Artículo de método

Hibridación in situ de ARN con inmunofluorescencia secuencial de proteínas en ensayo en tándem

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DOI:

10.3791/68615

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10 de octubre de 2025

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1Department of Hematopoietic Biology & Malignancy, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Melanoma Medical Oncology Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 5Department of Veterinary Medicine & Surgery, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo detalla la hibridación in situ de ARN con inmunofluorescencia secuencial de proteínas en tejido en una plataforma automatizada para caracterizar múltiples ómicas espaciales a nivel celular dirigido.

Resumen

La funcionalidad de las células dentro de un huésped no depende de señales aisladas. En cambio, todos los componentes, desde las moléculas de ARN más pequeñas hasta las proteínas más grandes, deben operar en armonía y coordinación dentro del cuerpo humano. Como tal, la importancia de los enfoques que integran las investigaciones espaciales a nivel celular en múltiples ómicas es primordial para comprender las interacciones célula-célula y la progresión de la enfermedad. La disección del proteoma y el transcriptoma en el mismo ensayo espacial nos ayuda a comprender cómo no solo se le indica a una célula que lleve a cabo (ARN), sino también cómo ejecuta esas instrucciones en el contexto del nicho microambiental en el que se encuentra (proteína). Este manuscrito se centra en la integración de la inmunofluorescencia secuencial (SeqIF) con la hibridación in situ de ARN (ISH) con un sistema impulsado por microfluidos en tejidos para la investigación de proteínas y ARN de alto rendimiento en un contexto espacial (seqRNA-ISH + seqIF) que permitirá agregar hasta 12 dianas de ARN y 24 proteínas en una sola ejecución con dianas proteicas adicionales posibles a través de Ejecuciones secuenciales. Este método proporciona una plataforma multiómica dirigida secuencial que no requiere consideración de compatibilidad de fluoróforos y una optimización extensa para un plexing más alto. Esto permite comprender qué mensajes está preparando o enviando la célula a su microambiente. Este enfoque dirigido ayuda a validar los métodos de transcriptoma completo mientras examina las interacciones entre el ARN y las proteínas de una manera más precisa.

Introducción

El complejo funcionamiento de las células dentro del cuerpo humano se basa en una intrincada interacción de señales, desde pequeñas moléculas de ARN hasta proteínas grandes, todas trabajando en coordinación1. Esta interacción subraya la importancia de los enfoques integradores que examinan las interacciones espaciales a nivel celular en varias capas ómicas 2,3. Tales metodologías son esenciales para comprender las complejidades de las interacciones célula-célula y la progresión de la enfermedad. Muchos métodos tradicionales, como la citometría de flujo4 y la secuenciación unicelular5, los aislados celulares se utilizan para investigar muestras desagregadas para identificar proporciones a granel de fenotipos presentes dentro de una muestra específica. Sin embargo, aislar las células para el análisis puede inducir activación o cambios fenotípicos que pueden no reflejar con precisión su biología y función nativas in situ6. Los métodos avanzados en biología espacial ofrecen nuevas estrategias para estudiar las células y su microambiente sin comprometer el contexto de la arquitectura tisular y las relaciones espaciales con las células vecinas en múltiples tipos moleculares 2,7.

La integración de análisis de transcriptoma y proteoma dentro del mismo ensayo espacial, sin aislar células individuales, ofrece una visión completa de la función celular8. Este método se basa en métodos de hibridación insitu fluorescente de ARN de una sola molécula (FISH), pero no incluye digestiones de proteinasas que complican las interrogaciones secuenciales de proteínas8. La flexibilidad del enfoque que se utilizará en una sola sección proporciona una mayor resolución espacial y menos procesamiento de imágenes para integrar y alinear secciones. Este enfoque proporciona información tanto sobre las instrucciones recibidas por una célula (ARN) como sobre su ejecución (proteína) dentro de su nicho microambiental específico. Al combinar estas capas de información, los investigadores pueden obtener una visión más profunda del comportamiento y la comunicación celular.

Si bien existen métodos manuales, los avances recientes en las tecnologías ómicas espaciales han permitido análisis más complejos con un mayor número de marcadores proteómicos examinados mediante multiplexación manual9. Estos enfoques han incluido avances en ensayos de proteínas y ARN-ISH 10,11,12,13,14, y metodologías automatizadas que requieren anticuerpos conjugados específicos del sistema 15,16,17, citometría de masas de imágenes (IMC)18,19,20 y otras metodologías proteómicas secuenciales fluorescentes automatizadas que utilizan antibodías primarios y secundarios listos para usar 2,21,22. Estas tecnologías han facilitado la proteómica o la transcriptómica y proteómica combinadas utilizando enfoques dirigidos y, por lo general, visualizan tanto el ARN a través de sondas como las proteínas a través de anticuerpos basados en conjugados similares, lo que permite detectar conjuntamente ARN y proteínas simultáneas o secuenciales utilizando la misma metodología o instrumentos. Al proporcionar una visión integral de la actividad celular, este tipo de enfoques tienen como objetivo mejorar nuestra comprensión de la comunicación celular entre las células y su microambiente. Ofrece una herramienta valiosa para descifrar las complejidades de la interacción celular, revelando potencialmente nuevos conocimientos sobre los procesos fisiológicos normales y los mecanismos de la enfermedad.

Este protocolo proporciona orientación para integrar la hibridación in situ de ARN (ISH) con inmunofluorescencia secuencial (SeqIF) con un sistema impulsado por microfluidos en tejidos. Esto proporciona una herramienta de alto rendimiento para la investigación de ARN y proteínas dentro de su contexto espacial nativo. Este método (seqRNA-ISH + seqIF) permitirá hasta 12 objetivos de ARN y 24 proteínas en una sola ejecución, con la posibilidad de agregar objetivos de proteínas adicionales a través de ejecuciones secuenciales. Si bien este protocolo se centra en un sistema microfluídico específico, el manejo de tejidos, la garantía de calidad del ARN y las pautas de selección y titulación de anticuerpos proporcionadas se pueden adaptar a otras metodologías. Sin embargo, este método utiliza la recuperación de antígenos de pH 9.0 para una recuperación eficiente de epítopos sin proteasa, mejorando la estabilidad proteómica al tiempo que proporciona una transcriptómica dirigida, a diferencia del ARN-ISH tradicional a pH 6.0 con proteasa para aumentar la accesibilidad de la sonda de ARN pero no conserva el proteoma8. El método seqRNA-ISH+seqIF se describe visualmente en la Figura 1, demostrando la amplificación de ARN FISH seguida de escisión antes de utilizar un método de emparejamiento de anticuerpos primario-secundario que utiliza una eliminación química suave de primarios y secundarios. La naturaleza secuencial del seqIF y la detección supera muchas de las limitaciones relacionadas con la compatibilidad de fluoróforos mediante el uso de metodologías secuenciales23. Esto reduce la necesidad de una amplia optimización necesaria en la tinción simultánea en metodologías de alta plexación que requieren compensación por superposición espectral23.

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Protocolo

Este protocolo utiliza secciones de tejido fijado en formol e incluido en parafina (FFPE) recolectadas de pacientes con carcinoma de ovario seroso de alto grado sin tratamiento previo que se sometieron a cirugía citorreductora primaria. Todos los datos clínicos se obtuvieron del repositorio de cáncer de ovario del Departamento de Oncología Ginecológica y Medicina Reproductiva bajo protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional del MD Anderson de la Universidad de Texas. El personal de recepción obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes y los estudios se realizaron de acuerdo con pautas éticas reconocidas.

NOTA: Todos los reactivos, a menos que se indique lo contrario, se diluyen en agua desionizada sin nucleasas.

1. Arreglar e incrustar muestras

NOTA: La elección del fijador y la duración de la fijación tiene un fuerte impacto en el rendimiento de los ensayos y, en general, los ensayos espaciales se realizan con mayor frecuencia con FFPE, ya que preserva la arquitectura patológica. Este protocolo describe el uso de tejido FFPE, por lo que se sugiere el siguiente protocolo para muestras de tejido FFPE. Sin embargo, la calidad del ARN se ve afectada por los procesos de fijación, al igual que los epítopos proteicos, pero en menor medida. Estos métodos de fijación, la fijación incompleta y la degradación de la muestra pueden aumentar la unión no específica en la proteómica basada en anticuerpos. En tercer lugar, la fluorescencia constitutiva generalmente se apaga durante el procesamiento de FFPE, pero algunos fluoróforos persistirán moderadamente y requerirán pruebas para asegurarse de que se enfríen.

  1. Seccionar el tejido hasta un grosor de ≤ 5 mm para asegurar una fijación uniforme y evitar las barreras de difusión inducidas por la grasa. Fije inmediatamente las secciones en formalina tamponada con fosfato al 10% (pH 7,0) a 4 °C durante 24 h para optimizar el ARN y la proteína24.
  2. Procese los tejidos fijados en un procesador de tejidos o procese manualmente siguiendo los siguientes pasos
    1. Deshidrate secciones de tejido en etanol de grado molecular en agua libre de nucleasas de (70%, 75%, 95% 2x, 100% 3x durante 1 h cada una).
    2. Luego, sumerja el tejido en xileno 2 veces durante 1 h cada una a temperatura ambiente (~ 23 ° C).
  3. Calienta la cera de parafina a 60 °C. Sumerja la caja de pañuelos en cera de parafina 2 veces durante 1 hora cada una.
  4. Coloque el pañuelo inflado y oriente los tejidos en el molde, llénelo con cera de parafina fresca y enfríe rápidamente a 4 ° C25.
    NOTA: Los mejores resultados para el ARN se obtendrán completando todos los pasos dentro de las 48 h.

2. Evaluación de la calidad del ARN

  1. Utilice tres secciones en serie, ejecutando las tres diapositivas en paralelo o ejecutando diapositivas de control antes del panel objetivo para asegurarse de que el bloqueo sea suficiente. Las sondas de control positivo emparejadas se dirigen a los genes de mantenimiento para evaluar la calidad del tejido y la integridad espacial en todo el tejido, que pueden verse afectadas por las diferencias de perseverancia. Los controles comúnmente utilizados incluyen UBC (un gen de alta expresión), PPIB (expresión moderada) y POLR2A (baja expresión)26. Utilice conjuntos de sondas de control negativo, como Dab1 (un ARN de bacterias del suelo) en cada canal de detección. Opcionalmente, incluya todas las sondas de control positivo y negativo en la misma muestra junto con las sondas de destino. En esta configuración, coloque los controles negativos Dab1 en los canales T2-T4, asigne controles positivos de menor a mayor expresión a T1, T5 y T9, y asegúrese de que las sondas de destino ocupen los canales restantes.
    OPCIONAL: Además, para muestras con calidad de ARN desconocida, puede ser útil determinar un valor de distribución 200 (puntuación DV200). Se recomiendan encarecidamente puntajes DV200 de más de 30, y se prefieren muestras de mayor calidad de 50 o más27. Esta puntuación es una indicación de la calidad del ARN, y una mayor calidad de la muestra aumenta la probabilidad de que el ARN-ISH funcione eficazmente27.

3. Precauciones y preparativos de ARN

NOTA: Es una buena práctica descontaminar el área de RNasas y limpiarla y luego rociar el área de trabajo con etanol al 70% antes de procesar, además de usar un área libre de RNasa, siempre use guantes limpios, una bata de laboratorio y una máscara para minimizar la introducción de RNasas de la piel o el aliento. Use solo agua y consumibles sin ARNasa y evite meter la mano en las bolsas de suministro. Estas precauciones, así como mantener los tejidos / portaobjetos fríos y secos, son esenciales para mantener la integridad del ARN durante los experimentos.

  1. Corte las secciones en portaobjetos de vidrio cargados positivamente con un micrótomo y coloque la región de interés en el centro del portaobjetos, que coordina con el área de la imagen (varía según el sistema; aquí, es de aproximadamente 12,5 mm x 12,5 mm).
    NOTA: Tenga en cuenta que el grosor ideal para cada sección es de entre 4 y 6 μm para los tejidos FFPE.
  2. Hornee los portaobjetos FFPE en un horno seco sin ARNasa, con el tejido hacia arriba, a 60 °C durante un mínimo de 1 h y hasta toda la noche para tejidos grasos o tejidos que de otro modo serían propensos a desprenderse.
  3. Pretratamiento OPCIONAL
    NOTA: Si bien el pretratamiento es opcional, ciertos pasos son opcionales adicionalmente como se describe a continuación.
    1. Prepare peróxido de hidrógeno al 3%: En un tubo cónico de 50 ml, agregue 5 ml de peróxido de hidrógeno al 30% a 45 ml de 1x PBS. Guarde el peróxido de hidrógeno restante a temperatura ambiente (~ 23 ° C), la tapa asegurada con parafilm, hasta por tres meses.
      NOTA: El peróxido de hidrógeno es un oxidante fuerte. Manténgase alejado de materiales combustibles, fuentes de calor y metales. Úselo en un área de campana extractora de productos químicos con equipo de protección personal (EPP; p. ej., gafas, guantes y bata de laboratorio). Evite el contacto con la piel, los ojos y la inhalación. Enjuague la piel con agua durante 15 minutos si está expuesta. Busque ayuda médica si se ingiere o inhala. Las concentraciones más altas pueden causar quemaduras graves y pueden encenderse o explotar con materiales orgánicos o ciertos metales. Siempre agregue peróxido de hidrógeno al agua para evitar reacciones violentas.
    2. Prepare formaldehído al 3,7%: En una campana extractora química, agregue 1 ml de formaldehído al 16% por 3,3 ml de 1x PBS. Guarde el formaldehído envuelto con parafilm hasta por tres meses.
      NOTA: El formaldehído puede causar daño ocular grave, irritación respiratoria y se sospecha que causa cáncer. La exposición prolongada o repetida puede provocar sensibilización cutánea y reacciones alérgicas. Úselo solo en una capucha para gases químicos y use el EPP adecuado (guantes, gafas/protector facial, máscara, bata de laboratorio, etc.). Evite el contacto con la piel, el contacto visual y la inhalación. Mantener alejado de fuentes de calor y llamas abiertas. Deseche el paraformaldehído y los materiales contaminados como desechos peligrosos, y solo prepare la cantidad necesaria para su uso inmediato si es posible.
    3. Desparafinar lavando el portaobjetos de tejido colocándolo en tubos cónicos de 50 ml que contienen lo siguiente: Xileno (40 ml) durante 3 lavados de 5 min cada uno en una campana extractora química.
      OPCIONAL: En lugar de xileno, se puede usar un agente de aclarado histológico sin base de xileno, pero potencialmente dejará residuos de parafina y afectará la calidad de la imagen. Esto implica colocar las rodajas en tubos cónicos de 50 ml que contienen lo siguiente: Agente de aclarado histológico sin base de xileno (40 ml) durante dos lavados de 15 min cada uno. Las secciones de bloques que están hechas con cera de abejas pueden ser difíciles de desparafinar con no xileno. Para mezclas desconocidas de cera / parafina, se recomienda usar xileno con las precauciones de seguridad correctas. El xileno es una sustancia peligrosa e inflamable, y la exposición prolongada puede causar daño al sistema nervioso central, el hígado y los riñones. Úselo solo en una campana extractora de productos químicos y use EPP (p. ej., guantes, máscaras y batas de laboratorio). Deseche el xileno y los materiales contaminados como desechos peligrosos. En caso de exposición, busque atención médica inmediata.
    4. Rehidratar lavando el portaobjetos de tejido colocándolo en un tubo cónico de 50 ml que contenga lo siguiente: etanol al 100% (40 ml) durante 2 lavados durante 3 minutos cada uno; etanol al 95% (40 ml) para 2 lavados de 3 min cada uno; etanol al 70% (40 ml) para 2 lavados de 3 min cada uno; etanol al 50% (40 mL), para 2 lavados de 3 min cada uno; etanol al 30% (40 ml) para 2 lavados de 3 min cada uno; 1x lavado PBS (40 mL) para 1 lavado a 2 min.
    5. La peroxidasa bloquea el tejido colocándolo en una cámara de humedad a temperatura ambiente (~23 °C) y cubriendo el tejido con aproximadamente 100-200 μL de peróxido de hidrógeno al 3%, durante 1 lavado a los 10 min y luego lavando el tejido con 1x PBS wash (40 mL), durante 2 lavados a 2 min cada uno.
      NOTA: El bloqueo de la peroxidasa es opcional y apaga las enzimas peroxidasas residuales en el tejido para reducir la tinción inespecífica y puede reducir la autofluorescencia del tejido. Esto es especialmente importante para los tejidos con alta autofluorescencia, como la médula ósea, el riñón, el hígado, el pulmón, el intestino y el cerebro, donde las señales de fondo fuertes pueden interferir con las imágenes en las bandas de emisión TRITC y FITC 28,29,30,31,32.
    6. Realice la fijación con formaldehído colocando el tejido en una cámara de humedad a temperatura ambiente y cubriendo el tejido con aproximadamente 100-200 μL de formaldehído al 3,7%, durante 1 lavado a 10 min, luego lave el tejido con 1x PBS wash (40 mL), durante 2 lavados a 2 min cada uno.
      NOTA: Este paso es opcional, pero se recomienda para tejidos con alto contenido de grasa u otros tejidos que tienen problemas para adherirse a los portaobjetos de vidrio.

4. Recuperación de antígenos

NOTA: El método de desparafinado y recuperación de antígenos recomendado y descrito aquí difiere del método recomendado para seqRNA-ISH + seqIF por el fabricante, que utiliza un dispositivo de recuperación de antígenos de calor controlado de gran capacidad.

  1. Recuperación de antígenos inducida por calor (HEIR) mediante microondas
    1. Usando un microondas con temperatura controlada, agregue suficiente solución tampón HEIR de pH 9.0 disponible comercialmente (aproximadamente 250 ml) para cubrir los portaobjetos en el soporte del portaobjetos debajo del termómetro, si corresponde.
      NOTA: La recuperación de antígenos para ARN generalmente se realiza a pH 6.0, sin embargo, las siguientes metodologías son para pH 9.0 para una mayor eficiencia de unión de anticuerpos.
  2. Inserte los portaobjetos en una solución tampón en el microondas y contrarreste las cámaras vacías, si corresponde, con agua destilada doble. Caliente los portaobjetos en el microondas durante 15 min a 107 °C (el tiempo total suele ser de 30 min para que el tampón HEIR alcance la temperatura).
  3. Enfríe los portaobjetos colocándolos debajo de una campana extractora química a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos.
  4. Lavar portaobjetos en 1x PBS en un tubo cónico de 50 ml (40 ml), durante 1 lavado durante 2 min.
  5. Almacene los portaobjetos en un sobre para portaobjetos con tapón de rosca o en un tubo cónico de 50 ml lleno de 1x PBS (o un tampón multitinción comercial) y proceda inmediatamente, o guárdelo a 4 °C durante un máximo de 7 días, pero idealmente menos de 72 h antes de continuar con seqRNA-ISH+seqIF.

5. Preparar soluciones madre

  1. Preparación de tampón de imágenes de ARN 40x
    1. Prepare un tampón de imágenes de ARN 40x combinando 400 mg de tampón de imágenes de ARN en polvo y 25 ml de agua desionizada libre de nucleasas
    2. Agite la solución resultante hasta que se disuelva por completo y posteriormente alícuota en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (1 ml por tubo)
    3. Congele y almacene a -20 °C durante un máximo de tres meses, evitando los ciclos de congelación y descongelación.
  2. Preparar 20x tampón de citrato de sodio y solución salina (SSC)
    1. Disuelva 157,3 g de cloruro de sodio (NaCl) y 88,2 g de citrato de sodio (Na3C6H5O7) en 800 ml de agua desionizada libre de nucleasas.
    2. Mida el pH y ajuste su valoración a pH 7,0 gota a gota con ácido clorhídrico (HCl) 1 M.
    3. Autoclave para esterilizar.
      NOTA: El SSC estéril 20x también se puede comprar en diferentes compañías. Después de abrir, almacenar a temperatura ambiente a 4 °C.
    4. Prepare 4 tampones de SSC combinando 1 ml de 20 existencias de SSC con 4 ml de agua desionizada sin nucleasas

6. ARN-ISH secuencial + inmunofluorescencia secuencial

NOTA: Todos los pasos descritos en este documento están adaptados del protocolo del fabricante para el seqRNA-ISH + seqIF descrito en la Tabla de materiales, como tal, la mayoría de los reactivos se identifican como reactivos comerciales compatibles con el sistema. Estos reactivos son identificados y/o proporcionados por el fabricante y diseñados para ser compatibles con el sistema. Las modificaciones son posibles y se describen en la discusión, pero pueden requerir pruebas adicionales y lavado de fluidos para evitar la acumulación. El software calculará el volumen total de reactivos necesarios después de que se hayan diseñado e ingresado el panel y el protocolo. Sin embargo, se presentan las modificaciones recomendadas. El volumen total siempre variará en función del número de ciclos y objetivos que se utilicen por protocolo. Sin embargo, el sistema no calculará las diluciones de anticuerpos y ARN-ISH a menos que cada combinación individual se ingrese como un elemento único en la base de datos. Para este protocolo, se requieren 400 uL de cóctel de anticuerpos por portaobjetos de muestra.

  1. Preparación del sistema
    1. Antes de seqRNA-ISH + seqIF, enjuague bien todos los microfluidos con agua libre de nucleasas.
    2. Rocíe fuera del sistema con una solución de descontaminación de ARNasa, seguida de etanol al 70%.
  2. Preparar reactivos generales
    1. Tampón de lavado: 50 ml de tampón multitinción comercial compatible con el sistema 20x + 950 ml de agua desionizada libre de nucleasas
    2. Agua: 100 mL de agua desionizada libre de nucleasas.
    3. Etanol: 100 mL de etanol al 70%.
    4. Tampón de imágenes: 16 ml de solución de imágenes comercial compatible con el sistema 10x + 140 ml de agua desionizada libre de nucleasas + 4 ml de material de imágenes comercial compatible con el sistema.
    5. Tampón de elución: 152 de sistema compatible, comercial, solución de elución 1 + 8 de sistema compatible, comercial, solución de elución 2
    6. Tampón de enfriamiento: 130 ml de agua desionizada libre de nucleasas + 14 ml de solución de enfriamiento comercial compatible con el sistema 1 + 16 ml de solución de enfriamiento comercial compatible con el sistema 2.
  3. Preparación de reactivos de tinción para el protocolo ARN-ISH
    NOTA: Este paso se puede completar la noche anterior y almacenar a 4 °C en la oscuridad. Si bien las recomendaciones del fabricante establecen que las sondas agrupadas se pueden usar hasta por un año, no se recomienda agrupar las sondas con más de una semana de anticipación debido a problemas de contaminación. Para las sondas, es mejor golpear o pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclarlas y centrifugarlas suavemente para que giren hacia abajo antes de su uso.
    1. Cargue una solución de permeabilización libre de proteinasa, comercial y compatible con el sistema a 500 μl por portaobjetos en un tubo de microcentrífuga compatible con el sistema.
    2. Amplificadores de ARN-ISH de grupo basados en ciclo (Tabla 1) para un total de 500 μL por portaobjetos por cada uno de los siguientes en un tubo de microcentrífuga compatible con el sistema: i) árboles de cola ZZ para las colas T1 a T4, ii) árboles de cola ZZ para las colas T5 a T8, iii) árboles de cola ZZ para colas T9 a T 12.
    3. Fluoróforos específicos para árboles de cola de piscina, coincidencia de amplificadores, para un total de 500 μL por portaobjetos por cada uno de los siguientes en un tubo de microcentrífuga compatible con el sistema: i) Fluoróforo para el árbol T1 a T4, ii) Fluoróforo para el árbol T5 a T8, iii) Fluoróforo para T9 a T 12.
      NOTA: Este paso es sensible a la luz
    4. Preparar 1 ml de una dilución 1:200 de DAPI comercial (concentración madre de 1 mg/ml) en tampón multitinción comercial hecho con agua desionizada libre de nucleasas por portaobjetos
      NOTA: El procedimiento se realizó de acuerdo con el fabricante, que incluye DAPI como parte de los reactivos estándar. Si se utilizan formulaciones personalizadas de DAPI diluidas en N,N-dimetilformamida (DMF), las diluciones pueden variar y será necesario realizar pruebas de valoración. Sin embargo, se recomienda utilizar una concentración de alrededor de 1:1000-1:2000 de una concentración de stock de 1 mg/ml. Por lo general, esto es a una concentración más alta de lo normal que los protocolos de tinción manual, ya que debe durar a través de múltiples rondas de imágenes y extracción. Las formulaciones DAPI recién hechas en DMF tienden a ser más brillantes que las formulaciones DAPI disponibles comercialmente. Los reactivos con formamida, como DAPI, deben asignarse bajo una campana de gases químicos. La formamida puede causar toxicidad reproductiva y daño a los órganos y se sospecha que es cancerígena. Utilice el EPP adecuado (p. ej., guantes y bata de laboratorio).
    5. Prepare el tampón de imágenes de ARN-ISH inmediatamente antes de su uso con agua desionizada libre de nucleasas 12.125, 1,5 ml de tampón de imágenes B 10x y 275 μL de tampón de imágenes A 40x (descongelado o recién hecho)
    6. Prepare hasta 10 pares de anticuerpos primarios (los anticuerpos de proteínas primarias se describen en la Tabla 2) para seqIF de acuerdo con diluciones probadas de titulación en tampón multitinción comercial para un total de 400 μL por portaobjetos en un tubo de microcentrífuga compatible con el sistema. Asegúrese de que cada ciclo de seqIF contenga solo un anticuerpo primario por especie huésped.
    7. Preparar fluoróforos secundarios (Tabla 3) más DAPI de acuerdo con las combinaciones de anticuerpos primarios en el paso 6.3.7 para seqIF de acuerdo con las diluciones probadas de valoración. Diluir en tampón multitinción a un total de 400 μL por ciclo en un tubo cónico de 50 mL con un mínimo de 1 mL de volumen muerto. Las concentraciones de ejemplo para los anticuerpos secundarios de Alexa Fluor y DAPI son las siguientes: dilución 1:200 para Alexa Fluor 555, dilución 1:400 para Alexa Fluor 647, dilución 1:1800 para DAPI (de 1 mg/ml de DAPI en DMF)
      NOTA: Este paso es sensible a la luz. La adición de DAPI a los secundarios no está de acuerdo con el protocolo del fabricante, ya que puede ayudar a mantener la expresión de DAPI a lo largo de múltiples ciclos de seqIF, lo que ayuda a alinear las imágenes después de la ejecución. La mayoría del software de procesamiento de imágenes, como el que se incluye con este sistema, utiliza la señal DAPI para confirmar la alineación de las imágenes cíclicas para la colocalización fluorescente.
  4. Inicialización del sistema
    1. Cargue cada uno de los reactivos del paso 6.3 en el orden especificado por el sistema. Tenga en cuenta que, por lo general, el orden será el anterior, pero asegúrese siempre de que los reactivos coincidan con el lugar donde se cargan
    2. Cargue el portaobjetos recuperado de antígenos en el soporte y asegúrese de que la ventana de imágenes del portaobjetos esté alineada en el centro del espacio de imágenes antes de colocar el chip de microfluidos compatible con el sistema en la parte superior y bloquearlo en su lugar.
      NOTA: Los chips de microfluidos se pueden reutilizar para pruebas de valoración seqIF si se limpian y almacenan adecuadamente hasta una vez más, siempre que las juntas permanezcan intactas. Los chips de microfluidos no se pueden reutilizar si se ejecuta un panel de ARN debido a la posible contaminación.
    3. Prepare la solución de hendidura mezclando 1,35 ml de SSC 4x y 150 ml de solución de hendidura comercial 10x.
      NOTA: La solución de hendidura 10x se oxida rápidamente y se almacena en una ampolla de vidrio que solo debe romperse inmediatamente antes de su uso en una ejecución experimental seqRNA-ISH+seqIF.

7. Ejecución del sistema

  1. Ejecute el sistema de acuerdo con las instrucciones del fabricante, los tiempos de ejecución aproximados para dos portaobjetos en un seqRNA-ISH de 12 plex con una seqIF de proteína de 20 plex es de 48 h para una ventana de imágenes de 12,5 cm x 12,5 cm.
  2. Una vez completada la ejecución de seqRNA-ISH + seqIF, el portaobjetos se puede quitar y almacenar en 1x PBS o utilizar inmediatamente para seqIF adicionales (para hasta 40 proteínas).
    NOTA: Es importante limpiar y enjuagar los microfluidos del sistema con agua libre de nucleasas antes y después de cada ejecución para reducir el potencial de contaminación.

8. OPCIONAL: Análisis de imagen y estadístico

  1. Proceda con el análisis estadístico y de imágenes a través de herramientas de análisis de imágenes o análisis de patología.

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Resultados

Como ejemplo de este método, ejecutamos el siguiente seqRNA-ISH (Tabla 1) + SeqIF (Tabla 2 y Tabla 3) en dos portaobjetos de un carcinoma de ovario seroso humano de alto grado.

La Figura 2 ilustra la superposición de seqRNA-ISH + seqIF en una muestra de tejido tumoral ovárico. Los marcadores de proteínas estructurales como el colágeno 1 se utilizan para identificar regiones tumorales, mientras que los marcadores f...

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Discusión

El paso más crítico en la preparación y manipulación de muestras es reducir la contaminación por ARNasa. Esto se puede lograr utilizando máscaras para evitar la contaminación por el aliento y limpiando las superficies de trabajo con una solución de descontaminación de ARNasa y etanol al 70% hecho con agua libre de nucleasas. Para portaobjetos FFPE, es mejor cortar varios portaobjetos adyacentes de bloques FFPE para seqRNA-ISH+seqIF y almacenarlos a 4 °C con desecante. Para el control de ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada en parte por la Alianza para la Investigación del Cáncer de Ovario (OCRA 811621 y 891490), la Fundación Sie y el Fondo de Dotación Stephanie C. Stelter. Esta investigación se realizó en colaboración con el Centro Central de Citometría de Flujo e Imágenes Celulares, que cuenta con el apoyo en parte de los Institutos Nacionales de Salud a través de la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico P30 CA016672 del M. D. Anderson y el Especialista en Investigación del NCI 1 R50 CA243707-01A1 de Jared Burks.

También nos gustaría agradecer a Emily Martersteck de Lunaphore por la asistencia técnica y la capacitación.

Los autores recibieron un conjunto de sondas dirigidas y de control de RNAScope como parte de un programa de acceso temprano de Bio-Techne a un precio con descuento, y algunos reactivos se proporcionaron de forma gratuita para su uso en este estudio. El fabricante no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos o la preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenEN62248 / 62248Para tinción nuclear (producto utilizado durante este estudio, 62247 ha sido descontinuado)
Tubos de centrífuga de polipropileno estériles cónicos de 50 mlThermo Fisher Scientific339652Se utiliza para alícuotas y Soluciones secundarias mixtas
Alcohol isopropanol estéril al 70%TexwipeTX3270Para la descontaminación de superficies
AnticuerposVariosVariosSe utiliza para los objetivos principales, varía según el canal utilizado
APOE - Anfitrión: Ratón, Clon: 960318R& DMAB41443-100(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
aSMA - Host: Mouse, Clon: 1A4CST69319 Pies Cuadrados(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
Micrótomo de corte automáticoLeica14051956472Corte de tejido
CD10 - Anfitrión: Conejo, Clon: E5P7SCST65534S(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
CD11c - Anfitrión: Conejo, Clon: D3V1ECST93233Pies Cuadrados(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
CD163 - Anfitrión: Conejo, Clon: D6U1JCST93498S(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
CD163 - Anfitrión: Conejo, Clon: ja51-30InvitrogenMA5-32684(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
CD20 - Anfitrión: Ratón, Clon: L26BethylA500-017ACF(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
CD31 - Anfitrión: Ratón, Clon: 3F8E2Tecnología de proteínas66065-2-IG(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
CD33 - Anfitrión: Conejo, Clon: BLR061GBethylA700-061CF(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
CD4 - Anfitrión: Conejo, Clon: EPR6855AbcamAB181724(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
CD45 - Anfitrión: Conejo, Clon: BL-178-12C7BethylA700-012(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
CD45RO - Huésped: Ratón, Clon: UCHL1BethylA500-020ACF(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
CD56 - Huésped: Conejo, Clon: BLR152JBethyl99746(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
CD66b - Huésped: Conejo, Clon: BLR111HInvitrogenMA5-44413(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
CD68 - Anfitrión: Ratón, Clon: KP-1Bioleyenda916104(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
CD8 - Anfitrión: Ratón, Clon: C8/144BBioleyenda372902(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
CD86 - Huésped: Conejo, Clon: E2G8PCST76755 Pies Cuadrados(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
Col 1A1 - Anfitrión: Mouse, Clon: E3E1XCST66948S(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
Tubos DNA LoBind 2mLEppendorf22431048Se utiliza para soluciones de sonda de ARN mixto
Drierite 21005 Desecante IndicadorCole-Palmer21005Desecante para Desecador
Cuchillas de micrótomo Edge-RiteThermo Fisher Scientific / Invitrogen4280LHistología: se utiliza al cortar muestras
Alcohol etílico 100% (200 grados)Farmacia111000200Para desparafinación
Amortiguador EZ-AR2 EleganceBioGeneXHK547-XAKSe utiliza para la recuperación de antígenos de secciones de tejido FFPE
FOXP3 - Huésped: Conejo, Clon: PoliclonalBethylA700-034CF(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
Cabra anti-ratón IgG (H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-21425(nota: Específico para este estudio) F(ab')2-Cabra anti-Ratón IgG (H+L) Anticuerpo secundario de adsorción cruzada, Alexa Fluor™ 555
Cabra anti-ratón IgG (H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-48289/A-21237(nota: Específico para este estudio) F(ab')2-Cabra anti-Ratón IgG (H+L) Anticuerpo secundario de adsorción cruzada, Alexa Fluor™ Más 647
Cabra anti-Conejo IgG (H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-21430(nota: Específico para este estudio) F(ab')2-Cabra anti-Conejo IgG (H+L) Anticuerpo secundario de adsorción cruzada, Alexa Fluor™ 555
Cabra anti-Conejo IgG (H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-21246(nota: Específico para este estudio) F(ab')2-Cabra anti-Conejo IgG (H+L) Anticuerpo secundario de adsorción cruzada, Alexa Fluor™ 647
GZMB - Huésped: Conejo, Clon: PoliclonalTecnología de proteínas13588-1-AP(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
HS-POLR2A-T1ACD BiotechneModelo 310457-T1Sonda humana de baja expresión
Hs-PPIB-T5ACD BiotechneModelo 313907-T5Control de la sonda de expresión media humana
HS-UBC-T9ACD BiotechneModelo 310047-T9Control de alta expresión humana
Solución de peróxido de hidrógeno al 30%Sigma-AldrichHX0640-5Para la preparación de tejidos. Ayuda a bloquear la actividad endógena de la peroxidasa y a producir productos muy coloreados. Para hacer una solución de peróxido de hidrógeno al 3%
Ker8/18 - Huésped: Ratón, Clon: PoliclonalTecnología de proteínas66187-1-PBS(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
LRP5 - Anfitrión: Conejo, Clon: HPA030505SigmaHPA030505-100UL(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
Tampón multitinción Lunaphore 20xBio-TechneBU06Se utiliza como diluyente y para lavados para el COMET
Lunaphore COMET ChipBio-TechneMK03Chip mcirofluidics para instrumento COMET
Lunaphore COMETBio-TechneCM10-SEsterilizador automático Seq-IF
Kit de tampón de elución LunaphoreBio-TechneBU07-LSolución 1 y Solución 2 para los pasos de elución del COMET
Kit de tampón de imágenes LunaphoreBio-TechneBU09Soluto y Disolvente utilizado para la obtención de imágenes durante la ejecución de COMET
Tampones de extinción de lunaphoreBio-TechneBU08-LSolución 1 y Solución 2 para los pasos de enfriamiento del COMET
MicropipetaVariosN/Apara la preparación de reactivos
Periostina - Huésped: Ratón, Clon: 1A11A3Tecnología de proteínas66491-1-PBS(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
Pierce 16% Formaldehído (p/v), sin metanolThermo Fisher Scientific28908Para hacer PFA al 3,7% para la preparación de tejidos
Entrada de 320102 de sonda (canal T2)ACD Biotechne300040DapB de control negativo en T2
Entrada de 320102 de sonda (canal T3)ACD Biotechne300040DapB de control negativo en T3
Entrada de 320102 de sonda (canal T4)ACD Biotechne300040DapB de control negativo en T4
RNAscope HiPlex Solución madre de escisiónBio-TechneP/N 324399Reactivo para la escisión durante el ensayo RNAScope
RNAscope HiPlex Pro para COMET Kit de 12 plex y 20 portaobjetosBio-Techne322075Reactivos y Tampones para RNAScope
Sonda RNAscope HiPlex- Hs-APOE-T2ACD Biotechne433093-T2(nota: Específico para este estudio) Acceso anticipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - Hs-APOE-T2
Sonda RNAscope HiPlex - Hs-ARG1-T4ACD Biotechne401581-T4(nota: Específico para este estudio) Acceso anticipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - Hs-ARG1-T4
Sonda HiPlex de RNAscope- Hs-CD274-T1ACD Biotechne600863-T1(nota: Específico para este estudio) Acceso anticipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - Hs-CD274-T1
Sonda RNAscope HiPlex- Hs-CD40-T6ACD Biotechne445973-T6(nota: Específico para este estudio) Acceso anticipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - Hs-CD40-T6
Sonda RNAscope HiPlex - Hs-CXCL1-01-T12ACD Biotechne1256473-T12(nota: Específico para este estudio) Acceso anticipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - Hs-CXCL1-01-T12
Sonda RNAscope HiPlex- Hs-GZMB-T7ACD Biotechne468453-T7(nota: Específico para este estudio) Acceso anticipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - Hs-GZMB-T7
Sonda HiPlex de RNAscope- Hs-IFNG-T3ACD Biotechne310503-T3(nota: Específico para este estudio) Acceso anticipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - Hs-IFNG-T3
Sonda RNAscope HiPlex - Hs-IL23a-T8ACD Biotechne562853-T8(nota: Específico para este estudio) Acceso anticipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - Hs-IL23a-T8
Sonda RNAscope HiPlex- Hs-IL6-T9ACD Biotechne400883-T9(nota: Específico para este estudio) Acceso anticipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - Hs-IL6-T9
Sonda HiPlex de RNAscope- Hs-TNFa-T11ACD BiotechneModelo 310423-T11(nota: Específico para este estudio) Acceso anticipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - Hs-TNFa-T11
Sonda RNAscope HiPlex- Hs-VEGFa-T5ACD Biotechne423163-T5(nota: Específico para este estudio) Acceso anticipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - Hs-VEGFa-T5
Sonda RNAscope HiPlex- Hs-VISTA-T10ACD Biotechne491513-T10(nota: Específico para este estudio) Acceso anticipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - Hs-VISTA-T10
RNAscope HiPlex12 CS Sonda de control negativoACD Biotechne324347Panel de control negativo completo de 12 plex recomendado por el fabricante. DapB en T1-T12.
RNAscope HiPlex12 CS Sonda de control positivo-HsACD Biotechne324317Panel de control positivo humano completo de 12 plex recomendado por el fabricante. Hs -RTU para el siguiente gen de mantenimiento en los canales T1 a T12: Polr2a, PPIB, UBC, HPRT1, TUBB, RPL28, RPL5, B2M, ACTB, LDHA-O1, RPLP0-X-RPLP0P2, GAPDH.
Agua libre de ARNasaCorning46-000-CMPara limpiar y preparar todo el equipo, y para usarlo como diluyente cuando sea necesario
Solución de descontaminación de ARNasa RNasaZapThermo Fisher ScientificAM9782Una solución de descontaminación de superficies que destruye las ARNasas
RNeasy FFPE KitQiagen73504 y 19093Para extracción de ARN y Medición DV200
Sobre deslizanteCientífico SimportM9504MApara almacenar portaobjetos en tampón líquido.
Diseño quirúrgico Hoja de afeitar industrial de uso generalThermo Fisher Scientific / Invitrogen13-812-236Histología: se utiliza al cortar muestras
TOX 1/2 - Anfitrión: Conejo, Clon: E613QCST62886 Pies Cuadrados(nota: Específico para este estudio) Proteína primaria Anticuerpo
Grado histológico de xilenoThermo Fisher ScientificUN1307Para desparafinación

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