Method Article

Metodología para el estudio del aprendizaje y la memoria en ratas juveniles utilizando anestesia con sevoflurano para evaluar la expresión de p-CREB y c-fos en el hipocampo

DOI:

10.3791/68591

⸱

September 19th, 2025

 ,  , 
1Department of Anesthesiology and SICU, Xinhua Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio investiga cómo el sevoflurano afecta la retención de la memoria y reduce la expresión de p-CREB y c-fos en las neuronas del hipocampo a través de la vía NMDAR / p-CREB / c-fos en ratas jóvenes. Los resultados muestran que el sevoflurano causa déficits de memoria a corto plazo y regula a la baja los marcadores de plasticidad sináptica, con efectos reversibles después de 3 días, independientemente de la frecuencia de dosificación.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El estudio de las deficiencias cognitivas durante el desarrollo del cerebro enfrenta desafíos debido a la naturaleza dinámica del neurodesarrollo, las limitaciones metodológicas y las barreras contextuales. Este estudio investigó un enfoque metodológico integrado para estudiar las deficiencias cognitivas en el cerebro en desarrollo causadas por el sevoflurano basado en la memoria y la expresión de p-CREB y c-fos en las neuronas del hipocampo a través de la vía de señalización NMDAR / p-CREB / c-fos en ratas jóvenes. Sesenta y cuatro ratas macho SD de 21 días de edad (peso corporal <80 g) se dividieron en cinco grupos: normal (n = 8), 60% O2 (n = 16), entrenamiento simulado (n = 8), sevoflurano de dosis única (n = 16) y sevoflurano de dosis múltiples (n = 16). Los dos grupos de sevoflurano se subagruparon en sacrificio 1 día (grupos sev1a y sev1b) y 30 días (grupos sev30a y sev30b) después del entrenamiento (n = 8 / subgrupo); Todas las demás ratas fueron sacrificadas 1 h después del entrenamiento. Se utilizó la prueba del laberinto en Y para evaluar el aprendizaje y la retención de la memoria. Se utilizó inmunohistoquímica para determinar el número de neuronas positivas para p-CREB y c-fos en las muestras de hipocampo. En comparación con el grupo 60% O2 (retención de memoria de 86,33% ± 17,52%), la memoria de las ratas en los grupos sev1a y sev1b mostró una disminución significativa (sev1a: 44,29% ± 11,26%; sev1b: 62,42% ± 7,27%; todos P<0,05), mientras que los grupos sev1b y sev30b no mostraron diferencias significativas (sev30a: 84,41% ± 14,15%; sev30b: 85,21% ± 11,61%; todos P>0,05). En comparación con el grupo O2 al 60% (c-fos: 92,83 ± 7,88; p-CREB: 72,22 ± 8,89), la expresión de p-CREB y c-fos en las neuronas del hipocampo disminuyó en el grupo sev1a (c-fos: 23,13 ± 3,28; p-CREB: 22,88 ± 5,18) y el grupo sev30 (c-fos: 23,22 ± 3,13; p-CREB: 25,58 ± 2,26) (todos P<0,05), mientras que los grupos sev30a y sev30b no mostraron diferencias significativas (todos P>0,05). El sevoflurano tiene un efecto estimulante negativo a corto plazo sobre la capacidad de mantenimiento de la memoria de ratas jóvenes sin un impacto basado en la frecuencia de dosificación. El sevoflurano disminuye la expresión de p-CREB y c-fos en las neuronas del hipocampo de ratas jóvenes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El estudio de las deficiencias cognitivas durante el desarrollo del cerebro enfrenta desafíos significativos debido a la naturaleza dinámica del neurodesarrollo, las limitaciones metodológicas y las barreras contextuales. El desarrollo cerebral implica cambios rápidos y no lineales, lo que complica la identificación de deficiencias durante las ventanas críticas 1,2. En entornos de bajos recursos, barreras como la alfabetización de los cuidadores, la diversidad lingüística y el acceso limitado a herramientas especializadas (p. ej., resonancia magnética) dificultan la detección temprana1. La variabilidad individual en la maduración cerebral dificulta distinguir las desviaciones patológicas del desarrollo típico 2,3. Condiciones como el síndrome de Down exhiben un desarrollo cortical alterado, pero el tamaño pequeño de la muestra y los escasos datos histológicos limitan los conocimientos mecanicistas4. Los trastornos del neurodesarrollo (p. ej., TEA, TDAH) a menudo coexisten con ansiedad o depresión, lo que confunde las evaluaciones cognitivas5. Los graves déficits de comunicación en algunas poblaciones restringen el uso de pruebas estandarizadas6. Esas características conducen a varios problemas de diseño de investigación. De hecho, la mayoría de los estudios utilizan diseños transversales, sin modelar el cambio dentro del individuo a lo largo del tiempo. Existe una dependencia excesiva de las poblaciones occidentales educadas (muestras "WEIRD")7. La investigación sobre el síndrome de Down adolece de pequeñas muestras cerebrales post-mortem y controles inadecuados de la misma edad4. Las herramientas de evaluación ecológica momentánea luchan por tener en cuenta las variables contextuales que afectan el rendimiento cognitivo diario5.

Las funciones más importantes en el cerebro animal y humano incluyen el aprendizaje y la memoria, que son fundamentales para el desarrollo humano y la vida en general8. El cerebro de los bebés se encuentra en la etapa de desarrollo y es vulnerable a factores externos como medicamentos y anestesia 9,10. El daño causado por los anestésicos a la función de la memoria de los bebés es un tema crucial de investigación clínica e incluso puede retrasar los tratamientos óptimos para pacientes pediátricos debido a la incapacidad de realizar la anestesia11. Las disfunciones cognitivas relacionadas con la anestesia (o disfunción cognitiva postoperatoria, DCPO) pueden tener consecuencias a largo plazo para los lactantes12. La inhalación de sevoflurano puede afectar las funciones de memoria en los bebés13,14, pero la anestesiología tradicional cree que el daño cerebral en los bebés es causado principalmente por la hipoxia cerebral durante la anestesia, especialmente en la anestesia general10. Por lo tanto, siempre que no haya hipoxia a corto o largo plazo en el cerebro, se debe reducir el riesgo de lesión del sistema nervioso central en los bebés11. Aún así, la comprensión de POCD sigue siendo subóptima. Los bebés que requieren cirugía requerirán anestesia, y un mejor conocimiento de las vías involucradas podría ayudar a diseñar estrategias de anestesia que minimicen el riesgo de DCPO.

Un estudio que involucró a pacientes adultos mayores que se sometieron a cirugías no cardíacas reveló que casi el 25% de los pacientes experimentaron POCD dentro de 1 semana después de la cirugía, y la proporción disminuyó a menos del 10% después de 3 meses, mientras que el grupo de control mostró tasas de POCD de 3.4% y 2.8%15. El estudio también indicó que la mayoría de los casos de DCP eran reversibles, y solo un pequeño número de pacientes experimentaba DCP prolongado o permanente15. En el sistema nervioso central, el glutamato es el aminoácido excitador más común16. El receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR) es crucial para la inducción y el mantenimiento de la potenciación a largo plazo (LTP) y la depresión a largo plazo (LTD)17. La investigación en ratones mostró que la plasticidad sináptica excitatoria afecta directamente el desarrollo de la función cerebral18, siendo particularmente importante la activación de NMDAR y la afluencia de calcio19,20. La actividad NMDAR mejorada tiene implicaciones significativas para inducir el crecimiento sináptico y la plasticidad19,20. Por lo tanto, un mayor grado de bloqueo de NMDAR por antagonistas de NMDAR (por ejemplo, sevoflurano) debería resultar en menores habilidades de aprendizaje y memoria21. Si bien los efectos del sevoflurano sobre el aprendizaje y la memoria en cerebros adultos no han llegado a una conclusión clara22,23, el sevoflurano se usa comúnmente para anestesia en cirugías pediátricas14. Como antagonista no competitivo de NMDAR, el sevoflurano puede afectar significativamente las funciones de aprendizaje y memoria del cerebro 11,13,14,23,24. Sin embargo, además de NMDAR, otras vías y proteínas están involucradas en el aprendizaje y la memoria, y los mecanismos de regulación de la memoria que involucran la proteína de unión al elemento de respuesta de AMPc fosforilada (p-CREB) y el gen c-fos temprano inmediato se están volviendo más claros 25,26,27, pero aún requieren una mejor comprensión para una administración óptima de anestesia en bebés y niños.

Con base en estos marcos teóricos, el presente estudio investigó un enfoque metodológico integrado que podría usarse para estudiar las deficiencias cognitivas en el cerebro en desarrollo causadas por el sevoflurano basado en la memoria y la expresión de p-CREB y c-fos en las neuronas del hipocampo a través de la vía de señalización NMDAR / p-CREB / c-fos en ratas jóvenes. Los resultados podrían ayudar a mejorar nuestra comprensión de la DCP y el deterioro de la memoria después de la anestesia general. Este estudio utilizó ratas de 21 días de edad porque acababan de ser destetadas y tenían un peso corporal y un estado fisiológico muy uniformes, correspondientes a la adolescencia temprana en humanos. Debido a su mayor neuroplasticidad y vulnerabilidad durante este período crítico de desarrollo, pueden modelar de manera eficiente los deterioros cognitivos causados por la cirugía o la anestesia en el cerebro inmaduro28,29. Esto los hace particularmente adecuados para estudiar los riesgos neurocognitivos asociados con la cirugía pediátrica y explorar posibles estrategias de intervención. El laberinto en Y es un método comúnmente utilizado para evaluar el aprendizaje y la memoria30. La inmunohistoquímica se usa comúnmente para estudiar neuronas y varias proteínas neuronales.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los protocolos de este estudio fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética del Hospital Xinhua, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai (aprobación No. XHEC-C-2016-023-2).

1. Visión general experimental de animales y agrupamiento

  1. Obtenga 64 ratas SD macho de 21 días de edad (peso corporal inferior a 80 g).
  2. Divida las ratas en cinco grupos: grupo normal (n = 8), grupo 60% O2 (n = 16), grupo de entrenamiento simulado (n = 8), grupo de dosis única de sevoflurano (n = 16) y grupo de dosis múltiples de sevoflurano (n = 16) (ver Tabla 1).
  3. Aloja a las ratas en un animalario a 20-24 °C con 50%-60% de humedad y luz natural.
  4. Proporcione alimentos y agua adecuados.
  5. Asegurar que todos los protocolos sean revisados y aprobados por el Comité de Ética.
  6. Preparar la cámara de inhalación (ver Figura complementaria S1, detallada en la sección 2.1).
  7. Grupo normal
    1. Exponga las ratas al 60% de aire durante 2 h (detallado en la sección 2.2).
    2. Realizar la prueba de laberinto en Y 1 día después de la exposición (detallada en la sección 4).
    3. Recolecte tejido después de las pruebas de comportamiento (detalladas en la sección 5).
  8. 60% Grupo O2
    1. Exponga las ratas al 60% de aire durante 2 h (detallado en la sección 2.2).
    2. Realizar la prueba de laberinto en Y 30 días después de la exposición (detallada en la sección 4).
    3. Recolecte tejido después de las pruebas de comportamiento (detalladas en la sección 5).
  9. Grupo de entrenamiento simulado
    1. Exponga las ratas al 60% de aire durante 2 h (detallado en la sección 2.2).
    2. Realice pruebas de laberinto en Y 1 día después de la exposición sin entrenamiento estructurado (las luces y las ubicaciones de las zonas de choque variaron aleatoriamente), utilizadas para controlar los efectos de la luz y los estímulos eléctricos en el aprendizaje y la memoria (detalladas en la sección 4).
    3. Recolecte tejido después de las pruebas de comportamiento (detalladas en la sección 5).
  10. Grupo de sevoflurano de dosis única (grupo sev1a)
    1. Exponer las ratas al 60% de aire + 3% de sevoflurano durante 2 h (detallado en la sección 2.2).
    2. Realizar la prueba de laberinto en Y 1 día después de la exposición (detallada en la sección 4).
    3. Recolecte tejido después de las pruebas de comportamiento (detalladas en la sección 5).
  11. Grupo de sevoflurano de dosis única (grupo sev30a)
    1. Exponer las ratas al 60% de aire + 3% de sevoflurano durante 2 h (detallado en la sección 2.2).
    2. Realizar la prueba de laberinto en Y 30 días después de la exposición (detallada en la sección 4).
    3. Recolecte tejido después de las pruebas de comportamiento (detalladas en la sección 5).
  12. Grupo de sevoflurano en dosis repetidas (grupo sev1b)
    1. Exponer las ratas al 60% de aire + 3% de sevoflurano durante 2 h al día, durante 7 días consecutivos (detallado en la sección 2.2).
    2. Realizar la prueba de laberinto en Y 1 día después de la exposición (detallada en la sección 4).
    3. Recolecte tejido después de las pruebas de comportamiento (detalladas en la sección 5).
  13. Grupo de sevoflurano en dosis repetidas (grupo sev30b)
    1. Exponer las ratas al 60% de aire + 3% de sevoflurano durante 2 h al día, durante 7 días consecutivos (detallado en la sección 2.2).
    2. Realizar la prueba de laberinto en Y 30 días después de la exposición (detallada en la sección 4).
    3. Recolecte tejido después de las pruebas de comportamiento (detalladas en la sección 5).

2. Inhalación de sevoflurano

  1. Preparación de la cámara (ver Figura complementaria S1)
    1. Conecte el orificio a la izquierda de la caja al 60% O2/40% N2.
    2. Conecte el suministro de oxígeno al vaporizador de sevoflurano.
    3. Conecte el orificio a la derecha de la caja al analizador de gases de una máquina de anestesia.
    4. Conecte el orificio en la parte superior de la cámara a los desechos de gas.
    5. Coloque cal debajo de la malla en el fondo de la cámara y agregue algodón.
    6. Coloque la configuración en una campana extractora.
    7. Coloque una almohadilla térmica debajo de la cámara.
  2. Inhalación
    1. Encienda el suministro de oxígeno y el vaporizador de sevoflurano.
    2. Ajuste el flujo de oxígeno a 2 L / min.
    3. Cuando la concentración de sevoflurano alcanza el 3,0%, mantenga el flujo durante 30 min para estabilizar la atmósfera en la cámara.
    4. Coloque una rata en el lado de algodón de la cámara.
    5. Mantenga la rata allí de acuerdo con la agrupación (consulte el paso 1.2).
    6. Controle el color de la piel, la frecuencia respiratoria, la frecuencia cardíaca y la oximetría de pulso.
    7. Retire la rata.
    8. Deja que la rata se despierte naturalmente.
    9. Regrese la rata a su jaula.

3. Reactivos e instrumentos experimentales

  1. Preparación de reactivos
    1. Prepare 250 ml de sevoflurano disponible comercialmente para la administración de anestesia.
    2. Prepare la solución de trabajo del anticuerpo p-CREB diluyendo el anticuerpo madre 1:350.
    3. Prepare la solución de trabajo de anticuerpos c-fos diluyendo el anticuerpo madre 1:200.
    4. Ensamble el kit para la tinción inmunohistoquímica.
    5. Prepare paraformaldehído al 4%.
      1. Disolver 40 g de paraformaldehído soluble (PFA) en un recipiente de vidrio con 500 mL de agua de alta pureza, calentar y remover continuamente magnéticamente a 60-65 °C hasta formar una suspensión lechosa.
      2. Agregue gotas de 1.0 mol / L de NaOH hasta que la solución se aclare (pH = 7.0).
      3. Agregue aproximadamente 500 ml de PBS y mezcle bien en un baño de hielo o baño de agua fría.
      4. Verifique el pH nuevamente, filtre y haga un volumen de hasta 1000 ml.
      5. Almacenar a 4 °C para uso futuro.
  2. Configuración del equipo
    1. Coloque el laberinto en Y en el área de pruebas de comportamiento (consulte la Figura complementaria S2).
    2. Calibre el microscopio con un sistema de imágenes integrado para el análisis histológico.
  3. Instale el micrótomo con cuchillas nuevas para seccionar tejidos.
  4. Programe la máquina de deshidratación con el protocolo estándar de procesamiento de tejidos.
  5. Prepare la máquina de tinción con los baños de tinción secuenciales de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la máquina.
  6. Configure el aparato de perfusión.
    1. Use dos frascos de solución salina envasados en plástico, drene la solución salina por la abertura inferior y llénelos con PBS y fijador de paraformaldehído al 4%.
    2. Cuelgue las botellas, conéctelas con equipos de infusión y coloque una llave de paso de tres vías en el extremo grueso de la aguja del equipo de infusión.

4. Laberinto en Y y pruebas de aprendizaje / memoria

  1. Ensamblar el laberinto en Y
    1. Configure el laberinto en Y con tres brazos rectangulares etiquetados I, II y III, conectados por una unión triangular (consulte la Figura complementaria S2).
    2. Coloque una red eléctrica con un espacio de 1 cm en el fondo del laberinto.
    3. Coloque tiras delgadas de cobre de 2 cm en las paredes del laberinto para simular áreas peligrosas e instale luces de señal de estímulo.
  2. Definir áreas peligrosas y seguras
    1. Electrifique las regiones I, II y III a 16,000 V / m para indicar áreas peligrosas (la luz de señal se enciende cuando se electrifica).
    2. Marque las regiones no electrificadas con una luz roja para indicar áreas seguras.
    3. Defina la unión entre los brazos como un área no segura donde la rata puede recibir una descarga eléctrica.
  3. Procedimiento de entrenamiento
    1. Al comienzo del experimento, considere el área donde se encuentra la rata como el área segura.
    2. Después de 2-4 minutos, aplique electricidad al área segura, alentando a la rata a moverse hacia la zona segura.
    3. Si la rata se mueve del área segura a un área peligrosa, regresará a la zona segura bajo descarga eléctrica, mostrando una respuesta de evitación pasiva.
  4. Desarrollar la respuesta de evitación activa
    1. Después de varias sesiones de entrenamiento, encienda la luz en el área segura sin aplicar descargas eléctricas.
    2. Observe el movimiento de la rata hacia el área segura iluminada, formando un reflejo condicionado de discriminación luz-oscuridad (respuesta de evitación activa).
  5. Coloque el laberinto en Y en un área silenciosa y con poca luz para minimizar las distracciones externas.
  6. Realice la capacitación diariamente entre las 9:00 y las 11:00 a. m. y las 2:00 p. m. y las 4:00 p. m.
  7. Permita que las ratas se muevan libremente dentro del laberinto durante 5 minutos antes del experimento para ayudarlas a adaptarse al entorno del laberinto.
  8. Ajustar los parámetros de estímulo
    1. Ajuste el voltaje de estímulo (16,000 V / m) durante la prueba para asegurarse de que las ratas escapen dentro de los 10 s posteriores a recibir una descarga eléctrica.
    2. Mantenga encendida la luz de señal de área segura durante 15 segundos y luego apáguela.
    3. Comience la siguiente ronda de experimentos de choque después de un intervalo de 45 s.
  9. Secuencia de luz de señal y respuesta correcta
    1. Configure la secuencia de encendido de la luz de señalización como I → II → III → I, en un ciclo.
    2. Defina una respuesta correcta cuando la rata escape del área de inicio directamente a la zona segura iluminada dentro de los 10 s posteriores a recibir una descarga eléctrica.
  10. Considere que la rata ha alcanzado el estándar de aprendizaje si hace la respuesta de escape correcta en 8 de cada 10 ensayos consecutivos.
  11. Registre cualquier escape a un brazo sin luz como una respuesta incorrecta.
  12. Múltiples sesiones de capacitación y prueba
    1. Realice múltiples sesiones de entrenamiento y pruebas para evaluar el aprendizaje y la memoria.
    2. Registre el número de respuestas correctas e incorrectas durante un número fijo de ensayos.
    3. Modifique el área de inicio para aumentar la complejidad de la tarea.
  13. Evaluar la retención de memoria a intervalos (por ejemplo, 24 o 48 h después del entrenamiento) para evaluar la capacidad de retención de memoria de las ratas.

5. Inmunohistoquímica

  1. Anestesiar a las ratas
    1. Administrar una inyección intraperitoneal de hidrato de cloral al 10% (0,4 mL/100 g) 1 h después del entrenamiento para anestesiar a las ratas. Deseche la solución de hidrato de cloral de acuerdo con las regulaciones locales.
    2. Realizar toracotomía para exponer completamente el corazón31.
  2. Perfundir ratas anestesiadas con solución fisiológica
    1. Inserte una aguja que contenga PBS en el ventrículo izquierdo en dirección a la aorta, asegure la aguja con pinzas hemostáticas e inmediatamente corte la aurícula derecha del ratón para liberar sangre venosa.
    2. Inyecte rápidamente PBS hasta que el efluente esté limpio y el hígado y los pulmones se vean blancos.
    3. Siga con una infusión rápida y luego lenta de 500 ml de solución de formalina al 10% hasta que el cuerpo del animal se endurezca, logrando la fijación con formalina.
    4. Deseche la solución de formalina de acuerdo con las regulaciones locales.
  3. Extirpar el cerebro
    1. Abre rápidamente el cráneo32.
    2. Extirpe todo el cerebro levantándolo suavemente del cráneo y cortando los vasos sanguíneos y la médula espinal en la base, sin dañar los hemisferios (como se muestra en la Figura complementaria S3).
  4. Diseccionar el hipocampo
    1. Diseccionar el hipocampo bilateral.
      1. En el foramen occipital del ratón, corte todo el cerebro con unas tijeras.
      2. Inserte con cuidado las tijeras en diagonal en el foramen magnum para cortar el hueso parietal.
      3. Haga palanca para separar ambos lados del hueso parietal con pinzas hemostáticas.
      4. Use tijeras para cortar el nervio óptico de un lado y sondear hasta la base del cráneo.
    2. Coloque el hipocampo en una solución de formol al 10% durante 12 h.
    3. Sumerja la muestra en formol que contenga un gradiente de sacarosa (10%, 20%, 30%).
    4. Mantener durante la noche a 4 ° C hasta que el tejido de la muestra se hunda hasta el fondo.
  5. Incrustar y seccionar la muestra
    1. Incruste la muestra en parafina. Deseche la solución de formalina de acuerdo con las regulaciones locales.
    2. Seccione la muestra incrustada a 4 μm.
  6. Desparafina y rehidrate las secciones
    1. Remoje las secciones en 50 ml de xileno tres veces para desparafinar, cada vez durante 15 min.
    2. Sumerja secuencialmente en 50 ml de etanol al 100%, 90%, 70% y 50% durante 10 min cada uno.
    3. Enjuague tres veces con 50 ml de PBS 0.01 mM durante 3 minutos cada una.
  7. Recuperación de antígenos
    1. Coloque las secciones en 50 ml de tampón de citrato (PBS, pH 6,0).
    2. Calentar las secciones en una olla a presión de acero inoxidable a 120 °C. Coloque las secciones en una rejilla, completamente sumergidas en el tampón. Selle la olla, caliente y mantenga a alta presión durante 3 min.
    3. Retire la olla del fuego y deje enfriar naturalmente a temperatura ambiente antes de abrir la tapa.
    4. Enjuague las secciones en PBS (pH 7,2) durante 2 min, repitiendo 3 veces.
    5. Aplicar aproximadamente 100-200 μL de H2O2 al 3% para cubrir la sección en el portaobjetos e incubar a temperatura ambiente durante 5-10 min para eliminar la actividad peroxidasa endógena.
    6. Enjuague con PBS durante 2 min, 3 veces.
  8. Incubación de anticuerpos primarios
    1. Agregue 200 μL de anticuerpos primarios (diluidos 1:150 en 0,01 mol/L PBS) a las secciones.
    2. Incubar durante la noche a 4 ° C.
  9. Incubación secundaria de anticuerpos
    1. Enjuague las secciones en PBS durante 3 minutos, 3 veces.
    2. Incube las secciones con aproximadamente 100-200 μL de Polymer Helper para cubrir la sección del portaobjetos e incube a 37 °C durante 20 min.
    3. Enjuague las secciones en PBS 0,1 mol/L durante 2 min, 3 veces.
    4. Añadir aproximadamente 100-200 μL de IgG poliperoxidasa-anti-ratón/conejo e incubar a 37°C durante 20 min.
    5. Enjuague las secciones en PBS durante 3 minutos, 3 veces.
  10. Desarrollo del color
    1. Agregue aproximadamente 100-200 μL de la solución de diaminobenzidina (DAB) (suficiente para cubrir la sección del portaobjetos) para el desarrollo del color.
    2. Déjalo actuar durante aproximadamente 3 min.
  11. Contratinción y montaje
    1. Realice la contratinción agregando aproximadamente 100-200 μL de hematoxilina gota a gota para cubrir completamente la sección de cada portaobjetos.
  12. Deshidratar y montar las secciones
    1. Deshidratar las secciones en 50 mL de etanol al 50%, 70%, 90% y 100% durante 10 min cada una, seguido de 50 mL de xileno durante 10 min.
    2. Limpie y monte las secciones utilizando procedimientos estándar.
  13. Examen microscópico
    1. Cuente el número de neuronas positivas para p-CREB y c-fos en el hipocampo de cada grupo33,34.
    2. Examine las secciones bajo un microscopio con un aumento de 400x.
    3. Registre el número promedio de neuronas positivas en cada corte, basado en recuentos de tres secciones por animal sin superposición.
      NOTA: Todos los datos se compilaron en una hoja de cálculo de computadora. Todos los análisis se realizaron utilizando un software estadístico. Los resultados se presentaron como medias ± error estándar de la media (SEM) y se analizaron mediante ANOVA de una vía con las pruebas post hoc SNK-q y Dunnett T335. La prueba SNK-q se usa comúnmente para estudios exploratorios y es adecuada para comparaciones por pares entre medias de muestras múltiples. No se basa en hipótesis predefinidas, lo que lo hace ideal para comparar todas las medias de grupo36. La prueba Dunnett T3 se usa típicamente para estudios confirmatorios con hipótesis predefinidas. Es adecuado para comparar múltiples grupos de tratamiento con un grupo control o para comparar medias con especial significación profesional35,37. Cuando el valor p de la prueba ANOVA fue ≤ 0,05, se realizaron las pruebas post hoc por pares para determinar qué grupos eran significativamente diferentes de los demás. Los valores de p bilaterales < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utilizando los datos de este estudio como ejemplos ilustrativos, hemos mostrado los tipos de resultados que se pueden generar con este marco metodológico, incluidas imágenes representativas de inmunotinción, así como datos conductuales y moleculares de diferentes grupos. El énfasis está en presentar los resultados típicos o esperados producidos por este enfoque, en lugar de proporcionar una interpretación de su significado biológico.

Resultados de las pruebas de aprendizaje y memoria d...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio investigó cómo el sevoflurano afecta la memoria y modula la expresión de p-CREB y c-fos en las neuronas del hipocampo a través de la vía de señalización NMDAR / p-CREB / c-fos en ratas jóvenes. Los resultados sugieren que el sevoflurano tuvo un efecto estimulante negativo a corto plazo (1 h después del entrenamiento, no después de 3 días) sobre la capacidad de mantenimiento de la memoria de ratas jóvenes, sin impacto basado en la frecuencia de dosificación (dosis única o sie...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores informan que no hay intereses contrapuestos que declarar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ye Jiang y Guohui Li diseñaron el estudio. Ye Jiang y Lai Jiang recopilaron y analizaron los datos y redactaron el manuscrito. Ye Jiang y Guohui Li revisaron el manuscrito. Todos los autores revisaron y aprobaron la versión final del manuscrito para su envío. Este trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones a Guohui Li del Programa Pujiang de Shanghai (subvención no. 23PJD057).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Animales experimentales
Ratas Sprague-Dawley (SD)Laboratorios Charles River (Pekín, China)N/A21 días, varón
Comida para ratas estándarKeao Xieli Feed (Beijing, China)N/ADieta estándar para animales de laboratorio
Productos químicos y reactivos
Hidrato de cloralReactivo químico Sinopharm (Shanghái, China)80113818Anestésico para la perfusión terminal
Tampón de citrato (10x)ZSGB-BIO (Pekín, China)ZLI-9064Solución de recuperación de antígenos, pH 6.0
Etanol (100%)Reactivo químico Sinopharm (Shanghái, China)100092683Agente deshidratante para histología
Solución de tinción de hematoxilinaBaso Diagnostics Inc. (Zhuhai, China)BA-4041Contratinción para IHC
Peróxido de hidrógeno (H2O2)Reactivo químico Sinopharm (Shanghái, China)10011218Solución al 3% para bloquear la peroxidasa endógena
Bálsamo neutroSolarbio (Pekín, China)G8590Medio de montaje para diapositivas
Nitrógeno (N2)Shanghai Medical Gas Co. (Shanghái, China)N/AAlta pureza, para mezcla de gases
Oxígeno (O2)Shanghai Medical Gas Co. (Shanghái, China)N/AGrado médico, para mezcla de gases
ParafinaLeica Biosystems (Nussloch, Alemania)39601006Medio de inclusión tisular
Paraformaldehído (PFA)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA)158127Fijador para perfusión y fijación de tejidos
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Gibco (Waltham, MA, EE. UU.)70011044Solución madre 10x, pH 7,4
SevofluranoAbbVie Inc. (Norte de Chicago, IL, EE. UU.)N/AAgente anestésico por inhalación
Lima sodadaW. R. Grace and Co. (Columbia, MD, Estados Unidos)22-01-0010Absorbente de CO2 para cámara de inhalación
Hidróxido de sodio (NaOH)Reactivo químico Sinopharm (Shanghái, China)10019818Se utiliza para ajustar el pH de la solución de PFA
SacarosaSangon Biotech (Shanghái, China)A502693Se utiliza para la crioprotección del tejido cerebral
XilenoReactivo químico Sinopharm (Shanghái, China)10023418Agente de compensación para histología
anticuerpos y kits
Anticuerpo c-FosAbcam (Cambridge, Reino Unido)AB190289Anti-ratón conejo, anticuerpo primario
Kit de cromógeno DABZSGB-BIO (Pekín, China)ZLI-9018Sustrato para el desarrollo del color HRP
Anticuerpo p-CREB (Ser133)Tecnología de señalización celular (Danvers, MA, EE. UU.)9198Anti-ratón conejo, anticuerpo primario
Kit de detección de HRP de polímeroZSGB-BIO (Pekín, China)PV-9000Anticuerpo secundario y sistema de detección para IHQ
Equipo
Máquina de anestesiaCiencias de la vida RWD (Shenzhen, China)R500Para el suministro controlado de mezcla de gases
Procesador de tejidos automatizadoLeica Biosystems (Nussloch, Alemania)ASP6025Para deshidratación y limpieza automatizadas
Criostato/MicrótomoLeica Biosystems (Nussloch, Alemania)CM1950Para el corte de tejido cerebral congelado/incrustado
Sistema de microscopioOlimpo (Tokio, Japón)BX53Para la obtención de imágenes de portaobjetos IHC
Bomba de perfusiónLonger Precision Pump Co. (Baoding, China)BT100-2JBomba peristáltica para perfusión transcárdica
Vaporizador de sevofluranoCiencias de la vida RWD (Shenzhen, China)R510 CVPara un control preciso de la concentración de sevoflurano
Aparato Y-MazeMed Associates Inc. (St. Albans, VT, EE. UU.)MED-VFC-S-YCon red eléctrica y luces para evitar activamente
Software
Prisma GraphPadSoftware GraphPad (San Diego, CA, EE. UU.)Versión 9Análisis estadístico y visualización de datos
ImagenJInstitutos Nacionales de Salud (Bethesda, MD, EUA)Versión 1.53Software de análisis de imágenes para el recuento de células
Microsoft ExcelMicrosoft Corporation (Redmond, WA, EE. UU.)Oficina 365Software de hoja de cálculo para la recopilación de datos

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hadders-Algra, M. The developing brain: challenges and opportunities to promote school readiness in young children at risk of neurodevelopmental disorders in low- and middle-income countries. Front Pediatr. 10, 989518(2022).
  2. Pfeifer, J. H., Allen, N. B., Byrne, M. L., Mills, K. L. Modeling developmental change: contemporary approaches to key methodological challenges in developmental neuroimaging. Dev Cogn Neurosci. 33, 1-4 (2018).
  3. Pezzoli, P., et al. Challenges and solutions to the measurement of neurocognitive mechanisms in developmental settings. Biol Psychiatry Cogn Neurosci Neuroimaging. 8 (8), 815-821 (2023).
  4. Risgaard, K. A., Sorci, I. A., Mohan, S., Bhattacharyya, A. Meta-analysis of Down syndrome cortical development reveals underdeveloped state of the science. Front Cell Neurosci. 16, 915272(2022).
  5. Caporusso, E., et al. Current limitations in technology-based cognitive assessment for severe mental illnesses: a focus on feasibility, reliability, and ecological validity. Front Behav Neurosci. 19, 1543005(2025).
  6. Kasari, C., Brady, N., Lord, C., Tager-Flusberg, H. Assessing the minimally verbal school-aged child with autism spectrum disorder. Autism Res. 6 (6), 479-493 (2013).
  7. Hilton, M. T. Methodological challenges faced by researchers studying early neurodevelopmental outcomes in majority settings. Cambridge J Human Behav. 1 (2), 106-114 (2023).
  8. Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nat Neurosci. 20 (11), 1434-1447 (2017).
  9. Lee, J. H., Zhang, J., Wei, L., Yu, S. P. Neurodevelopmental implications of the general anesthesia in neonate and infants. Exp Neurol. 272, 50-60 (2015).
  10. Keunen, K., Sperna Weiland, N. H., de Bakker, B. S., de Vries, L. S., Stevens, M. F. Impact of surgery and anesthesia during early brain development: a perfect storm. Paediatr Anaesth. 32 (6), 697-705 (2022).
  11. McCann, M. E., et al. Neurodevelopmental outcome at 5 years of age after general anaesthesia or awake-regional anaesthesia in infancy (GAS): an international, multicentre, randomised, controlled equivalence trial. Lancet. 393 (10172), 664-677 (2019).
  12. Han, F. F., et al. Predictors and occurrence of postoperative cognitive dysfunction in children undergoing noncardiac surgery: a prospective cohort study. iBrain. 9 (2), 148-156 (2023).
  13. Chung, W., et al. Sevoflurane exposure during the neonatal period induces long-term memory impairment but not autism-like behaviors. Paediatr Anaesth. 25 (10), 1033-1045 (2015).
  14. Apai, C., Shah, R., Tran, K., Pandya Shah, S. Anesthesia and the developing brain: a review of sevoflurane-induced neurotoxicity in pediatric populations. Clin Ther. 43 (4), 762-778 (2021).
  15. Arefayne, N. R., Berhe, Y. W., van Zundert, A. A. Incidence and factors related to prolonged postoperative cognitive decline (POCD) in elderly patients following surgery and anaesthesia: a systematic review. J Multidiscip Healthc. 16, 3405-3413 (2023).
  16. Malik, A. R., Willnow, T. E. Excitatory amino acid transporters in physiology and disorders of the central nervous system. Int J Mol Sci. 20 (22), 5671(2019).
  17. Albarracin, S. L., Baldeon, M. E., Sangronis, E., Petruschina, A. C., Reyes, F. G. R. L-glutamate: a key amino acid for sensory and metabolic functions. Arch Latinoam Nutr. 66 (2), 101-112 (2016).
  18. Vyklicky, V., et al. function, and pharmacology of NMDA receptor channels. Physiol Res. 63 (Suppl 1), S191-S203 (2014).
  19. Zorumski, C. F., Izumi, Y. NMDA receptors and metaplasticity: mechanisms and possible roles in neuropsychiatric disorders. Neurosci Biobehav Rev. 36 (3), 989-1000 (2012).
  20. Lau, C. G., et al. Regulation of NMDA receptor Ca2+ signalling and synaptic plasticity. Biochem Soc Trans. 37 (Pt 6), 1369-1374 (2009).
  21. Bye, C. M., McDonald, R. J. A specific role of hippocampal NMDA receptors and Arc protein in rapid encoding of novel environmental representations and a more general long-term consolidation function. Front Behav Neurosci. 13 (8), (2019).
  22. Callaway, J. K., Jones, N. C., Royse, A. G., Royse, C. F. Sevoflurane anesthesia does not impair acquisition learning or memory in the Morris water maze in young adult and aged rats. Anesthesiology. 117 (5), 1091-1101 (2012).
  23. Li, R., et al. Sevoflurane exposure in the developing brain induces hyperactivity, anxiety-free, and enhancement of memory consolidation in mice. Front Aging Neurosci. 14, 934230(2022).
  24. Yuan, I., Xu, T., Kurth, C. D. Using electroencephalography (EEG) to guide propofol and sevoflurane dosing in pediatric anesthesia. Anesthesiol Clin. 38 (3), 709-725 (2020).
  25. Schinelli, S., et al. Stimulation of endothelin B receptors in astrocytes induces cAMP response element-binding protein phosphorylation and c-Fos expression via multiple mitogen-activated protein kinase signaling pathways. J Neurosci. 21 (22), 8842-8853 (2001).
  26. Florian, C., Mons, N., Roullet, P. CREB antisense oligodeoxynucleotide administration into the dorsal hippocampal CA3 region impairs long- but not short-term spatial memory in mice. Learn Mem. 13 (4), 465-472 (2006).
  27. Cabrera, O. H., Useinovic, N., Jevtovic-Todorovic, V. Neonatal anesthesia and dysregulation of the epigenome. Biol Reprod. 105 (3), 720-734 (2021).
  28. Arellano, J. I., Duque, A., Rakic, P. A coming-of-age story: adult neurogenesis or adolescent neurogenesis in rodents. Front Neurosci. 18, 1383728(2024).
  29. Borsini, A., Giacobbe, J., Mandal, G., Boldrini, M. Acute and long-term effects of adolescence stress exposure on rodent adult hippocampal neurogenesis, cognition, and behaviour. Mol Psychiatry. 28 (10), 4124-4137 (2023).
  30. Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The Y-maze for assessment of spatial working and reference memory in mice. Methods Mol Biol. 1916, 105-111 (2019).
  31. Ordodi, V. L., Paunescu, V., Mic, F. A. Optimal access to the rat heart by transverse bilateral thoracotomy with double ligature of the internal thoracic arteries. J Am Assoc Lab Anim Sci. 47 (5), 44-46 (2008).
  32. Aboghazleh, R., et al. Rodent brain extraction and dissection: a comprehensive approach. MethodsX. 12, 102516(2024).
  33. Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue: a review. Diagn Pathol. 9, 221(2014).
  34. Diem, K., et al. Image analysis for accurately counting CD4+ and CD8+ T cells in human tissue. J Virol Methods. 222, 117-121 (2015).
  35. Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean J Anesthesiol. 71 (5), 353-360 (2018).
  36. Shaffer, J. P. Controlling the false discovery rate with constraints: the Newman-Keuls test revisited. Biom J. 49 (1), 136-143 (2007).
  37. Liu, W. Some results on step-up tests for comparing treatments with a control in unbalanced one-way layouts. Biometrics. 53 (4), 1508-1512 (1997).
  38. Steven, A., et al. What turns CREB on? And off? And why does it matter. Cell Mol Life Sci. 77 (20), 4049-4067 (2020).
  39. Naqvi, S., Martin, K. J., Arthur, J. S. CREB phosphorylation at Ser133 regulates transcription via distinct mechanisms downstream of cAMP and MAPK signalling. Biochem J. 458 (3), 469-479 (2014).
  40. Brosnan, R. J., Thiesen, R. Increased NMDA receptor inhibition at an increased sevoflurane MAC. BMC Anesthesiol. 12, 9(2012).
  41. Wang, H., Peng, R. Y. Basic roles of key molecules connected with NMDAR signaling pathway on regulating learning and memory and synaptic plasticity. Mil Med Res. 3 (1), 26(2016).
  42. Chen, B. S., Roche, K. W. Regulation of NMDA receptors by phosphorylation. Neuropharmacology. 53 (3), 362-368 (2007).
  43. Brightwell, J. J., Smith, C. A., Neve, R. L., Colombo, P. J. Transfection of mutant CREB in the striatum, but not the hippocampus, impairs long-term memory for response learning. Neurobiol Learn Mem. 89 (1), 27-35 (2008).
  44. Colombo, P. J., Brightwell, J. J., Countryman, R. A. Cognitive strategy-specific increases in phosphorylated cAMP response element-binding protein and c-Fos in the hippocampus and dorsal striatum. J Neurosci. 23 (8), 3547-3554 (2003).
  45. Kida, S. A functional role for CREB as a positive regulator of memory formation and LTP. Exp Neurobiol. 21 (4), 136-140 (2012).
  46. Liu, Z., et al. Long-term sevoflurane exposure resulted in temporary rather than lasting cognitive impairment in Drosophila. Behav Brain Res. 442, 114327(2023).
  47. Wei, W., et al. Biomechanical effect of proximal multifidus injury on adjacent segments during posterior lumbar interbody fusion: a finite element study. BMC Musculoskelet Disord. 24 (1), 521(2023).
  48. Giza, C. C., Maria, N. S., Hovda, D. A. N-methyl-D-aspartate receptor subunit changes after traumatic injury to the developing brain. J Neurotrauma. 23 (6), 950-961 (2006).
  49. Jia, M., et al. Role of histone acetylation in long-term neurobehavioral effects of neonatal exposure to sevoflurane in rats. Neurobiol Dis. 91, 209-220 (2016).
  50. Tang, X., et al. Resveratrol mitigates sevoflurane-induced neurotoxicity by the SIRT1-dependent regulation of BDNF expression in developing mice. Oxid Med Cell Longev. 2020, 9018624(2020).
  51. Gao, H., et al. Effects of intravenous anesthetics on the phosphorylation of cAMP response element-binding protein in hippocampal slices of adult mice. Mol Med Rep. 18 (1), 627-633 (2018).
  52. Allen, T. A., Fortin, N. J. The evolution of episodic memory. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (Suppl 2), 10379-10386 (2013).
  53. Bucci, D. J., Robinson, S. Toward a conceptualization of retrohippocampal contributions to learning and memory. Neurobiol Learn Mem. 116, 197-207 (2014).
  54. Cherubini, E., Miles, R. The CA3 region of the hippocampus: how is it? what is it for? how does it do it. Front Cell Neurosci. 9, 19(2015).
  55. Lehr, A. B., et al. Ca2+ beyond social memory: evidence for a fundamental role in hippocampal information processing. Neurosci Biobehav Rev. 126, 398-412 (2021).
  56. Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
  57. Benke, T. A., Luthi, A., Isaac, J. T., Collingridge, G. L. Modulation of AMPA receptor unitary conductance by synaptic activity. Nature. 393 (6687), 793-797 (1998).
  58. Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105 (3), 331-343 (2001).
  59. Benke, T. A., et al. Mathematical modelling of non-stationary fluctuation analysis for studying channel properties of synaptic AMPA receptors. J Physiol. 537 (Pt 2), 407-420 (2001).
  60. Poncer, J. C., Esteban, J. A., Malinow, R. Multiple mechanisms for the potentiation of AMPA receptor-mediated transmission by alpha-Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Neurosci. 22 (11), 4406-4411 (2002).
  61. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. ILAR J. 55 (2), 310-332 (2014).
  62. Macheda, T., Snider, H. C., Watson, J. B., Roberts, K. N., Bachstetter, A. D. An active avoidance behavioral paradigm for use in a mild closed head model of traumatic brain injury in mice. J Neurosci Methods. 343, 108831(2020).
  63. Shang, M., et al. Moderate white light exposure enhanced spatial memory retrieval by activating a central amygdala-involved circuit in mice. Commun Biol. 6 (1), 414(2023).

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