Artículo de método

Un ensayo de permeabilidad de la membrana liposomal para investigar los efectos de los grupos fosfato de fosfatidilinositol sobre la acción membranotrópica del veneno PLA2

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DOI:

10.3791/68594

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26 de septiembre de 2025

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1Advanced STEM Research Center, Beijing Chaoyang KaiWen Academy, 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Department of Pharmacology, University of Nevada Reno, 4Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, M. V. Lomonosov Moscow State University

En este artículo

Resumen

Presentamos un método rentable para evaluar la permeabilidad de la membrana liposomal con una sensibilidad y resolución superiores a las técnicas convencionales. Utilizando una novedosa reacción de sustitución de ligandos encapsulados, esta técnica detecta cambios inducidos por fosfolipasa A2 en las membranas del modelo. Este enfoque accesible, que se integra fácilmente con los análisis estándar, mejora la resolución para estudiar la biofísica de las membranas y las interacciones de toxinas.

Resumen

Desarrollamos un ensayo novedoso, rentable y altamente sensible para evaluar la permeabilidad de la membrana liposomal basado en reacciones de sustitución de ligandos que involucran ligandos encapsulados en el volumen interno de liposomas, que combinamos con un ensayo de actividad hidrolítica (utilizando acilación de coenzima A) y simulación de modelado molecular para investigar si los fosfatos del anillo de inositol en fosfatidilinositol protegen las membranas de los efectos dañinos de las enzimas expresadas de manera aberrante. La expresión aberrante de fosfolipasas A2 (PLA2) conduce a la desmielinización de los axones que desencadena el desarrollo de la esclerosis múltiple y la enfermedad de Alzheimer. Para imitar los efectos del PLA₂ expresado de forma aberrante, utilizamos la subunidad básica del veneno de víbora PLA₂, HDP-2P. El HDP-2P se probó en liposomas de fosfatidilcolina (PC) enriquecidos con fosfatidilinositol, fosfatidilinositol-4-fosfato (PI-4-P) o fosfatidilinositol-4,5-difosfato (PI-4,5-P2). Mientras que HDP-2P mostró una actividad hidrolítica mínima y solo aumentó ligeramente la permeabilidad en los liposomas de PC, el enriquecimiento de los liposomas de PC con PI mejoró tanto la hidrólisis como la permeabilidad. Sorprendentemente, PI-4-P y PI-4,5-P₂ inhibieron drásticamente la actividad hidrolítica de HDP-2P y redujeron completamente la permeabilidad. Las simulaciones de modelos moleculares revelaron que los fosfatos del anillo de inositol en el fosfatidilinositol bloquean estéricamente el acceso de los fosfolípidos al sitio activo de HDP-2P, evitando la hidrólisis. Tanto los datos in vitro como los in silico sugieren que los fosfatidilinositoles fosforilados están asociados con una actividad reducida de PLA₂, lo que indica un mecanismo potencial para mitigar la actividad excesiva de PLA2 , presumiblemente como un medio para proteger las membranas celulares de la degeneración.

Introducción

El fosfatidilinositol (PI) es un fosfolípido aniónico que consiste en una columna vertebral de ácido fosfatídico unida al inositol, un anillo hexahidroxi de seis carbonos, a través de un grupo fosfato. El inositol se puede convertir reversiblemente en fosfoinosítidos por fosforilación en las posiciones de carbono 2, 3, 4, 5 y 61. Los PI y los fosfoinosítidos se encuentran en las membranas plasmáticas y los orgánulos de varias células de animales, plantas y microorganismos. Setenta años después de su descubrimiento por Mable y Lowell Hokin 2,3,4, los PI y los fosfoinosítidos siguen siendo objeto de una extensa investigación destinada a comprender sus mecanismos moleculares y su relevancia para la salud humana 5,6,7.

Aparte del tejido cerebral, los fosfoinosítidos suelen estar presentes en bajas concentraciones, lo que representa alrededor del 0,5 al 1% de los lípidos totales en la valva interna de la membrana plasmática. Los datos publicados indican que es poco probable que el IP desempeñe un papel estructural importante en condiciones fisiológicas1. Sin embargo, durante los estados de enfermedad, los niveles de IP y fosfoinosítidos aumentan, y cambian a la valva externa de la membrana plasmática, lo que indica que estos fosfolípidos pueden estar relacionados con la resistencia a la enfermedad1. Aunque durante mucho tiempo se ha pensado que el IP juega un papel fisiológico menos significativo en comparación con los fosfoinositidos, la evidencia emergente destaca la importancia de PI-4-P y PI-4,5-P2 en varios procesos fisiológicos1. Estos procesos incluyen señalización intracelular, transducción de señales intercelulares 8,9,10, tráfico de membranas 11,12,13, modulación de la expresión génica1, así como proliferación celular14 y supervivencia1. A pesar de esto, los mecanismos moleculares por los cuales PI y fosfoinosítidos impulsan estos procesos siguen siendo poco conocidos.

Los PI y los fosfoinosítidos son abundantes en las células del tejido cerebral, donde constituyen aproximadamente el 10% del total de fosfolípidos, aunque sus niveles pueden aumentar transitoriamente en las primeras etapas de las enfermedades cerebrales, lo que sugiere que los fosfoinosítidos pueden contrarrestar el desarrollo de patologías neurológicas1 como la esclerosis múltiple y la enfermedad de Alzheimer desencadenada por la desmielinización axonal causada por la actividad aberrante de PLA2s15, 16,17. Estas enzimas pertenecen a las diversas clases y grupos, incluida la fosfolipasa secretora del grupo IIA A2 (sPLA2)15. Los niveles elevados de este grupo de enzimas se encuentran en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con esclerosis múltiple y Alzheimer, donde contribuyen a la descomposición de las membranas de mielina, lo que lleva a la desmielinización15. También se ha informado que los sPLA2de los venenos de serpiente inhiben la transmisión en las sinapsis neuromusculares18,19, causando trastornos del sistema nervioso central y afectando negativamente al sistema neuromuscular periférico20.

En este estudio, investigamos si el IP y los fosfoinosítidos pueden proteger las membranas de fosfolípidos modelo de los efectos de las enzimas sPLA2 expresadas de forma aberrante. Las membranas modelo estaban hechas de fosfatidilcolina (PC), el fosfolípido más abundante en todas las membranas celulares de mamíferos21, enriquecidas con una relación molar del 20% de PI, PI-4-P o PI-4,5-P2. Para imitar los efectos de las enzimas sPLA2 expresadas aberrantemente en membranas modelo, utilizamos la subunidad básica HDP-2P dela enzima neurotóxica PLA22 del veneno de víbora secretora del grupo IIA, cuya actividad hidrolítica se ha estudiado previamente en membranas de mielina modelo23.

Para este trabajo, desarrollamos un enfoque novedoso para investigar los cambios en la permeabilidad de las membranas liposomales afectadas por HDP-2P. El novedoso método se basa en una reacción de sustitución de ligando en una solución de CuSO4 fuera de los liposomas, que involucra un ligando NH3 atrapado dentro de los liposomas. Si la permeabilidad de la membrana inducida por HDP-2P permite la fuga de NH3 de los liposomas, el amoníaco liberado sustituirá cuantitativamente cuatro moléculas de agua en iones de cobre hidratados a través de la reacción: [Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) figure-introduction-1 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l). Este intercambio de ligandos produce un aumento característico en la densidad óptica de la solución medible por espectrofotometría (λ = 600 nm), que sirve como nuestra lectura cuantitativa para los cambios de permeabilidad de la membrana. Nuestro enfoque basado en la sustitución de ligandos demuestra una sensibilidad superior para evaluar la permeabilidad de la membrana en comparación con técnicas convencionales como 1H-NMR 23,24,25,26,27,28 y ensayos de transporte de iones29, al tiempo que ofrece la ventaja adicional de no requerir instrumentación costosa. Este método simple y rentable, aplicado junto con las mediciones de actividad hidrolítica de HDP-2P y la simulación in silico de la unión de PI, PI-4-P y PI-4,5-P2 a la superficie molecular de HDP-2P, nos permitió concluir que los fosfatos del anillo de inositol en PI eliminan los efectos disruptivos de HDP-2P en las membranas de PC enriquecidas con PI-4-P o PI-4, 5-P2. Si este hallazgo se confirma en estudios adicionales, la capacidad de los fosfatos del anillo de inositol en PI para proteger contra los efectos nocivos de las proteínas celulares de acción anormal, lo que podría contribuir a la estabilidad de la membrana en condiciones de enfermedad que involucran actividad proteica aberrante, puede allanar el camino para el desarrollo de nuevos productos farmacéuticos para el tratamiento de trastornos neurológicos como la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis múltiple.

Protocolo

1. Simulación in silico de la interacción HDP-2P con PI y fosfoinosítidos utilizando software de modelado molecular

  1. Instalación y preparación del software
    1. Instale el editor de dibujos químicos al que se hace referencia para construir moléculas de ligando como se muestra en el Archivo complementario 1-Figura complementaria S1A.
    2. Instale el software de modelado molecular para el acoplamiento molecular del ligando al receptor.
    3. Instale las herramientas de acoplamiento automatizadas para la preparación de ligandos y receptores.
    4. Como el software de simulación de modelado molecular depende del entorno de Python, instale Python.
  2. Preparación de ligandos
    1. Primero, use el editor de dibujos químicos para construir las coordenadas atómicas de las estructuras moleculares de PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, cardiolipina y fosfatidilserina.
      NOTA: El protocolo de ejemplo en los siguientes pasos de la preparación del ligando describe los pasos solo para PI.
    2. Construya la estructura molecular de PI utilizando el editor de dibujos químicos como se ilustra en el Archivo complementario 1-Figura complementaria S1B y guarde el archivo en formato PDB como se muestra en Archivo complementario 1-Figura complementaria S2.
    3. Abra el archivo PDB en el software de la herramienta de acoplamiento automatizado como se muestra en Archivo complementario 1-Figura complementaria S3A.
    4. Agregue átomos de hidrógeno como se muestra en el Archivo Suplementario 1-Figura Suplementaria S3B y seleccione los átomos polares o todos los átomos de hidrógeno como se muestra en el Archivo Suplementario 1-Figura Suplementaria S4A.
      NOTA: Después de completar el acoplamiento PI con HDP-2P, seleccione solo átomos de hidrógeno polares para simplificar la visualización de enlaces polares o de hidrógeno.
    5. Establezca la molécula PI como ligando para el software de la herramienta de acoplamiento automatizado como se muestra en el archivo complementario 1-Figura complementaria S4B.
    6. Guarde el ligando como un archivo PDBQT como se muestra en Archivo complementario 1-Figura complementaria S5A. Asegúrese de que todos los enlaces sean giratorios.
  3. Preparación del receptor
    1. Descargue el archivo PDB de la fosfolipasa A2 HDP-2 (código PDB 2I0U), que consta de dos monómeros, uno es ácido, enzimáticamente inactivo, A, y el otro es básico, enzimáticamente activo, E. Para eliminar el monómero enzimáticamente inactivo A, importe el archivo 2I0U al software de modelado molecular (Archivo complementario 1-Figura complementaria S5B), seleccione todos los átomos del monómero A (Archivo complementario 1-Figura complementaria S6A), luego vaya a Editar y elimine todos los átomos del monómero A (Archivo complementario 1-Figura complementaria S6B). Mantener el monómero E enzimáticamente activo, que ahora se designa como receptor.
    2. Abra el archivo PDB del receptor HDP-2P en el software de la herramienta de acoplamiento automatizado como se muestra en el archivo complementario 1-Figura complementaria S7.
    3. Elimine todas las moléculas de agua como se muestra en el Archivo complementario 1-Figura complementaria S8A.
    4. Agregue átomos de hidrógeno como se muestra en el Archivo complementario 1-Figura complementaria S8B. Tenga en cuenta que después de completar el acoplamiento HDP-2P con PI, solo se deben seleccionar hidrógenos polares para simplificar la visualización de enlaces polares y de hidrógeno.
    5. Establezca el HDP-2P como receptor, como se muestra en el Archivo complementario 1-Figura complementaria S9A, y guárdelo como un archivo PDBQT. Asegúrese de que el receptor esté configurado sin enlaces giratorios.
  4. Configuración de parámetros de acoplamiento
    1. Abra los archivos PDBQT del ligando y del receptor.
    2. Ingrese a la interfaz de configuración de la caja de cuadrícula, como se muestra en el Archivo complementario 1-Figura complementaria S9B, y defina el tamaño de la caja de cuadrícula (tamaño x = 44.644; tamaño y = 74.939; tamaño z = 43.050) y el centro (centro x = 25.626; centro y = 9.582; centro z = 41.825), que encierran completamente toda la superficie de la molécula receptora como se muestra en el Archivo complementario 1-Figura complementaria S10A.
    3. Cierre la interfaz de configuración de la caja de cuadrícula con la configuración actual como se muestra en Archivo complementario 1-Figura complementaria S10B y guarde los parámetros de acoplamiento en un archivo config.txt como se muestra en Archivo complementario 1-Figura complementaria S11A.
  5. Ejecución del software de acoplamiento molecular
    1. Inicie el software de acoplamiento molecular utilizando el archivo config.txt como se muestra en el Archivo complementario 1-Figura complementaria S11B.
    2. Ejecute el cálculo de acoplamiento (~30-90 min; Archivo complementario 1-Figura complementaria S12).
    3. Compruebe el archivo docking_log.txt para revisar las puntuaciones de acoplamiento (afinidad de enlace).
    4. Seleccione el resultado de acoplamiento con la conformación de energía más baja.
  6. Análisis de datos de acoplamiento
    1. Utilice el software de la herramienta de acoplamiento automatizado para abrir el archivo PDBQT de resultados de acoplamiento.
    2. Analice los sitios de unión ligando-receptor, centrándose en el centro activo del receptor y las interacciones intermoleculares, incluidas las interacciones iónicas, iónico-polares, polares y de enlaces de hidrógeno. Haga una tabla para PI y fosfoinosituro, que interactúa con el sitio activo del receptor, para describir las afinidades del sitio de unión en kcal / mol, restos cargados y polares en la cabeza polar PI / fosfoinositida y residuos de HDP-2P involucrados en enlaces intermoleculares, y tipos de enlaces como se muestra en la Tabla 1 y la Tabla 2. Repita el acoplamiento para cada par receptor-ligando 3 veces para asegurarse de que no haya desviación en los sitios de unión, las afinidades de unión, los restos cargados y polares de PI / fosfoinositido y residuos de HDP-2P, y el tipo de enlaces.

2. Actividad hidrolítica de HDP-2P en liposomas PC enriquecidos con PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 , PS o CL monitorizados mediante el uso de la coenzima A acilada con ácidos grasos libres

NOTA: El cloroformo, el metanol, el NH3 y el CuSO4 son peligrosos. Siempre use guantes de nitrilo, gafas protectoras y bata de laboratorio. Manejar todos los protocolos con estos reactivos bajo la campana extractora. Guarde el cloroformo en una botella de vidrio ámbar. Almacene el metanol en gabinetes inflamables lejos de oxidantes. Mantenga el metanol alejado de llamas y chispas. Etiquete todos los contenedores de residuos para estos reactivos y deséchelos de acuerdo con las regulaciones locales de eliminación de desechos peligrosos.

  1. Preparar 100 ml de solución tampón para la hidrólisis de fosfolípidos catalizada por HDP-2P disolviendo 5,55 mg de CaCl2 en tampón Tris-HCl 0,10 M (pH 7,4).
  2. Preparar 50 ml de solución madre de EDTA 1,0 M disolviendo 7,31 g de EDTA en agua destilada desionizada (ddH20).
  3. Preparar solución madre HDP-2P 0,54 mM en tampón Tris-HCl 0,10 M (pH 7,4). La masa molar de HDP-2P es de 13,827 kDa.
  4. Preparar las siguientes soluciones madre de fosfolípidos a concentración 10,0 M en mezcla de cloroformo/metanol (2 a 1 en volumen): yema de huevo L-α-fosfatidilcolina (PC), cardiolipina cardíaca bovina (CL), cerebro bovino L-α-fosfatidil-L-serina (PS), PI, PI-4-P y PI-4,5-P2. Las masas molares de PC, CL, PS, PI, PI-4-P y PI-4,5-P2 son 768 Da, 1,466 Da, 792 Da, 867 Da, 962 Da y 1,057 Da, respectivamente, como se describe más adelante.
  5. Prepare cinco muestras de liposomas PC. Para preparar una muestra de liposomas de PC, añadir 75 μL de solución madre de cloroformo/metanol de PC a un tubo de ensayo de vidrio y secar los lípidos a 25 °C bajo 10 Pa de vacío durante 1 h hasta que se forme una película lipídica. Hidratar la película lipídica durante 1 h con 15 ml de solución tampón para la hidrólisis de fosfolípidos a 25 °C en un termostato. A continuación, inserte la pistola de titanio de un dispensador ultrasónico de 100-150 W en la suspensión lipídica del tubo de ensayo de vidrio colocado en un baño de hielo y sonique la suspensión a una frecuencia de 22 kHz durante 10 min, sin superar el 50% de la potencia máxima. Para eliminar las partículas de "polvo" de titanio, centrifugar liposomas a 200 × g (1.270 rpm con un rotor de 10 cm) durante 10 min a temperatura ambiente.
  6. Prepare muestras de liposomas de PC enriquecidos con CL, PS, PI, PI-4-P o PI-4,5-P2 en la relación molar de PC y otros lípidos de 4 a 1 mezclando soluciones madre de cloroformo/metanolfosfolípido -60 μL de PC con 15 μL de CL, PS, PI, PI-4-P o PI-4,5-P2- en un tubo de vidrio. Luego, seque los lípidos en un vacío de 10 Pa o durante 3 h a temperatura ambiente, hidrate la película lipídica en una solución tampón para hidrólisis de fosfolípidos y sonique con ondas ultrasónicas como se describió anteriormente.
    NOTA: Para cada tipo de liposomas, prepare cinco muestras.
  7. Coloque 1,0 ml de cinco muestras de cada tipo de liposomas descrito anteriormente en tubos separados y agregue 10 μl de solución incolora de coenzima-A del kit NEFA a cada tubo y luego agregue 0,00, 0,93, 1,86, 2,79 o 3,72 μl de solución madre HDP-2P 0,54 mM a tubos separados para obtener en muestras de liposomas las relaciones molares HDP-2P/fosfolípidos de 0,000. 0,001, 0,002, 0,003 y 0,004, respectivamente.
  8. Inmediatamente después de agregar HDP-2P a los liposomas, incube muestras de liposomas durante 15 min a 37 ° C en un termostato y luego, detenga la hidrólisis de fosfolípidos inducida por HDP-2P agregando 100 μL de solución madre de EDTA. Después de eso, agite las muestras durante 1 min.
  9. Cuantifique la actividad hidrolítica de HDP-2P midiendo la densidad óptica de muestras liposomales a 550 nm utilizando un espectrofotómetro, que mediría la medida en que la solución incolora de coenzima-A se vuelve púrpura cuando se acilla con ácidos grasos libres.
  10. Repita el procedimiento anterior dos veces más para que los valores promedio de densidad óptica se deriven de tres ensayos independientes.
    NOTA: Cada punto de datos obtenido en este ensayo experimental es el valor promedio de la densidad óptica. Idealmente, la desviación estándar de los puntos de datos experimentales debería estar dentro del ±5% del promedio.

3. Efectos de HDP-2P sobre la permeabilidad de las membranas liposomales de PC enriquecidas con PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 , PS o CL medidos por una reacción de sustitución de ligando en solución de CuSO4 que involucra un ligando NH3 atrapado dentro de los liposomas

NOTA: El cloroformo, el metanol, el NH3 y el CuSO4 son peligrosos. Siempre use guantes de nitrilo, gafas protectoras y bata de laboratorio. Manejar todos los protocolos con estos reactivos bajo la campana extractora. Guarde el cloroformo en una botella de vidrio ámbar. Almacene el metanol en gabinetes inflamables lejos de oxidantes. Mantenga el metanol alejado de llamas o chispas. Etiquete todos los contenedores de residuos para estos reactivos y deséchelos de acuerdo con las regulaciones locales de eliminación de desechos peligrosos.

  1. Prepare 20 ml de soluciones madre 0,03 M para cada uno de los seis fosfolípidos (PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2- en cloroformo/metanol (volumen de 2 a 1). Las masas moleculares de PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 son 768, 1466, 792, 867, 962 y 1057 Da, respectivamente.
  2. Preparar 100 ml de tampón Tris-HCl (pH 7,4) a 0,10 M con una concentración final de 0,05 M CuSO4.
  3. Prepare 4 ml de material HDP-2P de 1,5 × 10-3 M en tampón CuSO4 de 0,05 M y Tris-HCl (pH 7,4) de 0,10 M. La masa molar de HDP-2P es de 13,827 kDa.
  4. Para preparar 100 ml de solución de NH3 0,5 M, utilice una solución de NH3 al 25 % (densidad 905 g/L30, igual a 13,30 M [905 g/L × 0,25 M ÷ 17,00 g/L = 13,30 M]). Por lo tanto, para preparar 100 ml de NH3 0,5 M, utilice 3,76 ml de solución de NH3 al 25%: (0,5 M × 1.000 ml ÷ 13,30 M) ÷ 10 = 3,76 ml de solución de NH3 al 25%. Coloque 3,76 ml de solución de NH3 al 25% en un matraz aforado de 100 ml y lleve el volumen a 100 ml con tampón Tris-HCl (pH 7,4) de 0,10 M.
  5. Para preparar liposomas con NH3 en el volumen interno de liposomas, coloque 12,5 ml de solución de fosfolípidos madre 0,03 M en cloroformo/metanol en un tubo y seque los fosfolípidos al vacío de 10 Pa o durante 3 h a temperatura ambiente. Hidratar la película de fosfolípidos durante 1 h con 12,5 mL de 0,5 M NH3, 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) a 25 °C en un termostato; luego sonique la suspensión de lípidos a una frecuencia de 22 kHz como se describe en el paso 2.5 para producir liposomas sonicados.
    NOTA: En la solución con liposomas sonicados, NH3 se encuentra dentro y fuera de los liposomas.
  6. Para eliminar el NH3 fuera de los liposomas, dialice los liposomas utilizando una membrana de diálisis (corte molecular de 1,0 kDa) durante 5 años a temperatura ambiente frente a 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) utilizando un agitador magnético.
    NOTA: La diálisis durante 5 h fue suficiente para eliminar completamente el NH3, ya que la adición de 0,5 ml de liposomas dializados a 0,5 ml de tampón Tris-HCl 0,10 M y CuSO4 0,05 M produjo la misma densidad óptica a 600 nm que la de los liposomas preparados sin NH3 y mezclados con el mismo tampón.
  7. Después de la diálisis, centrifugar los liposomas a 200 × g durante 90 min como se describe en el paso 2.5 para granular los liposomas. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los liposomas con 5,0 ml de Tris-HCl 0,10 M, tampón CuSO4 (pH 7,4) 0,05 M y divida los liposomas resuspendidos en cinco muestras de 1,0 ml cada una. Agregue a estas cinco muestras de 1,0 ml por separado 60, 40, 20 y 0 μl de Tris-HCl 0,10 M, tampón CuSO4 (pH 7,4) 0,05 M y luego 0, 20, 40, 60, 80 μl de tampón de reserva HDP-2P para ajustar en las muestras de liposomas las relaciones molares HDP-2P/fosfolípidos 0,000, 0,001, 0,002, 0,003 y 0,004, respectivamente.
  8. Incubar las muestras de liposomas durante 30 min en un termostato a 37 °C; Luego, mida la densidad óptica de las muestras de liposomas a 600 nm con un espectrofotómetro. Siga los pasos descritos en la sección 3 para las seis muestras de liposomas y repita 3x para garantizar lecturas triplicadas de densidad óptica para cada punto de datos.
    NOTA: La desviación estándar de los puntos de datos experimentales siempre debe estar dentro del ±5% del promedio.

Resultados

Simulación de modelado molecular de HDP-2P Interacción con PI y fosfoinosítidos
El programa de modelado molecular calcula los mejores nueve sitios de unión en la superficie molecular de un receptor (molécula más grande), que es el objetivo de un ligando (molécula más pequeña). Estos sitios están determinados por la liberación de las nueve entalpías más altas, que designan los sitios con las mejores afinidades de unión. Las afinidades de unión se expresan como valores negativos, lo que indica que la unión intermolecular es un proceso exotérmico. En el caso de HDP-2P interactuando con PI, la simulación predijo cuatro sitios de unión (# 3, # 6, # 7 y # 8) para PI en la superficie molecular de HDP-2P dentro del centro activo (Tabla 1). Además, los cinco sitios de unión para IP se encontraron fuera del centro activo de HDP-2P. Las notaciones de las fracciones cargadas y polares en la cabeza polar de PI se ilustran en la Figura 1.

El centro activo de HDP-2P consta de cinco residuos de aminoácidos clave: Gly30, Gly32, His48, Asp49 y Lys69, que facilitan la alineación adecuada del sustrato de fosfolípidos en el centro activo para garantizar la hidrólisis catalítica. Algunas estructuras acopladas representativas muestran la unión de PI a algunos residuos de aminoácidos del centro activo, mientras que en el sitio de unión # 6, PI se involucra con los cinco residuos de aminoácidos clave del centro activo a través de enlaces iónicos, iónicos polares e hidrógeno (Tabla 1). La Figura 2 ilustra cómo PI interactúa con los cinco residuos de aminoácidos clave en el centro activo de HDP-2P dentro del sitio de unión # 6.

La simulación de acoplamiento de la interacción entre HDP-2P y PI-4-P, que contiene un grupo fosfato en la posición 4 del anillo de inositol, predijo solo el sitio de unión #1 como la ubicación donde PI-4-P se une al centro activo de HDP-2P. Específicamente, en este sitio, PI-4-P interactúa con tres residuos de aminoácidos clave del centro activo: Gly30, Gly32 y Lys69, a través de enlaces iónicos, iónicos polares e hidrógeno (Tabla 2). La Figura 3 ilustra la interacción de PI-4-P con el centro activo de HDP-2P. En los ocho sitios de unión restantes en la superficie molecular de HDP-2P, PI-4-P se une a ubicaciones fuera del centro activo.

Las simulaciones de acoplamiento molecular de las interacciones HDP-2P con PI-4,5-P₂ (que contienen grupos fosfato en las posiciones 4 y 5 del anillo de inositol) no revelaron unión al centro activo de la enzima en los nueve sitios de unión predichos. En cambio, PI-4,5-P₂ se une constantemente a una cavidad en forma de ranura adyacente al centro activo (Figura 4), formando enlaces iónicos-polares y de hidrógeno con los tres residuos HDP-2P, Trp31, Gly33 y Gln34).

Si bien la unión de PI-4,5-P₂ a una cavidad en forma de surco cerca del centro activo de PLA2s celular o venenoso no se ha documentado previamente, las características estructuralmente análogas están bien establecidas en los dominios de homología31 (PH) y homología N-terminal32 (ENTH) de epsina. Estos dominios de señalización utilizan arquitecturas de surcos hidrofóbicos-polares-catiónicos similares para el reconocimiento específico de PI-4,5-P2 31,32, a pesar de su naturaleza no enzimática. La presencia de un motivo estructural comparable en HDP-2P plantea posibilidades intrigantes de mimetismo evolutivo o evolución convergente para facilitar el reconocimiento del dominio de membrana por HDP-2P. Si se verifica con otros métodos, este estudio puede representar el primer caso reportado de un veneno PLA2 que utiliza dicho mecanismo para el reconocimiento de fosfoinositida.

Curiosamente, las simulaciones de acoplamiento molecular de CL y PS interactuando con HDP-2P predijeron la unión de ambos fosfolípidos al centro activo de HDP-2P en ocho de los nueve sitios de unión, mientras que el único sitio de unión de CL y PS exterior al centro activo no se encontraba en la cavidad en forma de surco (datos no mostrados). También vale la pena señalar que, al igual que PI, PC se une al centro activo de HDP-2P en cuatro de los nueve sitios de unión, y tanto PI como PC, como CL y PS, no se unen a la cavidad en forma de ranura (datos no mostrados). Estos hallazgos sugieren que los grupos fosfato en el anillo de inositol de PI tienen una alta afinidad de unión a la cavidad en forma de surco ubicada adyacente al centro activo. Los análisis estructurales han identificado cavidades análogas en forma de surco con parches superficiales hidrofóbicos-polares-catiónicos cerca del centro catalítico en las enzimas celulares33 yvenenosas 34 PLA2 . La unión de fosfoinosítidos a estas cavidades puede inducir cambios conformacionales fisiológicamente significativos, inhibiendo potencialmente la actividad enzimática. En particular, entre los fosfoinositidos, PI-4,5-P2 demuestra características de sustrato particularmente pobres: las isoformas humanas de PLA2 (tipos citosólicos, independientes del calcio y secretados) muestran una actividad hidrolítica mínima a indetectable hacia PI-4,5-P235. Esto sugiere que la unión de fosfoinositidos a estas características estructurales conservadas puede cumplir una función fisiológica distinta (por ejemplo, inhibición alostérica) en lugar de funciones catalíticas en toda la superfamilia PLA2 , lo que requiere una verificación experimental futura.

Actividad hidrolítica de HDP-2P en liposomas de PC enriquecidos con PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS o CL monitorizados con coenzima A acilada con ácidos grasos libres
La actividad hidrolítica de HDP-2P en muestras liposomales se evaluó mediante el uso de una solución de coenzima A. La solución de coenzima A es incolora, pero se vuelve púrpura al acilarse por los ácidos grasos libres liberados durante la hidrólisis de fosfolípidos catalizados por HDP-2P. El aumento resultante en la densidad óptica, correspondiente a la extensión de la acilación de la coenzima A, se midió espectrofotométricamente a 550 nm. Por lo tanto, el aumento de la densidad óptica en muestras liposomales tratadas con coenzima A y HDP-2P es directamente proporcional a la actividad hidrolítica de HDP-2P.

La Figura 5 presenta las curvas de actividad hidrolítica en función de la relación molar HDP-2P/fosfolípido en varias muestras liposomales. La actividad hidrolítica de HDP-2P se expresa en unidades arbitrarias (u.a.) de densidad óptica (OD) medidas a 550 nm. No construimos una curva de calibración para relacionar los valores de la u.a. con las concentraciones molares de ácidos grasos libres, ya que nuestros ensayos experimentales mostraron que los ácidos grasos en disolventes orgánicos, cuando se añaden a soluciones acuosas que contienen coenzima A y acil-coenzima A sintetasa, no producen ningún cambio detectable en la DO a 550 nm. Esto indica que dichos ácidos grasos forman micelas en lugar de unirse a la coenzima A. Por el contrario, solo los ácidos grasos generados por la membrana (producidos por la actividad de PLA2 ) se unen a la coenzima A asociada a la membrana, lo que resulta en un cambio medible de OD. La naturaleza anfipática de la coenzima A, que tiene regiones hidrofóbicas e hidrófilas en su superficie molecular, la localiza preferentemente en la interfaz membrana-agua, lo que facilita la unión de los ácidos grasos producidos por la actividad de PLA2 a la coenzima A. Sin embargo, en estas condiciones de ensayo, no es posible determinar la concentración molar de ácidos grasos. Por esta razón, los investigadores que utilizan el ensayo de coenzima A expresan la actividad hidrolítica de PLA2 en unidades arbitrarias de OD medidas a 550 nm20.

El mayor aumento de la densidad óptica, correspondiente a la mayor actividad hidrolítica de HDP-2P, se observó en liposomas de PC enriquecidos con CL o PS. Este hallazgo se alinea bien con el mayor número de sitios de unión para CL y PS en el centro activo de HDP-2P. La actividad hidrolítica de HDP-2P en liposomas PC enriquecidos con PI fue 3,0 y 2,5 veces menor que en liposomas enriquecidos con CL o PS, respectivamente, pero mayor que en liposomas PC puros. Esto sugiere que la afinidad de unión al centro activo de HDP-2P de PI es mayor que la de PC, a pesar de que ambos lípidos tienen el mismo número de sitios de unión en el centro activo.

Esta aparente discrepancia puede explicarse por diferencias estructurales en los grupos de cabezas polares de PI y PC. Si bien el PC es una molécula neutra, su grupo trimetilamonio catiónico se extiende hacia afuera en la solución, mientras que su grupo fosfato aniónico se coloca más cerca del área hidrofóbica de la membrana. Esta distribución de carga en el grupo principal de PC puede crear una repulsión electrostática contra el HDP-2P básico, reduciendo su afinidad de unión. Por el contrario, la naturaleza ácida de PI la convierte en una especie lipídica más atractiva para la interacción con el HDP-2P básico, lo que podría explicar su mayor actividad hidrolítica en comparación con los liposomas de PC puros.

La actividad hidrolítica de HDP-2P en liposomas de PC enriquecidos con PI-4-P, como se muestra en la Figura 5, sugiere una hidrólisis catalítica mínima de fosfolípidos. Sorprendentemente, la curva de densidad óptica obtenida de liposomas PC enriquecidos con PI-4,5-P indica una abolición completa de la actividad hidrolítica por HDP-2P en esta muestra de liposomas. Estos hallazgos se alinean bien con las simulaciones de acoplamiento, que predicen un sitio de unión para PI-4-P en el centro activo de HDP-2P, mientras que PI-4,5-P2 no muestra ninguna afinidad de unión con el centro activo en absoluto. Esto sugiere que los grupos fosfato unidos al anillo de inositol dificultan la unión del fosfolípido al centro activo de HDP-2P. Proponemos que los grupos fosfato en el anillo de inositol se extienden hacia afuera en la solución y, al unirse a HDP-2P a través de interacciones intermoleculares iónicas e iónico-polares, mantienen HDP-2P a distancia de la superficie de la membrana, protegiendo así la membrana de la actividad hidrolítica de HDP-2P. Esto es consistente con hallazgos recientes que revelan que las enzimas PLA2 secretadas y citosólicas humanas, independientes del calcio y secretadas mostraron actividad hidrolítica apenas detectable o nula hacia los sustratos PI-4-P y PI-4,5-P2 35.

Cambios de permeabilidad inducidos por HDP-2P en membranas liposomales de PC enriquecidas con PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS o CL: Evaluación mediante reacción de sustitución de ligandos en solución de CuSO4 con NH₃ encapsulado

El impacto de la actividad hidrolítica HDP-2P en la permeabilidad de la membrana de los liposomas de PC enriquecidos con PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS o CL se investigó mediante una reacción de sustitución de ligandos en un sistema iónico complejo, donde el ligando sustituto se encapsuló dentro del volumen interno de los liposomas. Este método simple y confiable se basa en el desplazamiento de cuatro moléculas de agua que actúan como ligandos en el ion complejo [Cu (H2O) 6] 2+ por NH3

[Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) figure-results-1 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l)

Durante el proceso de sustitución de moléculas de agua por NH3 en el ion complejo [Cu(H2O)6]2+, el color azul pálido de [Cu(H2O)6]2+ pasa al color azul oscuro de [Cu(H2O)2(NH3)4]2+. En un sistema donde NH3 está encapsulado dentro del volumen interno de los liposomas y [Cu (H2O) 6] 2+ está presente en la solución externa, este cambio de color, monitoreado espectrofotométricamente, indica un aumento en la permeabilidad de la membrana liposomal a NH3.

Para establecer dicho sistema, sonicamos una dispersión de fosfolípidos en tampón Tris-HCl que contiene NH3, formando liposomas sonicados con NH₃ dentro y fuera de los liposomas. El NH3 externo se eliminó mediante diálisis, después de lo cual se agregó una solución de CuSO4 a la muestra de liposoma que contenía NH3 en su volumen interno. Luego tratamos los liposomas con HDP-2P y monitoreamos los cambios en la densidad óptica espectrofotométricamente.

Para determinar la longitud de onda óptima para medir los cambios de densidad óptica, registramos los espectros de absorbancia de [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ en una solución de 0,025 M CuSO4, 0,100 M NH3 y [Cu(H2O)6]2+ en una solución de 0,025 M CuSO4 , utilizando luz visible en el rango de 500 nm a 900 nm. Como se muestra en la Figura 6, la irradiación a 600 nm produjo una absorbancia máxima para [Cu (H2O) 2 (NH3) 4] 2+ y una absorbancia mínima para [Cu (H2O) 6] 2+, lo que nos llevó a seleccionar 600 nm como la longitud de onda óptima para nuestros experimentos de permeabilidad de membrana.

La Figura 7 muestra que la permeabilidad de la membrana al NH₃ es mayor en liposomas PC enriquecidos con CL y PS aniónicos. Esta observación es consistente con nuestros datos informados anteriormente que muestran que HDP-2P, un PLA2 del grupo IIA, interactúa eficientemente con el fosfolípido aniónico palmitoiloleoil-glicerofosfoglicerol, lo que lleva a la hidrólisis del sustrato, un efecto no observado con el fosfolípido neutro palmitoiloleoilglicerofosfocolina36. En general, la mayoría de las enzimas PLA2 del grupo IIA exhiben una actividad hidrolítica significativamente mayor hacia los fosfolípidos aniónicos 33,37,38. La permeabilidad de los liposomas PC+PI es menor que la de los liposomas PC+CL y PC+PS, pero sigue siendo mayor que la de los liposomas PC puros. Estos hallazgos se alinean bien con los resultados de las simulaciones de acoplamiento y los ensayos de actividad hidrolítica HDP-2P. En otras palabras, se espera que las muestras liposomales que muestran baja permeabilidad sean estructuralmente estables debido a la incapacidad de HDP-2P para hidrolizar fosfolípidos y debido a una menor afinidad de HDP-2 para unirse a PI y fosfoinosítidos, como lo predicen los datos de acoplamiento molecular (Figura 2, Figura 3 y Figura 4). Por lo tanto, la actividad hidrolítica enzimática por HDP-2P (Figura 5) y la permeabilidad de la membrana, como se muestra en la Figura 7, deben correlacionarse positivamente.

Sin embargo, en los liposomas PC+PI-4-P y PC+PI-4,5-P2 , la permeabilidad no aumentó tras el tratamiento con HDP-2P. Si bien los resultados de permeabilidad en los liposomas PC+PI-4,5-P2 se correlacionan bien con las simulaciones de acoplamiento y los datos de actividad hidrolítica HDP-2P para los mismos liposomas, la ausencia de una mayor permeabilidad en los liposomas PC+PI-4-P no se alinea completamente con los resultados de la actividad hidrolítica, ya que se registró un pequeño grado de actividad hidrolítica en estos liposomas. Estos hallazgos sugieren que un ligero aumento localizado en la actividad hidrolítica en los liposomas PC+PI-4-P no perturba el empaquetamiento bicapa de fosfolípidos en un grado que cambiaría la permeabilidad de la membrana a NH3.

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Figura 1: Anotaciones de restos cargados y polares de la cabeza polar del fosfatidilinositol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Interacción de PI con el centro activo de HDP-2P predicha para el sitio de unión #6 mediante software de acoplamiento molecular. PI se da en representación de palo y HDP-2P se da en representaciones de línea (diagrama a la izquierda) y superficie molecular (diagrama a la derecha). Para las representaciones en barra, la esmeralda representa el carbono, el naranja es el fósforo, el rojo es el oxígeno y el blanco es el hidrógeno. Para la superficie molecular y las líneas, el verde representa el carbono, el azul es nitrógeno, el rojo es oxígeno, el blanco es hidrógeno y el amarillo es azufre. Las líneas discontinuas amarillas identifican enlaces intermoleculares. Las flechas apuntan a residuos de aminoácidos en el centro activo. Abreviaturas: PI = Fosfatidilinositol; HDP-2P = subunidad básica de fosfolipasa del veneno de víbora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Interacción de PI-4-P con el centro activo de HDP-2P predicha para el sitio de unión #1 mediante software de acoplamiento molecular. PI-4-P se da en representación de palo y HDP-2P se da en representaciones de líneas (diagrama a la izquierda) y superficie molecular (diagrama a la derecha). Para los palos, la esmeralda representa el carbono, el naranja es fósforo, el rojo es oxígeno y el blanco es hidrógeno. Para la superficie molecular y las líneas, el verde representa el carbono, el azul es nitrógeno, el rojo es oxígeno, el blanco es hidrógeno y el amarillo es azufre. Las líneas discontinuas amarillas identifican enlaces intermoleculares. Las flechas apuntan a residuos de aminoácidos en el centro activo. Abreviaturas: PI-4-P = fosfatidilinositol-4-fosfato; HDP-2P = subunidad básica de fosfolipasa del veneno de víbora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Interacción de PI-4,5-P2 con la superficie molecular de HDP-2P predicha para el sitio de unión #6 mediante software de acoplamiento molecular. PI-4,5-P2 se une a una cueva en forma de ranura ubicada debajo del centro activo de HDP-2P. Los cinco residuos de aminoácidos clave en el centro activo se dan en la notación de tres letras. PI-4,5-P2 se da en representación de palo y HDP-2P se da en representaciones de línea (diagrama a la izquierda) y superficie molecular (diagrama a la derecha). Para los palos, la esmeralda representa el carbono, el naranja es fósforo, el rojo es oxígeno y el blanco es hidrógeno. Para la superficie molecular y las líneas, el verde representa el carbono, el azul es nitrógeno, el rojo es oxígeno, el blanco es hidrógeno y el amarillo es azufre. Abreviaturas: PI-4,5-P2 = fosfatidilinositol-4,5-difosfato; HDP-2P = subunidad básica de fosfolipasa del veneno de víbora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Curvas de actividad hidrolítica de muestras de liposomas en varias proporciones molares HDP-2P/fosfolípidos. Liposomas hechos de PC+CL (verde oscuro), PC+PS (naranja), PC+PI (azul oscuro), PC+PI-4-P (azul), PC+PI-4,5-P2 (verde) y PC (morado). Los valores de densidad óptica en unidades arbitrarias representan las medias de las lecturas triplicadas a 550 nm. Las barras de error indican la DE de las lecturas por triplicado. La significación estadística de las diferencias en los valores de densidad óptica entre las muestras de liposomas se evaluó mediante ANOVA, y todos los valores p se encontraron muy por debajo de 0,05. Abreviaturas: PC = fosfatidilcolina; CL = cardiolipina cardíaca bovina ; PS = fosfatidilserina; PI = fosfatidilinositol; PI-4-P = Fosfatidilinositol-4-fosfato; PI-4,5-P2 = fosfatidilinositol-4,5-difosfato; a.u. = unidades arbitrarias; HDP-2P = subunidad básica de fosfolipasa del veneno de víbora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Espectros de absorbancia de soluciones acuosas de complejos de cobre. Complejos de cobre [Cu(H2O)6]2+ (línea naranja) y [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (línea azul), irradiados por luz visible en el rango de 500 nm a 900 nm. El complejo de cobre [Cu(H2O)6]2+ se formó en una solución de 0,025 M CuSO4 y el complejo de cobre [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ se hizo en una solución de 0,025 M CuSO4 que contenía 0,100 M de NH3. Los valores de absorbancia en esta figura para cada punto de datos son los medios de las lecturas de absorbancia realizadas por triplicado. Las barras de error representan la SD de las lecturas por triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Curvas de permeabilidad de la membrana de muestras de liposomas. Liposomas compuestos de PC+CL (morado), PC+PS (azul), PC+PI (azul oscuro), PC+PI-4-P (verde oscuro), PC+PI-4,5-P2 (naranja) y PC (verde) en varias proporciones molares de HDP-2P/fosfolípidos. Los valores de permeabilidad de la membrana se expresan como valores de densidad óptica en unidades arbitrarias (u.a.) medidas a 600 nm. Cada punto de datos representa la media de las lecturas triplicadas. Las barras de error indican la DE de las lecturas por triplicado. La significación estadística de las diferencias en los valores de densidad óptica entre las muestras de liposomas se evaluó mediante ANOVA, y todos los valores p se encontraron muy por debajo de 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Energías de unión de afinidad predichas para complejos moleculares candidatos de HDP-2P con PI. Se utilizaron simulaciones de modelos moleculares para predecir los tipos de enlaces y afinidades del sitio de unión, así como los restos cargados y polares tanto del grupo principal de fosfatidilinositol como de los residuos de aminoácidos HDP2P que participan en sus interacciones intermoleculares. Los grupos cargados y polares de fosfatidilinositol se destacan en la Figura 1. Tenga en cuenta que Pb en NHpbδ+ denota un enlace peptídico. Abreviaturas: PI = Fosfatidilinositol; HDP-2P = subunidad básica de fosfolipasa del veneno de víbora. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Energías de unión de afinidad predichas para complejos moleculares candidatos de HDP-2P con PI-4-P. Se utilizaron simulaciones de modelos moleculares para predecir los tipos de enlaces y afinidades del sitio de unión, así como los restos cargados y polares tanto del grupo principal de fosfatidil-inositol-4-fosfato (PI-4-P) como de los residuos de aminoácidos HDP2P que participan en sus interacciones intermoleculares. Tenga en cuenta que Pb en NHpbδ+ denota un enlace peptídico. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo complementario 1: Flujo de trabajo de acoplamiento molecular. Descripción general del procedimiento de acoplamiento molecular con AutoDock, incluida la construcción de ligandos, la preparación del receptor, la configuración de la caja de cuadrícula y la ejecución de simulaciones de acoplamiento para predecir las interacciones PI-HDP-2P. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En este estudio, investigamos si los grupos fosfato unidos covalentemente al anillo de inositol en fosfatidilinositol (PI) pueden prevenir la degradación de las membranas de fosfolípidos por la enzima fosfolipasa A2 (PLA2). Para evaluar la progresión de la degradación de la membrana de fosfolípidos causada por la actividad hidrolítica de PLA2, diseñamos un método simple pero altamente sensible y preciso para medir los cambios en la permeabilidad de la membrana, que debería aumentar a medida que avanza la degradación estructural.

El método se basa en una reacción de sustitución de ligandos que involucra el complejo hexaacuacucobre (II), [Cu (H2O) 6] 2+, suspendido en el ambiente acuoso fuera de los liposomas fosfolípidos, mientras que el amoníaco (NH3) está encapsulado dentro de los liposomas. El amoníaco tiene una mayor afinidad por Cu2+ que las moléculas de agua, pero NH3 debe penetrar a través de la membrana liposomal para acceder a la fase acuosa externa, donde sustituye a las moléculas de H2O en [Cu (H2O) 6] 2+. Si la integridad estructural de la membrana liposomal se ve comprometida debido a la hidrólisis de fosfolípidos catalizada por PLA2, el aumento de la permeabilidad de la membrana a NH3 facilitará la sustitución del ligando, lo que conducirá a un cambio de color del azul pálido de [Cu (H2O) 6] 2+ al azul oscuro de [Cu (H2O) 2 (NH3) 4] 2+. Hemos monitoreado esta transformación cuantitativamente empleando espectrofotometría para registrar el cambio en la densidad óptica a 600 nm.

Anteriormente hemos utilizado 1H-RMN con ferrocianuro de iones paramagnéticos, [Fe(CN)6]3-, para estudiar los cambios en la permeabilidad de la membrana afectada por HDP-2P24 y por cardiotoxinas de veneno de cobra 24,25,26,27,28,39. También hemos utilizado una gama de sondas fluorescentes y fosforescentes para estudiar los efectos de las cardiotoxinas del veneno de cobra en la permeabilidad de las membranas liposomales 20,23,40. Sin embargo, las sondas de ferrocianuro y fluorescentes/fosforescentes son grandes entidades moleculares no fisiológicas que penetran en las membranas lipídicas cuando la integridad de la membrana se daña significativamente. Por el contrario, nuestro nuevo ensayo de sustitución de ligandos utiliza NH₃, un pequeño metabolito celular natural capaz de penetrar las membranas lipídicas en sutiles perturbaciones de empaquetamiento de lípidos. Esta sensibilidad mejorada de nuestro novedoso método de permeabilidad a la membrana se evidencia por su capacidad para detectar cambios en la permeabilidad de la membrana en una relación HDP-2P/molar lipídico de 0,001, en comparación con 0,004 requerido para la detección de ¹H-NMR/ferrocianuro23.

En el mismo estudio, utilizamos la extinción de la fosforescencia de eritrosina por ferroceno para examinar los efectos de HDP-2P sobre el intercambio lipídico intermembrana, evaluado por el cambio en la relación entre la vida útil de la eritrosina en las muestras de prueba (τn) y la de la muestra de control (τ0)23. A una relación molar HDP-2P/lípidos de 0,004, el valor de τn/τ0 disminuyó a 0,423, lo que indica un estado de fluidez de la membrana permeable a los cationes divalentes24. Por lo tanto, nuestro ensayo de sustitución de ligandos basado en NH₃ detecta la permeabilidad de la membrana a una relación molar HDP-2P/lípidos de 0,001, mientras que los ensayos convencionales (1H-NMR/ferrocianuro y extinción de la sonda de fosforescencia) detectan la permeabilidad de la membrana solo a una relación molar de 0,004. Esto demuestra que nuestro ensayo basado en NH3 es cuatro veces más sensible que los ensayos convencionales.

La sensibilidad excepcional de nuestro ensayo basado en NH3 arrojó datos de permeabilidad que se correlacionaron estrechamente con las mediciones de actividad hidrolítica, con solo una discrepancia aparente: los liposomas PC+PI-4-P mostraron una hidrólisis insignificante sin cambios en la permeabilidad, lo que sugiere que la producción local mínima de lisofosfolípidos/ácidos grasos no afecta el empaquetamiento global de lípidos, lo que no influye en la integridad estructural y la permeabilidad de la membrana. Por lo tanto, este estudio demostró que la reacción de sustitución de ligandos en un sistema iónico complejo, que involucra un ligando encapsulado dentro del volumen interno de liposomas, produjo resultados que se alinearon excelentemente con los datos de actividad hidrolítica de HDP-2P. Estos hallazgos, a su vez, concuerdan fuertemente con los estudios in silico sobre la unión de PI y fosfoinosítidos a la superficie molecular de HDP-2P.

En general, la simulación de AutoDock en el presente estudio reveló que PI se une al centro activo en cuatro de los nueve sitios de unión identificados, mientras que PI-4-P se une al centro activo en solo uno de los nueve sitios predichos. La actividad hidrolítica de HDP-2P en liposomas PC+PI-4-P fue aproximadamente 5 veces menor que en liposomas PC+PI. Además, los estudios in silico predijeron que no se uniría PI-4,5-P2 al centro activo de HDP-2P. Consistentemente, los ensayos de actividad de PLA2 y los experimentos de reacción de sustitución de ligandos mostraron que PI-4,5-P2 inhibió completamente tanto la hidrólisis de fosfolípidos como el aumento de la permeabilidad de la membrana, mientras que PI-4-P mostró menos actividad hidrolítica no significativa y evitó por completo los cambios de permeabilidad de la membrana. Estas observaciones concuerdan bien con los estudios de actividad in vitro de enzimas PLA2 citosólicas, independientes del calcio y secretadas en humanos hacia PI, PI-4-P y PI-4,5-P235. Estos estudios mostraron que solo el PLA2 citosólico del Grupo IVA exhibió una actividad catalítica relativamente alta hacia PI y PI-4-P, mientras que su actividad hacia PI-4,5-P2 fue apenas detectable. Todas las demás enzimas PLA2 probadas no mostraron actividad hacia PI-4,5-P235. Esta falta de actividad se ha atribuido a los grupos fosfato altamente hidrófilos en el anillo de inositol, que interfieren con las interacciones productivas entre la superficie de la membrana y las enzimas PLA2 35. Sugerimos que la extensión hacia afuera de los grupos fosfato en el anillo de inositol en la solución y su capacidad para formar enlaces iónicos polares e hidrógeno con residuos de la cavidad en forma de ranura de HDP-2P probablemente impide que HDP-2P se acerque a la superficie de la membrana lo suficientemente cerca como para ejercer su actividad hidrolítica, estabilizando así la membrana y reduciendo la degradación de las membranas de fosfolípidos por HDP-2P, que puede ser perjudicial para las células al activar las vías de muerte celular. Este mecanismo parece alinearse con el papel protector potencial de los fosfoinositidos en condiciones de enfermedad que involucran actividad enzimática aberrante.

La fuerte correlación entre los resultados obtenidos de los ensayos de permeabilidad de la membrana, las mediciones de actividad hidrolítica y los estudios de acoplamiento molecular in silico destaca la confiabilidad del método de reacción de sustitución de ligandos. Este enfoque, que utiliza un ligando encapsulado dentro de liposomas, demuestra ser una herramienta precisa y eficaz para evaluar los cambios de permeabilidad de la membrana causados por perturbaciones estructurales en la organización bicapa estable de los fosfolípidos. Si bien reconocemos que los estudios de acoplamiento molecular que utilizan AutoDock presentados en este documento no proporcionan una comprensión profunda de cómo los fosfolípidos pueden interactuar con HDP-2P de manera dinámica y longitudinal, los estudios de dinámica molecular deben realizarse en el futuro para identificar mecanismos moleculares adicionales de cómo HDP-2 puede permeabilizar bicapas de fosfolípidos compuestas de varios fosfolípidos. Es importante tener en cuenta que la realización de estudios de dinámica molecular requiere altos recursos computacionales, como computadoras y clústeres de alto rendimiento, que no están disponibles en muchas instituciones académicas que tienen recursos y fondos de investigación limitados. Finalmente, reconocemos el uso de un receptor rígido (HDP-2P) en el presente artículo de técnicas y la falta de un entorno solvente / membrana. Sin embargo, queremos enfatizar que realizar acoplamientos moleculares de HDP-2P con varios fosfolípidos utilizando un receptor rígido es el enfoque convencional para realizar estudios de acoplamiento iniciales para identificar un primer paso de estructuras candidatas acopladas que puedan seguirse en el futuro con un receptor flexible una vez que se identifiquen los residuos críticos de aminoácidos dentro del lado catalítico que se unen a los sustratos para centrarse en las regiones moleculares que se pueden flexibilizar en Siga estudios de acoplamiento molecular y en un entorno solvatado. Por lo tanto, aprovechar las colaboraciones con otras instituciones que tienen más recursos puede ser una forma de ayudar a corroborar algunos de los hallazgos iniciales proporcionados por AutoDock e identificar mecanismos moleculares adicionales de las interacciones sustrato-enzima.

En conclusión, los hallazgos de este estudio demuestran que el método de reacción de sustitución de ligandos, que utiliza un ligando encapsulado dentro de liposomas, se puede aplicar de manera efectiva a estudios de permeabilidad de membranas en varios procesos mediados por membranas. Estos incluyen interacciones ligando-receptor, interacciones lípido-proteína, intercambio intermembrana, fusión y fisión de membrana y contracciones neuromusculares, entre otras. Además, este enfoque tiene un potencial significativo para investigar productos farmacéuticos membranotrópicos. Al mismo tiempo, reconocemos que, si bien los métodos novedosos en membranas modelo son invaluables para diseccionar mecanismos específicos de interacciones de membranas, sus simplificaciones inherentes limitan su capacidad para replicar completamente la complejidad estructural, composicional y funcional de las membranas biológicas in vivo. Por lo tanto, es esencial interpretar los datos de los sistemas modelo con precaución y validar los hallazgos utilizando modelos celulares u orgánicos siempre que sea posible.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

Los estudios de este artículo han sido apoyados por la subvención inicial de la Academia Chaoyang KaiWen de Beijing (ESG) y por el Premio SEPA, NIH 5R25MD019151-03 (R.K.D.). El trabajo relacionado con la preparación de HDP-2 fue apoyado por una subvención de la Fundación Rusa de Ciencias No. 24-15-00280 (Y.N.U.). Los autores desean agradecer a la Dra. Maryam Barancheshmeh por escribir el guión y desarrollar el video sobre la aplicación de la simulación de acoplamiento molecular, que se preparó después de la publicación de este artículo de investigación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Subunidad básica HDP-2P del veneno de víbora de V. nikolskii PLA2, HDP-2, pureza 98,5%  Instituto de Química Bioorgánica, MoscúHDP-2 aislado según el potocol en PMID:18083205. HDP-2P purificado de HDP-2 por DEAE Sephadex A-50 y nbsp;  
Cardiolipina (corazón, bovina) (sal sódica), >99%MacklinC916138
Coenzima A, FUJIFILM Wako' s NEFA kit Lexington, MA, EE. UU.
Corte de peso molecular de la membrana celulosa de tubaje de diálisis 1,0 kDaSigma Aldrich Trading Co. Ltd., Shanghái, China y Sigma Aldrich Trading Co.
Termostato de depósito de agua controlado digitalmente YoungGuangMing Medical Instruments Ltd. Co., Pekín, China y nbsp;
Balance analítico electrónico de alta precisión FA2004 Shanghai Maiyi Ltd. Co., China
Espectrofotómetro de alcance UV-visible JingHua 752  Shanghai Jinghua Instruments Co., Ltd., Shanghái, China
L-&alfa;-fosfatidilcolina (Huevo, Pollo), ≥ 95%MacklinL799415
L-&alfa;-fosfatidilinositol (hígado, bovino) (sal sódica), ≥ 99%MacklinL780292
L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (cerebro, porcino) (sal de amonio), ≥ 99%MacklinL996223
L-&alfa;-fosfatidilinositol-4-fosfato (cerebro, porcina) (sal de amonio), 99%MacklinL970250
L-&alfa;-fosfatidilserina (cerebro, porcina) (sal sódica), >99%MacklinL864755
Agitador magnético JB-3 Shanghai Leici JB-3
Medidor de pH PHS-3C Shanghai INESA Scientific Instruments Co., Ltd., China
Microcentrífuga TGL-16B  Shanghai 3 Anting Co., Shanghái, China
Dispensador ultrasónico YT-JY96-IIN Shanghai Yetuo technology Co., Ltd., China
Bomba de vacío TW-1MTingwei Co. Ltd., Wenling, China

Referencias

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Un ensayo de permeabilidad de la membrana liposomal para investigar los efectos de los grupos fosfato de fosfatidilinositol sobre la acción membranotrópica del veneno PLA2
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