humano en el medio de águila modificado de Dulbecco suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina/estreptomicina en condiciones de cultivo estándar (37 °C, 5% CO₂).
      NOTA: Después de la siembra, las células se cultivaron durante aproximadamente 12 h, y se realizó el tratamiento TAT-PIP cuando la confluencia alcanzó aproximadamente el 70%.
   2. Diluir el TAT disuelto a 1 mg/mL usando PBS, luego agregar directamente al medio de cultivo celular a la dosis adecuada (concentración final recomendada del medio de cultivo: 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,4 mg/mL) durante 24 h.
   3. Lave las células con el medio de cultivo original 3 veces.
   4. Realice un análisis de Western blot para verificar el grado de regulación a la baja del PTM.
      NOTA: Según la experiencia y los resultados experimentales posteriores, la concentración final óptima de TAT-PIP es de 0,1 mg/mL.

4. Western blot

1. Preparar muestras de proteínas celulares.
   1. Lave las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 3 veces, agregue 200 μL de tampón de lisis de ensayo de radioinmunoprecipitación fuerte (RIPA) (con fluoruro de fenilmetilsulfonilo [PMSF] inhibidor de la proteasa agregado) en el pellet celular e incube durante 5 minutos para la lisis preliminar, raspe con un raspador celular.
   2. Sonicar la mezcla con una trituradora ultrasónica a una intensidad de energía del 12% durante 5 s.
   3. Enfriar el lisado celular en hielo durante 30 min y centrifugar a 13400 g a 4 °C durante 10 min.
   4. Transfiera el sobrenadante que contiene proteínas a un tubo de centrífuga preenfriado de 1,5 mL. Añadir 1/4 de volumen de tampón de muestra 5x al sobrenadante (concentración final 1x).
   5. Agite la mezcla, caliéntela a 95 °C durante 5 minutos en un termostato seco y enfríe con hielo durante 2 minutos.
   6. Mida la concentración total de proteínas utilizando un ensayo de Bradford en un Nanodrop.
2. Realizar electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE).
   1. Utilice un gel resolutivo al 12% y un gel apilador al 4% para la SDS-PAGE.
   2. Pipetear las muestras de proteína en los pocillos de acuerdo con el volumen especificado.
   3. Encienda el aparato de electroforesis y primero haga funcionar a 80 V, 300 mA durante 30 minutos para alinear las bandas en la interfaz entre los geles de apilamiento y resolución. A continuación, ejecute a 120 V, 300 mA durante 45 minutos para resolver las proteínas.
   4. Transfiera las proteínas del gel a la membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando un aparato de transferencia rápida.
3. Realizar el bloqueo, la incubación de anticuerpos y la visualización.
   1. Bloquear la membrana de PVDF en leche desnatada al 5% en solución salina tamponada con Tris que contenga 0,1% de Tween 20 (TBST) e incubar a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
   2. Incubar la membrana con el anticuerpo primario diluido 1:1000 en leche desnatada al 5%/PBST durante la noche a 4 °C en un rotador.
   3. Lave la membrana tres veces con TBST (10 min cada una).
   4. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario diluido 1:1000 en leche desnatada al 5%/TBST a RT durante 1 h.
   5. Lave la membrana tres veces con TBST (10 min cada una).
   6. Exponga la membrana en una serie temporal (5 s, 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, 120 s) para obtener la imagen óptima bajo un dispositivo de quimioluminiscencia electrogenerada (ECL).

5. Validación funcional de TAT-PIP en células cultivadas in vitro

1. Detectar los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) celulares.
   1. Coloque 293 células T a una densidad óptima de 1 x 10⁵ células/pocillo en una placa de cultivo de 24 pocillos.
   2. Trate las células con el péptido inhibidor de la crotonilación (THCIP) de la lisina 116 conjugada con TAT (0,1 mg/ml) durante 24 h y, a continuación, lave las células con PBS.
   3. Incubar las células con 10 μM de diacetato de dicloro-dihidro-fluoresceína (DCFH-DA) en DMEM sin suero a 37 °C en la oscuridad durante 20 min.
   4. Capture imágenes con un microscopio de fluorescencia invertida y mida la intensidad de la fluorescencia con la función Medir de ImageJ.
      NOTA: Se utilizó el juego de filtros FITC, con un filtro de emisión de 465-495 nm, un espejo dicroico de 505A y un segundo filtro de emisión de 512-550 nm.
2. Ensayo de proliferación celular
   1. Siembre células 293T a una densidad óptima de 1 x 10⁵ células por pocillo en una placa de cultivo de 24 pocillos.
   2. Agregue 10 μL de reactivo CCK-8 a cada pocillo.
   3. Incubar las células a 37 °C durante 2 h.
   4. Registre la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas y reste la señal de fondo de los pocillos en blanco (medio + CCK-8).
   5. Normalice los datos para calcular la viabilidad de la celda.
3. Detección de niveles celulares de ATP
   1. Lisar las células con un tampón de lisis. Centrifugar el lisado a 12.000 × g durante 5 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante para su posterior análisis.
   2. Diluya la solución estándar de ATP con el tampón de lisis para crear un gradiente de concentración de 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM y 5 μM.
   3. Agregue 20 μL de solución de detección de ATP a cada pocillo que contenga el sobrenadante celular o el patrón de ATP.
   4. Mida inmediatamente la señal luminiscente con un lector de microplacas.
      1. Haga clic en Diseño de placa, seleccione la plantilla de placa correspondiente en Cambiar plantilla de placa para configurar muestras (estándares y muestras).
      2. A continuación, haga clic en Protocolo a la izquierda, elija el botón Quimioluminiscencia y, a continuación, haga clic en Iniciar para iniciar la detección.
   5. Genere una curva estándar a partir de las señales luminiscentes de los patrones de ATP y utilícela para cuantificar la concentración de ATP en el sobrenadante celular.

Resultados

Este estudio describe una estrategia que utiliza TAT-PIP para regular a la baja el nivel de PTM de una proteína diana en un sitio específico en función de la inhibición competitiva. En un ejemplo típico, el TAT-PIP aquí se renombra específicamente como THCIP. Consta de dos módulos funcionales: (1), el péptido penetrante en las células N-terminal TAT (CYGRKKRRQRRR), que permite que el THCIP penetre en las células; (2) la secuencia C-terminal alrededor de K116 de H3, AIHAKRVTIMPKD, que compite específicamente con el H3 end...

Discusión

En este protocolo, los siguientes pasos son críticos. En primer lugar, el diseño de TAT-PIP aborda la especificidad del péptido. En segundo lugar, optimizar la aplicación y la concentración final; La concentración optimizada debe probarse cuidadosamente para lograr una eliminación eficiente y rápida. En tercer lugar, para verificar el efecto del TAT-PIP, se recomiendan múltiples experimentos en lugar de confiar en un solo experimento para confirmar sus efectos adicionales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistema automático de imagen multifuncional	Tanon	4600	El exposímetro identifica y visualiza las bandas de proteínas objetivo mediante la detección de las señales de fluorescencia o quimioluminiscencia en la membrana después del tratamiento de revelado.
Kit de recuento celular-8	GLPBIO	GK10001	Basado en la correlación entre la viabilidad metabólica celular y el número de células, este método evalúa la capacidad proliferativa de las células midiendo la capacidad de reducción de las células a los reactivos CCK-8
s Águila Modificada' El medio de	Gibco	11995065	Dulbecco (DMEM) es un medio basal ampliamente utilizado para apoyar el crecimiento de una amplia gama de células de mamíferos.
Sustrato quimioluminiscente ECL	ECL Biosharp	BL520B	generan señales de luz a través de reacciones de quimioluminiscencia que permiten la detección de proteínas o ácidos nucleicos específicos.
Aparato de electroforesis	Tanon	EPS600	La función principal del aparato de electroforesis es separar y analizar macromoléculas biológicas ‌
Kit de ensayo de ATP mejorado	Beyotime	S0027	El kit puede detectar eficazmente el nivel de ATP de las muestras
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco	16000-044	El suero fetal bovino (FBS) proporciona nutrientes esenciales y factores de crecimiento para el mantenimiento y crecimiento celular.
GenScript eBlotL1	GenScript	L00686	El dispositivo es altamente eficiente y es capaz de lograr rápidamente la transferencia de proteínas del gel de poliacrilamida a la membrana de PVDF en 15 minutos
Microscopio de fluorescencia invertida	Olympus Corporation	IX73	La microscopía de fluorescencia utiliza luz ultravioleta como fuente de luz para irradiar el objeto examinado para que emita fluorescencia, y luego observar la forma y la ubicación del objeto debajo del microscopio.
Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen NanoDrop2000	Thermo Scientific	2000	NanoDrop se utilizó para determinar la concentración de ADN o ARN
la membrana PVDF	BioRAD	1620177	Este tipo de membrana de PVDF tiene una excelente resistencia química y una alta capacidad de unión a proteínas
Kit de ensayo ROS	Beyotime	S0033S	El kit puede detectar con precisión el nivel de especies reactivas de oxígeno en las células
Péptido inhibidor de la crotonilación del conjugador TAT H3K16	Nanjing Taopu Biotechnology Co. LTD		CN218107533U Puede competir específicamente con el H3 endógeno para ser crotonilado en K16
TBST	Biosharp	BL602A	TBST puede limpiar sustancias irrelevantes en la membrana, reducir los errores experimentales y garantizar la precisión de los resultados experimentales ‌
Trituradora ultrasónica	LICHEN	LC-AUD-150P	Las funciones principales del aparato incluyen la fragmentación celular, la dispersión de partículas y la emulsificación
Varioskan LUX	Thermo Fisher	VL0000D0	Los lectores de microplacas pueden lograr análisis cuantitativos de alto rendimiento de muestras biológicas mediante la detección de las señales ópticas (como la absorbancia, la fluorescencia o la luminiscencia) de las muestras en microplacas