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Artículo de método

Un ensayo microscópico de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio para un análisis preciso y fiable de la lesión miocárdica

845 vistas

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DOI:

10.3791/68596

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28 de noviembre de 2025

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1Institute of Molecular Cardiology, Medical Faculty and University Hospital Düsseldorf, Heinrich Heine University of Düsseldorf, 2Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 3Shanghai Key Laboratory of Anesthesiology and Brain Functional Modulation, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 4Clinical Research Center for Anesthesiology and Perioperative Medicine, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 5Translational Research Institute of Brain and Brain-Like Intelligence, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El presente ensayo de cloruro de 2,3,5-Trifeniltetrazolio (TTC) introduce un protocolo de tinción TTC refinado que permite el análisis de lesiones miocárdicas a resolución microscópica, produciendo imágenes de alta calidad que permiten una evaluación precisa y fiable del tamaño del infarto y la viabilidad del cardiomiocito a nivel celular.

Resumen

En este protocolo, presentamos un método refinado basado en cloruro de 2,3,5-Trifeniltetrazolio (TTC) para el análisis preciso y fiable del infarto de miocardio (IM) a resolución celular. Este protocolo consiste en un procedimiento de tinción TTC en dos pasos realizado en corazones infartos a 24 hpost-MI: perfusión, en la que una solución TTC al 1% se perfunde retrogradamente a través de la vasculatura coronaria mediante una cánula aórtica, y la inmersión, donde el corazón se incuba posteriormente en solución TTC a 4 °C durante la noche. Tras la tinción, el corazón se incrusta en compuesto OCT y se criosección transversalmente en cortes de 50 μm de grosor a intervalos de 100 μm. Tras un proceso de fijación de 24 horas con el fijador de Zamboni, se distingue una frontera nítida y clara entre miocardio viable (rojo intenso) y tejido necrótico (amarillo) bajo examen microscópico. Cabe destacar que este ensayo microscópico de TTC permite la detección de infarto no solo en la fase aguda (24 horas tras el IM), sino también durante una ventana de tiempo extendida más allá de 7 días. Debido a que el ensayo microscópico TTC genera imágenes de múltiples capas (80 cortes por corazón), desarrollamos un algoritmo robusto y semiautomatizado basado en color que permite un análisis rápido y eficiente de grandes conjuntos de datos de imágenes y cuantifica el tamaño global del infarto en cuestión de minutos. Con estas mejoras, el enfoque actual refina sustancialmente el proceso de tinción de la TTC y proporciona una herramienta ampliamente aplicable y valiosa para los laboratorios que investigan lesiones isquémicas cardíacas.

Introducción

Durante las dos últimas décadas, la cardioprotección ha seguido siendo una estrategia clave para preservar los cardiomiocitos tras graves insultos isquémicos alcorazón. Tanto en entornos experimentales como clínicos, la extensión final de la lesión miocárdica es una métrica crítica para evaluar la eficacia de las intervencionescardioprotectoras 2. Por tanto, una evaluación fiable y precisa del tamaño del infarto es muy deseable y fundamentalmente importante.

En modelos de roedores, el protocolo estándar para evaluar el tamaño del infarto postmortem se basaba principalmente en la actividad de la deshidrogenasa mitocondrial, que convierte enzimáticamente el compuesto incoloro cloruro 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) en un precipitado rojo en células viables, mientras que permanece gris claro en tejidonecrótico 3. Aunque la tinción basada en TTC es sencilla y rentable, presenta varios desafíos metodológicos y limitaciones intrínsecas. Estos incluyen cortes cardíacos que sufren contractura en solución TTC, que distorsiona gravemente el tejido e impide que los cortes queden planos para planimetría; grosor desigual de corte durante el procesamiento de la muestra; y una mala calidad de imagen que dificulta la delimitación precisa del límite del infarto. En los últimos años, se han introducido varias modificaciones técnicas en el proceso de preparación de la muestra, como el uso de matrices acrílicas de corazón4 o la semicongelación del corazón para facilitar el corte3. Aunque estas modificaciones mejoraron sustancialmente la practicidad del corte tisular, el enfoque convencional sigue basándose en la imagen macroscópica de secciones cardíacas gruesas, produciendo a menudo una calidad de imagen variable y subóptima5, con un contraste de color insuficiente que puede introducir una subjetividad considerable a la medición delinfarto 6. Además, el método convencional requiere el uso de tejido cardíaco completo, lo que impide análisis multipropósito en las mismas muestras de tejido, como la co-tinción inmune de proteínas reguladoras para identificar cascadas clave de señalización implicadas en la supervivencia cardíaca. Como resultado, a menudo se requiere un número considerable de animales para abordar adecuadamente diversas cuestiones de investigación.

Para superar estaslimitaciones 5, desarrollamos un protocolo adecuado para la imagen microscópica de la tinción TTC. Este método combina pasos de tinción "perfusión + inmersión" con criosección del tejido cardíaco en finas láminas optimizadas para la imagen con un microscopio óptico. Aunque este método fue informadorecientemente 7, creemos que proporcionar procedimientos experimentales detallados mejora su practicidad y accesibilidad. Además, dado que el método microscópico TTC genera imágenes de alta resolución que comprenden múltiples capas de secciones cardíacas, desarrollamos un algoritmo semiautomático robusto basado en color para abordar la naturaleza que requiere mucho tiempo analizar grandes conjuntos de datos de imágenes. El método actual permite la detección rápida de regiones del infarto y la cuantificación del tamaño global del infarto en cuestión de minutos.

En general, el protocolo presentado aquí sirve como una herramienta valiosa, permitiendo a los investigadores implementar este método de forma eficiente y con facilidad y precisión.

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Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por el LANUV de Renania del Norte-Westfalen, Alemania, y realizados de acuerdo con las directrices de ARRIVE y la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todo el equipo y productos químicos necesarios están listados en la Tabla de Materiales.

1. Montaje de un sistema de retroperfusión Langendorff

NOTA: El sistema consta de una grifo de paso de dos bandas y tres vías conectada a una cánula aórtica hecha de una aguja embotada calibre 20 y dos puertos de infusión, uno para la solución de lavado (puerto de solución salina tamponada con fosfato (PBS)) y otro para la infusión TTC (puerto TTC). Alternando la dirección del grifo de tres vías, el perfusado puede administrarse al corazón de forma intercambiable.

  1. Fija el aparato horizontalmente sobre una placa de Petri de 150 mm usando un trozo de cinta adhesiva para evitar movimientos no deseados en los pasos posteriores.
  2. Ajusta la punta de la cánula para que quede 1 mm por encima de la base, alineándola con el nivel de la raíz aórtica cuando el corazón esté plano.
  3. Prellena el sistema con PBS bien frío usando una jeringuilla de 10 mL a través del puerto PBS.
  4. Preparar una solución fresca de tinción (1% de TTC disuelto en PBS); se requiere un volumen mínimo de 6 mL para cada corazón.
    PRECAUCIÓN: Intentar concebir se considera generalmente peligroso y requiere un manejo cuidadoso, ya que puede causar irritación leve de la piel, irritación grave en los ojos y es perjudicial si se inhala. Eliminar residuos y residuos de acuerdo con los requisitos de las autoridades locales.
  5. Usa una jeringuilla de 3 mL para prellenar el puerto TTC con la solución de manchas.
  6. Asegúrate de que no haya burbujas de aire accidentales en el sistema, ya que podrían causar émbolos de aire que interferan con manchas posteriores. En la mayoría de los casos, las burbujas de aire son visibles en el sistema; cuando estén presentes, retirarlas retirando y rellenando PBS mientras se golpea suavemente la llave de registro de tres vías en la posición vertical de la cánula.
  7. Forma un nudo suelto de medio cuadrado usando una sutura de seda 6-0 y colócala en el extremo distal de la cánula para fijar después la raíz aórtica.

2. Preparación de muestras de corazón

NOTA: En este estudio se utilizaron ratones C57BL/6J (20-25 g). El infarto de miocardio experimental (IM) se indujo mediante la ligadura quirúrgica de la arteria descendente anterior izquierda (LAD) durante 30-60 minutos, como se describe a continuación. La metodología de inducción de la MI ha sido reportadapreviamente 8 y no está detallada en este manuscrito. Salvo que se indique lo contrario, se recogieron muestras de corazón 24 horas después del infarto.

  1. Sacar al ratón con infarto de la jaula y eutanasiarlo mediante dislocación cervical bajo anestesia profunda de isoflurano (3 %, v/v).
    NOTA: Todos los procedimientos de eutanasia deben estar debidamente documentados e informados, incluyendo el motivo de la eutanasia y el método utilizado, de acuerdo con la normativa local.
  2. Transfiere al animal eutanasiado a la mesa de operaciones y asegure las cuatro extremidades con cinta adhesiva.
  3. Retira el pelo desde la zona media del abdomen hasta la mitad de la pata delantera usando pinzas y tijeras microdisecadoras.
  4. Realizar una incisión transversal de 2 cm en la pared muscular abdominal, justo debajo del diafragma, para permitir la posterior toracotomía.
  5. Abre el diafragma con tijeras finas para exponer el corazón, luego realiza incisiones bilaterales a través de la piel, músculo y costillas para abrir la cavidad torácica.
  6. Corta el diafragma bilateralmente y expone completamente el corazón levantando el esternón.
  7. Inmediatamente vierte 20 mL de PBS bien frío sobre la superficie del corazón para detener el latido.
  8. Extirpe el corazón junto con los tejidos circundantes (pulmones y esófago) y transfiere la masa tisular a un vaso de precipitados de 50 mL que contiene PBS helado durante aproximadamente 1 minuto para permitir que el latido disminuya.
  9. Transfiere el corazón a una placa de Petri de 150 mm y recorta la raíz aórtica para que no tenga tejido conectivo bajo un microscopio binocular usando pinzas finas y tijeras.
  10. Retira suavemente el timo y expone la aorta ascendente.
  11. Recorta la raíz aórtica diseccionando el tejido conectivo.
  12. Recoge el muñón aórtico con pinzas finas y colócalo sobre la cánula que ya está conectada a un aparato de perfusión prellenado con PBS y solución de tinción para TTC. Utiliza pinzas finas para estabilizar la pared de la raíz aórtica durante la inserción.
  13. Asegura la aorta usando el nudo suelto preformado en la cánula. Inspecciona cuidadosamente la cánula y el corazón mientras se re-perfunden con PBS. El llenado del corazón puede confirmarse visualmente por la protuberancia del ventrículo a medida que aumenta el volumen de PBS que entra en el corazón.
  14. Deja los tejidos extracardíacos (pulmones y esófago) en su lugar para apoyar el corazón en una posición natural y adecuada.

3. Tinción TTC

  1. Cubre el corazón con papel de seda húmedo una vez que la canulación esté asegurada.
  2. Comienza a enjuagar el corazón con una jeringuilla preconectada de 10 mL llena de PBS bien fría a una dosis de 2-3 mL/min durante 3 minutos, hasta que el eluado cardíaco se desvaje. Esto garantiza que solo quede una cantidad mínima de sangre en el corazón y los infarros. Durante este paso, evita la presión excesiva durante la perfusión, ya que puede provocar la ruptura del ventrículo infarto.
  3. Inspecciona el corazón con un microscopio binocular para asegurarte de que no hay fugas en la raíz aórtica y que se infla correctamente bajo presión de perfusión.
  4. Gira la grifo de tres vías hacia la solución TTC e infunde lentamente 1 mL de solución de tinción a través del puerto TTC durante 30 s.
  5. Reinfundir 1 mL de solución para intentar concebir 5 minutos después y repite este paso una vez más después de otros 5 minutos (10 minutos después de la primera infusión para intentar concebir). Se requieren un total de 3 mL de solución para intentar concebir el embarazo en 3 infusión durante 15 minutos.
  6. Inspecciona la superficie del corazón con un microscopio binocular. En este punto, ya debería ser visible una distinción clara entre el tejido viable de miocardio (rojo intenso) y el tejido necrótico (gris claro).
  7. Retirar todos los tejidos no cardíacos con tijeras finas y transferir el corazón manchado a un tubo cónico de 15 mL que contiene 3 mL de solución para concebir.
  8. Coloca el tubo cónico a 4 °C durante la noche para una segunda ronda de tinción por inmersión.

4. Preparación de bloqueos tisulares

  1. Saca el corazón del tubo cónico y sécalo cuidadosamente con papel de seda. En este punto, la tinción en el miocardio viable se vuelve más pronunciada, y el miocardio no perfundido (regiones epicárdica y potencialmente endocárdica) también muestra tinción roja clara.
  2. Llena una cánula curva y roma de calibre 20 con compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) usando una jeringuilla de 1 mL.
  3. Extirpe la válvula tricúspide con tijeras finas e inserta la cánula en el ventrículo derecho.
  4. Llena la cavidad con compuesto OCT (aproximadamente 50-80 μL) y detén la infusión cuando se observe reflujo de residuos.
  5. Expone la válvula mitral e inserta la cánula a través de la aurícula izquierda y la válvula mitral hasta el ventrículo izquierdo.
  6. Infundir suavemente la cavidad con compuesto OCT (aproximadamente 80 μL) y detener la infusión cuando se observe la salida de la aorta.
  7. Prepara una pequeña cápsula cilíndrica (de 1 cm de diámetro) hecha de papel de aluminio y llénala con 300 μL de compuesto OCT.
  8. Coloca cuidadosamente el corazón en la cápsula en posición de ápice hacia abajo y ajusta la posición vertical. Desde la vista cenital, el vértice no debe sobresalir excesivamente hacia ninguno de los lados.
  9. Sumergir la cápsula en una solución de 2-metilbutano preenfriada a -30 °C a -40 °C.
  10. Deja que la muestra permanezca en la solución durante 5-10 minutos para solidificarse antes de formar un bloque tisular.
  11. Etiqueta el bloque tisular y guárdalo a -80 °C para un análisis histológico adicional.

5. Criosección y fijación

  1. Monta el bloque de tejido sobre un mandril criostatic usando compuesto OCT.
  2. Coloca el mandril en el criostato y ajusta la temperatura aproximadamente a -24 °C.
  3. Corta el bloque tisular hasta que el ápice sea visible.
  4. Ajusta el grosor de la sección a 50 μm y recoge cada segundo corte, resultando en intervalos de 100 μm entre cortes.
    NOTA: Evita el plegamiento de tejidos durante la criosección. Esto se minimiza en gran medida rellenando las cavidades ventriculares vacías con compuesto OCT (véanse los pasos 4.4-4.6).
  5. Alinea las rodajas secuencialmente sobre láminas de microscopio de vidrio, colocando ocho piezas por lámina. En total, se esperan 80 secciones, es decir, 10 diapositivas por corazón.
  6. Seca las correderas con un secador de pelo en la configuración más baja usando el flujo de aire a temperatura ambiente (sin necesidad de calefacción) durante aproximadamente 10 minutos.
  7. Sumergir las láminas en una cámara de tinción llena de solución de Zamboni (un fijador que contiene un 2% de paraformaldehído y 0,4% de ácido pícrico, w/v).
    PRECAUCIÓN: El fijador de Zamboni puede causar una reacción alérgica cutánea y se sospecha que causa defectos genéticos y carcinogénesis. Eliminar los residuos y residuos conforme a la normativa de las autoridades locales.
  8. Fija el tejido cardíaco a 4 °C durante la noche. Esta fijación a largo plazo garantiza que la superficie del tejido cardíaco permanezca libre de burbujas de aire formadas durante el proceso de fijación.
  9. Después de fijar, saca las láminas del fijador y enjuágalas tres veces con PBS.
  10. Monta las correderas con medio de montaje y cubre las secciones con coberturas. Tras este paso, las diapositivas del corazón están listas para la adquisición de imágenes.
  11. Guarda las muestras en una caja de diapositivas a temperatura ambiente.
    NOTA: Como los precipitados de formazan son insolubles en agua, la tinción puede conservarse durante años sin pérdida de intensidad.

6. Imagen y procesamiento

  1. Monta un microscopio óptico usando un objetivo de 1,25x y ejecuta el software CellSens para la imagen.
  2. Coloca la sección del corazón en el centro del campo de visión.
  3. Ajusta el tiempo de exposición, el enfoque y el balance de blancos de la cámara según sea necesario.
  4. Captura imágenes de cada sección y guarda todas las imágenes del mismo corazón en una carpeta dedicada.
  5. Copia el script R (Archivo Suplementario 1) a la plataforma RStudio y ejecuta un algoritmo automatizado basado en R para evaluar MI. El algoritmo calcula los tamaños planimétricos de los infartos para cada corte y calcula el volumen total del infarto para todo el corazón.
  6. Exporta el conjunto de datos a un archivo de Excel y analiza los datos según sea necesario.
  7. Importa todas las imágenes de cada corazón a la plataforma ImageJ para su posterior reconstrucción 3D.
  8. Apila todas las imágenes en un orden coherente y secuencial usando el menú emergente de la plataforma ImageJ.
  9. Crea una construcción 3D usando la función de gráfico de superficie.
  10. Abre la ventana del Visor de Volumen y ajusta todos los parámetros para proyección 3D.
    NOTA: La metodología para inmunohistoquímica9 y los vídeos para la tinción convencionalTTC 4,5 ya se han informado previamente y no están incluidos en este manuscrito.

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Resultados

Los pasos clave implicados en la realización de la tinción microscópica TTC se ilustran en la Figura 1. Tras dos rondas de tinción TTC, se hizo visible un patrón distintivo de punzones en la superficie del corazón. El corte serial de todo el corazón a intervalos de 100 μm produjo aproximadamente 80 secciones de tejido, con el sitio de ligadura situado alrededor del corte 60. En cada sección, la tinción roja intensa...

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Discusión

El infarto de miocardio (IM), resultado de una isquemia miocárdica prolongada, sigue siendo una preocupación sanitaria global importante, ya que la lesión isquémica a menudo afecta la función contráctil del corazón necesaria para una circulación sanguínea eficaz. En las últimas décadas, se han dedicado esfuerzos significativos a identificar intervenciones o compuestos que mejoren la resistencia cardíaca al estrésisquémico 1. Aunque se han explorado extremos sustit...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por FoKo 23/2013 y por el Instituto de Investigación Cardiovascular de Düsseldorf (CARID).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Objetivo 1,25xOlimpoPlanApo 1.25X/0.04Imagen
Jeringueras de 10 mLB.Braum4617100VRetroperfusión
Cloruro 2,3,5-trifeniltetrazolioMilipore1.08380.0100Productos químicos
Cánula de 20 GBD305895Retroperfusión
3  ML JerringersB.Braum4617022VRetroperfusión
Grifo de paso de 3 víasB.Braum16494CRetroperfusión
Aquamount y Aquamount;BDH362262HCirosección
EquilibrioOhausN/APesaje de productos químicos
Microscopio binocularLeicaMZ6Canulación
C57BL/6JJanvierN/AAnimales
CámaraOlimpoUC30Imagen
Hojas de cubiertaEprediaBB02400500A113MN20Cirosección
CriostatoLeicaM850Cirosección
Agua doble destiladaMIliporeN/AProductos químicos disolventes
Tijeras finas de disecciónAESCULAPBC702RInstrumentos quirúrgicos
Pinzas microdiseccionables finas  AESCULAPFM001RInstrumentos quirúrgicos
Láminas de microscopio de vidrioEngelbrecht11102Cirosección
ImageJNIH1,54gProcesamiento de imágenes
IsofluranoPiramal14150097146754Productos químicos
IsopropanolRoth  0733.1Productos químicos
Microscopio ópticoOlimpoBX61Imagen
Microdisección de pinzas y nbsp;F.S.T11152-10Instrumentos quirúrgicos
Compuesto OCTSakura4583Productos químicos
Placa de PetriTherno Scientific172931Retroperfusión
Solución salina tamponada con fosfatoRoth9143.1Productos químicos
RstudioPosit Software2024.09.0Procesamiento de imágenes
Sutura de sedaF.S.T18020-60Retroperfusión
SoftwareOlimpoCellSens V3.2Imagen
Tijeras de acero inoxidable para diseccionarAESCULAPBC257RInstrumentos quirúrgicos
Solución de ZamboniMorphisto12773.0050Productos químicos

Referencias

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