El diseño y la aplicación de péptidos inhibidores para la regulación rápida a la baja in vitro de los niveles de modificaciones postraduccionales en un sitio específico

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que describe las especificaciones de diseño, los estándares de control de calidad y el sistema de verificación funcional de TAT-PIP, un péptido inhibidor de modificación postraduccional.

Resumen

Las proteínas son los principales ejecutores de las actividades vitales y están reguladas a nivel transcripcional, traduccional y de modificación postraduccional (PTM). Además, el PTM representa un mecanismo más complicado para regular las actividades de las proteínas, ya que una proteína generalmente tiene varios tipos de PTM y múltiples sitios para un PTM específico. La transfección de plásmidos o lentivirus y adenovirus podría utilizarse en el cribado inicial del sitio PTM funcionalmente importante entre todos los sitios identificados; Sin embargo, estos métodos siempre se enfrentan a retos como la baja eficiencia en la entrada de células y tejidos, los costes largos y elevados, la posible reacción inmunitaria, etc. Para abordar esto, recientemente desarrollamos y empleamos con éxito un tipo de péptido recombinado llamado TAT-PIP, péptido inhibidor de PTM conjugado con TAT. TAT-PIP consta de un módulo TAT que facilita la entrada de células y tejidos y un módulo PIP que regula específicamente a la baja el PTM en sitios específicos a través de una unión competitiva. Aquí, presentamos un protocolo que describe las especificaciones de diseño, los estándares de control de calidad y el sistema de verificación funcional de TAT-PIP. En la sección de diseño, describimos la consistencia, la longitud opcional, la especificidad y la conservación de TAT-PIP. A continuación, presentamos los requisitos de pruebas de calidad de TAT-PIP, que garantizan su eficacia y seguridad. En la aplicación de la parte TAT-PIP, introdujimos la prueba de gradiente de concentración de TAT-PIP, el proceso de incubación de las células ensayadas y la posterior detección fenotípica. En resumen, describimos un método efectivo para el cribado de sitios PTM mediante la eliminación selectiva de un sitio específico y la observación del fenotipo resultante para inferir su función. Debido a su bajo costo sintético y alta eficiencia, este método supera las limitaciones de las tecnologías existentes, como la transfección de plásmidos.

Introducción

Las proteínas son los principales ejecutores de las actividades vitales, y sus procesos de regulación biológica involucran dos aspectos centrales de la regulación de la expresión génica: la transcripción génica y la traducción del ARNm. Sin embargo, durante las últimas décadas, la modificación postraduccional (PTM) se ha convertido en otro mecanismo indispensable para regular las funciones celulares¹. La fosforilación, el PTM más conocido por los investigadores, desempeña un papel particularmente importante en las funciones fisiológicas. Por ejemplo, después de que la quinasa regulada por señales extracelulares....

Protocolo

1. Diseño de la secuencia TAT-PIP

NOTA: TAT-PIP consta de dos partes de péptidos (Figura 1): La parte N-terminal es TAT, CYGRKKRRQRRR, que permanece sin cambios para cada TAT-PIP y puede ayudar a ingresar de manera eficiente a células cultivadas in vitro o tejidos in vivo ; la parte C-terminal es una secuencia polipeptídica alrededor del sitio PTM específico (Figura 1, generalmente lisina en el símbolo "K", resaltado en rojo) de una proteína objeto. La longitud de PIP es de aproximadamente 10-15 residuos de AA (si e....

Resultados

Este estudio describe una estrategia que utiliza TAT-PIP para regular a la baja el nivel de PTM de una proteína diana en un sitio específico en función de la inhibición competitiva. En un ejemplo típico, el TAT-PIP aquí se renombra específicamente como THCIP. Consta de dos módulos funcionales: (1), el péptido penetrante en las células N-terminal TAT (CYGRKKRRQRRR), que permite que el THCIP penetre en las células; (2) la secuencia C-terminal alrededor de K116 de H3, AIHAKRVTIMPKD, que compite específicamente con el H3 end.......

Discusión

En este protocolo, los siguientes pasos son críticos. En primer lugar, el diseño de TAT-PIP aborda la especificidad del péptido. En segundo lugar, optimizar la aplicación y la concentración final; La concentración optimizada debe probarse cuidadosamente para lograr una eliminación eficiente y rápida. En tercer lugar, para verificar el efecto del TAT-PIP, se recomiendan múltiples experimentos en lugar de confiar en un solo experimento para confirmar sus efectos adicionales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistema automático de imagen multifuncional	Tanon	4600	El exposímetro identifica y visualiza las bandas de proteínas objetivo mediante la detección de las señales de fluorescencia o quimioluminiscencia en la membrana después del tratamiento de revelado.
Kit de recuento celular-8	GLPBIO	GK10001	Basado en la correlación entre la viabilidad metabólica celular y el número de células, este método evalúa la capacidad proliferativa de las células midiendo la capacidad de reducción de las células a los reactivos CCK-8
s Águila Modificada' El medio de	Gibco	11995065	Dulbecco (DMEM) es un medio basal ampliamente utilizado para apoyar el crecimiento de una amplia gama de células de mamíferos.
Sustrato quimioluminiscente ECL	ECL Biosharp	BL520B	generan señales de luz a través de reacciones de quimioluminiscencia que permiten la detección de proteínas o ácidos nucleicos específicos.
Aparato de electroforesis	Tanon	EPS600	La función principal del aparato de electroforesis es separar y analizar macromoléculas biológicas ‌
Kit de ensayo de ATP mejorado	Beyotime	S0027	El kit puede detectar eficazmente el nivel de ATP de las muestras
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco	16000-044	El suero fetal bovino (FBS) proporciona nutrientes esenciales y factores de crecimiento para el mantenimiento y crecimiento celular.
GenScript eBlotL1	GenScript	L00686	El dispositivo es altamente eficiente y es capaz de lograr rápidamente la transferencia de proteínas del gel de poliacrilamida a la membrana de PVDF en 15 minutos
Microscopio de fluorescencia invertida	Olympus Corporation	IX73	La microscopía de fluorescencia utiliza luz ultravioleta como fuente de luz para irradiar el objeto examinado para que emita fluorescencia, y luego observar la forma y la ubicación del objeto debajo del microscopio.
Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen NanoDrop2000	Thermo Scientific	2000	NanoDrop se utilizó para determinar la concentración de ADN o ARN
la membrana PVDF	BioRAD	1620177	Este tipo de membrana de PVDF tiene una excelente resistencia química y una alta capacidad de unión a proteínas
Kit de ensayo ROS	Beyotime	S0033S	El kit puede detectar con precisión el nivel de especies reactivas de oxígeno en las células
Péptido inhibidor de la crotonilación del conjugador TAT H3K16	Nanjing Taopu Biotechnology Co. LTD		CN218107533U Puede competir específicamente con el H3 endógeno para ser crotonilado en K16
TBST	Biosharp	BL602A	TBST puede limpiar sustancias irrelevantes en la membrana, reducir los errores experimentales y garantizar la precisión de los resultados experimentales ‌
Trituradora ultrasónica	LICHEN	LC-AUD-150P	Las funciones principales del aparato incluyen la fragmentación celular, la dispersión de partículas y la emulsificación
Varioskan LUX	Thermo Fisher	VL0000D0	Los lectores de microplacas pueden lograr análisis cuantitativos de alto rendimiento de muestras biológicas mediante la detección de las señales ópticas (como la absorbancia, la fluorescencia o la luminiscencia) de las muestras en microplacas

águila modificado de Los sustratos de