Artículo de método

Cartografía molecular de doble modalidad: integración de la detección de ARNm multiplex con citometría de masas de imágenes de proteínas

DOI:

10.3791/68616

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14 de noviembre de 2025

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1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Hematopoietic Biology & Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo detalla una metodología para la detección de ARNm multiplex con citometría de masas de imágenes de proteínas en secciones de tejido incluidas en parafina fijadas en formalina.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La capacidad de detectar proteínas y ARNm en el mismo ensayo nos ayuda a comprender cómo la célula se está preparando para una llegada y qué señales recibe a medida que viaja e interactúa en el entorno en el que se encuentra. Las imágenes de mayor plexado ahora permiten la caracterización simultánea de ARNm (transcriptómica espacial) y proteínas (proteómica espacial) resueltas espacialmente. Para evitar la redundancia, estos analitos se pueden analizar en una sola sección de tejido. Hay muchas tecnologías que permiten muchas proteínas y pocos ARNm o a la inversa, pero como los analitos de acción central son proteínas, este manuscrito se centra en la integración de la citometría de masas de imágenes de proteínas (IMC) con la hibridación in situ de ARNm (ISH) utilizando sondas metálicas. Esto nos permite comprender qué mensajes está preparando o enviando rápidamente la célula al mundo a medida que se comunica en su microentorno. También supera las limitaciones relacionadas con la detección de proteínas secretadas o marcadores desafiantes que generalmente son difíciles de cuantificar y visualizar utilizando solo anticuerpos. Este protocolo también minimiza la necesidad de compensaciones o posprocesamiento observados en métodos basados en fluorescentes de mayor plex, ya que no hay desbordamiento espectral fluorescente en un sistema de detección basado en sonda de metal, ni hay consideraciones de autofluorescencia específicas del tejido.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los cánceres exhiben diversidades estructurales y funcionales en varios pacientes. El microambiente tumoral (TME), compuesto por células normales y malignas, es heterogéneo entre los pacientes. La metástasis es el resultado de un residuo del tumor primario que escapa al torrente sanguíneo como grupos de células y células individuales, lo que proporciona pistas sobre la progresión de la enfermedad y la respuesta terapéutica 1,2. Es necesario comprender la complejidad de estos microambientes1. Aunque los tumores comprenden amplios tipos de células, el estándar clínico se basa histológicamente en un solo marcador, que está comenzando a cambiar 1,2. Las tecnologías de imágenes multiplexadas han proporcionado nuevas direcciones en patología. La proteómica, la genómica, la metabolómica y la lipidómica de los cánceres humanos resueltas espacialmente ahora son posibles con una resolución de células individuales 3,4,5,6 o cerca de ella.

Estas tecnologías pueden diseccionar las ubicaciones celulares heterogéneas y las interacciones en los tumores. El uso de la metodología adecuada de bioimagen unicelular permite la generación de perfiles de muchos biomarcadores de proteínas asociados a la enfermedad en biopsias de pacientes para informar el diseño de terapias contra el cáncer. Los conocimientos de los mapas celulares espaciales podrán guiar la elección de la terapia combinada que puede eliminar de manera eficiente los cánceres con una reducción de los objetivos, la resistencia y la recaída1. Lo que está en juego es la capacidad de sindicalizar estas muchas tecnologías variadas que normalmente no funcionan en armonía en la misma sección de tejido7. Este protocolo, descrito visualmente en la Figura 1, ofrece la oportunidad de examinar espacialmente tanto la proteómica como un subconjunto específico de ARNm en la misma sección de tejido y la misma célula simultáneamente con una plexidad más alta que la que es posible con proteína fluorescente simultánea + ARN-ISH8. Esto también puede servir como puente para el análisis paralelo 3,4,6, con el objetivo de desconvolutar el análisis de los datos. Si bien la detección dual está presente, también se pueden examinar las células que han iniciado rápidamente la producción de ARNm, pero para las cuales la proteína secretada permanece indetectable debido a la sensibilidad limitada y la falta de amplificación de la señal inherente a los métodos de anticuerpos primarios marcados directamente, lo que hace que la detección de moléculas secretadas sea particularmente desafiante. El siguiente protocolo está adaptado de una detección fluorescente/cromogénica de 12 plex para que sea aplicable a la detección basada en metales a través de sondas modificadas reducidas en tiol para la detección simultánea en IMC.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo utiliza tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE) recolectados de pacientes no tratadas previamente que se sometieron a cirugía citorreductora primaria para carcinoma de ovario seroso de alto grado. Todos los datos clínicos se obtuvieron del repositorio del Departamento de Oncología Ginecológica y Medicina Reproductiva bajo protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional del MD Anderson de la Universidad de Texas. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes y los estudios se realizaron de acuerdo con las pautas éticas reconocidas.

1. Precauciones y preparativos

  1. Utilice siempre agua libre de nucleasas (NFW) para preparar todos los reactivos necesarios.
  2. Realice todos los pasos utilizando recipientes de plástico y sin el uso de vidrio para reducir la unión del metal al vidrio y la contaminación del metal.
  3. Mantenga el área de trabajo muy limpia y rocíe las superficies y pipetas con una solución de descontaminación de ARNasa, seguida de etanol al 70% preparado con NFW.
  4. Conjugar sondas de detección de ARNm tiolado (T1-T12) con metales adecuados a través de un enlazador de malemida como lo describe Schulz et al7, detallado en protocol.io en la Tabla de materiales.
    NOTA: Los objetivos de proteínas deben elegirse para indicar la ubicación de una célula dentro del tejido (marcadores estructurales), identificar qué células están presentes (marcadores fenotípicos) y qué están haciendo las células (marcadores funcionales). Como algunos marcadores funcionales se expresan transitoriamente, la inclusión de dianas de ARNm permite la identificación de células que generan estas dianas.

2. Preparación y preprocesamiento de muestras

  1. Hornee secciones de papel higiénico durante la noche en un horno seco a 60 °C.
  2. Realizar desparafinación: Tres rondas de xileno durante 5 min cada ronda, y 10 rondas de rehidratación (100% etanol (EtOH) x2, 95% EtOH x2, 70% EtOH x2, 50% EtOH x2, 30% EtOH x2), durante 3 min cada ronda. Lavar con 1x solución salina tamponada con tris (TBS) durante 2 min, una vez. De acuerdo con la cantidad de muestras que se procesan al mismo tiempo, utilice tubos cónicos de 50 ml (2 portaobjetos como máximo) o casetes de tinción IHC de 350 ml (24 portaobjetos como máximo).
    NOTA: Este paso de desparafinado, aunque recomendado, es opcional y depende del tipo de tejido.
  3. Aplique una solución de paraformaldehído (PFA) al 3,7% durante 10 min incubando los portaobjetos de tejido en un tubo de 50 ml con suficiente solución de PFA para cubrir la sección de tejido.
  4. Recuperación de antígenos inducida por calor (HEIR) mediante microondas: Con un microondas con temperatura controlada, llene una bandeja con tampón de recuperación de antígenos HEIR de pH 6 (350 ml) y las bandejas restantes con NFW. Coloque secciones de tejido en una rejilla de tinción para portaobjetos de microscopio y agréguelas a la bandeja con tampón de recuperación de antígenos.
    NOTA: Al realizar la recuperación de antígenos, asegúrese de que el tampón de recuperación de antígenos esté a temperatura ambiente (RT) antes de usarlo.
  5. Realice la recuperación de antígenos a 107 °C durante 15 min, luego deje que los portaobjetos de tejido se enfríen a temperatura ambiente durante 20 min en una campana química.
  6. Durante la recuperación del antígeno, enjuague el papel humidificador con agua, colóquelo en una bandeja de tinción de portaobjetos con control de humedad y coloque la bandeja en un horno de hibridación a 60 °C.
  7. Enjuague los portaobjetos en TBS sin ARNasa durante 3 minutos, luego seque los portaobjetos durante 3 minutos.

3. Tratamiento de proteasa

  1. Dibuje una barrera hidrofóbica alrededor de cada sección de tejido con un bolígrafo de barrera hidrofóbico. Deje que la barrera se seque por completo durante aproximadamente 2 minutos.
  2. Cargue las diapositivas secas en el soporte de la bandeja de humedad abriendo la abrazadera giratoria.
  3. Agregue suficientes gotas de proteasa para cubrir completamente la sección de tejido. Retire la bandeja de control de humedad precalentada (60 °C, paso 2.6) del horno de hibridación e inserte el soporte deslizante en la bandeja de control de humedad. Vuelva a sellar la bandeja de control de humedad y devuélvala al horno de hibridación. Incubar a 40 °C durante 30 min.
  4. Durante esta incubación, prepare los materiales del ensayo de ARN-ISH.
    1. Prepare 500 ml de tampón de lavado 1x RNA-ISH diluyendo el stock 50x con NFW. Almacenar en RT hasta un mes.
      NOTA: Si se produce precipitación en el tampón de lavado 50x, vuelva a suspender calentando el tampón a 40 °C durante 10-20 min antes de preparar el tampón de lavado 1x.
  5. Prepare 1 L de DTBS-T (0.5% Tween) en NFW agregando 5 mL de Tween a 1 L de DPBS-T.
  6. Prepare sondas de objetivo emparejadas con ZZ de ARN:
    1. Calentar las existencias de la sonda de ARNm y el diluyente de ARN-ISH a 40 °C en un horno seco durante 10 min. Agite las sondas y gírelas hacia abajo en una mini centrífuga de sobremesa.
    2. Prepare 1x mezcla (hasta 12 sondas, Tabla 1) diluyendo las sondas 50x en el diluyente de ARN-ISH, asegurándose de tener suficiente volumen final para cubrir toda la sección de tejido.
    3. Agite bien y deje las sondas mixtas y el diluyente de ARN-ISH a temperatura ambiente hasta su uso.
  7. Retire la bandeja de control de humedad del horno de hibridación y retire el soporte de portaobjetos. Regrese la bandeja al horno.
  8. Coloque las diapositivas en un soporte transparente para diapositivas prelavado con NFW. Lavar los portaobjetos en NFW con una ligera agitación durante 5 min.
  9. Repita el paso de lavado con NFW fresco durante 5 min.

4. Hibridación de sondas objetivo

  1. Retire el exceso de líquido de los portaobjetos. Retire la bandeja de control de humedad del horno y coloque el soporte deslizante en la bandeja.
  2. Agregue suficiente mezcla de sonda adecuada para cubrir completamente cada sección de tejido. Cerrar la bandeja e introducirla en el horno durante 2 h a 40 °C.
  3. Coloque el reactivo del amplificador de ARN-ISH 1 (árboles de cola ZZ para las colas T1 a T4) para que se equilibre a RT 30 min antes del final de la incubación, para usarlo en el paso 5.2.
  4. Una vez finalizada la incubación, retire la bandeja de control de humedad del horno de hibridación y retire el soporte del portaobjetos. Regrese la bandeja al horno.
  5. Coloque las diapositivas en un soporte transparente para diapositivas prelavado con NFW. Lave los portaobjetos en 1x tampón de lavado con una ligera agitación durante 2 min.
  6. Repita el paso de lavado con 1x Wash Buffer nuevo durante 2 minutos a temperatura derecha.

5. Hibridar el amplificador ARN-ISH 1

  1. Retire el exceso de líquido de los portaobjetos y colóquelos en el soporte de portaobjetos de la bandeja de humedad. Inserte el soporte deslizante en la bandeja de control de humedad.
  2. Amplificador de ARN-ISH de vórtice 1 y agréguelo para cubrir completamente cada sección. Cerrar la bandeja e introducirla en el horno de hibridación durante 30 min a 40 °C. Coloque el reactivo del amplificador de ARN-ISH 2 (árboles de cola ZZ para las colas T5 a T8) en RT, para usarlo en el paso 6.2.
  3. Retire la bandeja de control de humedad del horno de hibridación y retire el soporte de portaobjetos. Regrese la bandeja al horno.
  4. Coloque las diapositivas en un soporte transparente para diapositivas prelavado con NFW. Lave los portaobjetos en 1x tampón de lavado con una ligera agitación durante 2 min.
  5. Repita el paso de lavado con 1 tampón de lavado nuevo durante 2 minutos a temperatura ambiente.

6. Hibridar el amplificador ARN-ISH 2

  1. Retire el exceso de líquido de los portaobjetos. Retire la bandeja de control de humedad del horno y coloque el soporte deslizante en la bandeja
  2. Amplificador de ARN-ISH de vórtice 2 y agréguelo para cubrir cada sección. Cerrar la bandeja e introducirla en el horno de hibridación durante 30 min a 40 °C.
  3. Coloque el reactivo del amplificador de ARN-ISH 3 (árboles de cola ZZ para las colas T9 a T 12) en RT, para usarlo en el paso 7.2. Retire el soporte de la diapositiva de la bandeja. Vuelva a colocar la bandeja en el horno.
  4. Coloque las diapositivas en un soporte transparente para diapositivas prelavado con NFW. Lave los portaobjetos en 1x tampón de lavado con una ligera agitación durante 2 min.
  5. Repita el paso de lavado con 1 tampón de lavado nuevo durante 2 minutos a temperatura ambiente.

7. Hibridar el amplificador ARN-ISH 3

  1. Retire el exceso de líquido de los portaobjetos. Retire la bandeja de control de humedad del horno y coloque el soporte deslizante en la bandeja
  2. Amplificador Vortex RNA-ISH 3 y agréguelo para cubrir completamente cada sección. Cerrar la bandeja e introducirla en el horno de hibridación durante 30 min a 40 °C.
  3. Durante la incubación, prepare la mezcla de oligos metálicos para el paso 8. Cada oligo se usa a una concentración de 1:15 (de stock de 10uM, asegurándose de tener suficiente volumen final para cubrir toda la sección de tejido). Agite bien y deje los oligos metálicos mezclados a temperatura derecha hasta su uso. Saque la bandeja de control de humedad del horno, luego retire el soporte deslizante de la bandeja. Después, vuelve a colocar la bandeja en el horno
  4. Coloque las diapositivas en un soporte transparente para diapositivas prelavado con NFW. Lave los portaobjetos en 1x tampón de lavado con una ligera agitación durante 2 min.
  5. Repita el paso de lavado con 1x Wash Buffer nuevo durante 2 minutos a temperatura derecha.

8. Hibridar oligos metálicos

  1. Retire el exceso de líquido de los portaobjetos. Retire la bandeja de control de humedad del horno y coloque el soporte deslizante en la bandeja. Agregue oligos metálicos mixtos preparados en el paso 7.3 (vórtice antes de usar).
  2. Cerrar la bandeja e introducirla en el horno de hibridación durante 45 min a 40 °C.
  3. Retire la bandeja de control de humedad del horno de hibridación y retire el soporte de portaobjetos. Regrese la bandeja al horno.
  4. Coloque las diapositivas en un soporte transparente para diapositivas prelavado con NFW. Lave los portaobjetos en 1x tampón de lavado con una ligera agitación durante 2 min.
  5. Repita el paso de lavado con 1x Wash Buffer nuevo durante 2 minutos a temperatura derecha.

9. Anticuerpos conjugados metálicos

  1. Para bloquear sitios no específicos, aplique suficiente volumen de tampón de bloqueo para cubrir toda la sección de tejido e incube durante 30 min a RT.
  2. Durante la incubación, prepare la mezcla de anticuerpos que se utilizará en el paso 10.1 diluyendo los anticuerpos (Tabla 1) en tampón diluyente de anticuerpos.

10. Incubación con anticuerpos conjugados metálicos

  1. Después de bloquear la incubación del tampón, deseche el tampón de bloqueo de los portaobjetos de tejido y dispense suficiente volumen de la mezcla Ab (del paso 9.2) para cubrir toda la sección de tejido.
  2. Coloque el portaobjetos en una cámara de humedad e incube durante la noche (~16 h) a 4 °C.

11. Tinción de ADN

  1. Prepare una nueva solución de Ir-Intercalator.
    1. A partir de una solución madre de 500 μM, preparar una solución de trabajo 1:2000 en TBS sin RNasa. La solución de trabajo puede ser alícuota y almacenar a -20 °C (no congelar-descongelar).
  2. Coloque las diapositivas en un soporte transparente para diapositivas prelavado con NFW. Lave los portaobjetos en tampón TBS-T con una ligera agitación durante 5 min.
  3. Repita el lavado en TBS-T.
  4. Tintar portaobjetos con solución de trabajo Ir (del paso 11.1.1) durante 5 min a temperatura ambiente.
  5. Coloque las diapositivas en un soporte transparente para diapositivas prelavado con NFW. Lave los portaobjetos en tampón TBS-T con una ligera agitación durante 5 min.
  6. Repita el lavado en TBS-T.
  7. Lavar dos veces en cucharadas, 5 min (remover lentamente).
  8. Sumerja el portaobjetos rápidamente en ddH2O para evitar la cristalización de las sales presentes en el TBS en el tejido.
  9. Seque el portaobjetos bajo una cubierta química (10 min) y guárdelo a 4 °C hasta la adquisición de la imagen.

12. Adquisición de imágenes

  1. Cargue la corredera en la cámara de ablación de IMC.
  2. Capture una imagen panorámica para identificar la región de interés (ROI).
  3. Mapee los ROI en el software de adquisición de imágenes.
  4. Aplique la plantilla de adquisición.
  5. Ajuste la potencia del láser (energía de ablación) según el tipo de muestra. El valor predeterminado se establece en 0 dB.
    NOTA: Se recomienda probar la energía de ablación con múltiples áreas de tejido pequeñas (30 μm x 30 μm), aumentando la potencia en 1 dB cada vez. Seleccione la energía de ablación más baja que elimine la muestra sin quemarse en el portaobjetos. Normalmente, esto da como resultado una potencia láser de 3-4 dB. Ocasionalmente, si el tejido es más grueso de lo recomendado, la potencia del láser aumentará a 5 dB.
  6. Iniciar la ablación con láser. El sistema dirige el láser al ROI y extirpa las proteínas marcadas con metal, generando columnas de aerosol que se transfieren a la antorcha de plasma acoplado inductivamente (ICP), donde las columnas se vaporizan, atomizan e ionizan en plasma.
  7. Mida la cantidad de cada isótopo que mide el detector y se convierte en datos.

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Resultados

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La capacidad de detectar proteínas y ARNm en el mismo ensayo nos ayuda a comprender cómo la célula se está preparando para una llegada, pero también qué colas recibe a medida que viaja e interactúa con su entorno. Como se ve en los datos representativos, la detección de ARNm y proteínas son componentes críticos en la investigación de biología espacial, ya que los límites inferiores de detección pueden ser bastante desafiantes en función de la forma en que avanzan los pasos de etiquetado,...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La multiómica multiplex es una evolución crítica en los datos recopilados, dirigida a las interacciones de célula a célula y de célula a vecindad que afectan la progresión y el tratamiento de la enfermedad. El análisis de estos datos en la misma muestra y, por lo tanto, en la misma célula es fundamental, ya que muchos objetivos de proteínas se expresan transitoriamente o difieren en el nivel de expresión de ARNm y proteínas, lo que permite una detección de ARNm dirigida combinada con pro...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jared K. Burks es consultor de Standard BioTools.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación se realizó en colaboración con el Centro Central de Citometría de Flujo e Imágenes Celulares, que cuenta con el apoyo en parte de los Institutos Nacionales de Salud a través de la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico P30 del MD Anderson CA016672. Esta investigación también fue apoyada en parte por el Premio al Desarrollo de la Subvención de Apoyo del MD Anderson's Cancer Center, Imágenes de Transcriptómica Espacial de Citometría de Masas a través de RNAscope, P30CA016672, NIH / NCI, PI - Pisters. El esfuerzo de JKB fue apoyado en parte por el CA016672 P30 y el Especialista en Investigación del NCI 1 R50 CA243707-01A1. El esfuerzo de SFB fue apoyado en parte por la Alianza para la Investigación del Cáncer de Ovario (OCRA 811621 y 891490), la Honorable Fundación Tina Brozman para la Investigación del Cáncer de Ovario, el Programa de Investigación del Desarrollo SPORE de Cáncer de Ovario de MDACC, NIH 1R01CA261952-01A1. El esfuerzo de SFB, JKB y BG fue apoyado en parte por la subvención 1U01CA294459-01. Los autores desean agradecer a Samuel Mok, quien seccionó y proporcionó las muestras utilizadas.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
  https://www.protocols.io/view/oligonucleotide-polymer-conjugation-for-imaging-ma-dm6gpjz91gzp/v2.Protocols.IOdx.doi.org/10.17504/protocols.io.dm6gpjz91gzp/v2Conjugación oligonucleótido-polímero para citometría de masas de imagen V.2 
10 TBS libres de ARNThermo Fisher Scientific y nbsp;J62780. K7Para lavados intermitentes entre pasos
Sistema de Hibridación ACD HybEZ IIACD Biotechne321711Horno para portaobjetos de papel para hornear
Diluyente de anticuerposDakoS0809 Amortiguador diluyente de anticuerpos
Anticuerpo: B7-H3BethylA700-025CF, A700-026CFClon: BLR025F, BLR026F
Anticuerpo: B7-H4Thermo Fisher Scientific y nbsp;14-5949-82Clon: H74
Anticuerpo: BRD4(6F11)BethylA700-005CFClon: BL-151-6F11
Anticuerpo: CCR6R& DMAB195-100Clon: 53103
Anticuerpo: CD11bAbcam ab209970Clon: EPR1344
Anticuerpo: CD25Abcam ab215378Clon: EPR6452
Anticuerpo: CD278/ICOSCST 89601BFClon: D1K2T
Anticuerpo: CD31Abcam ab207090Clon: EPR3094
Anticuerpo: CD33Abcam ab238784Clon: SP266
Anticuerpo: CD3e y nbsp;CST85061BFClon: D7A6E
Anticuerpo: CD4Abcamab181724Clon: EPR6855
Anticuerpo: CD44Thermo Fisher Scientific y nbsp;MA1-10225Clon: IM7
Anticuerpo: CD45Thermo Fisher Scientific y nbsp;14-9457-82Clon: CD45-2B11
Anticuerpo: CD8aCST 85336BFClon: D8A8Y
Anticuerpo: CXCL13R& DAF801Clon: Policlonal
Anticuerpo: CXCR5R& DMAB190-100Clon: CXCR5
Anticuerpo: gamma-H2AXBethylA700-053CFClon: BLR053F
Anticuerpo: Granzyme BSanta CruzSC-8022 XClon: 2C5
Anticuerpo: KAP1BethylA700-014CFClon: BL-248-2G6
Anticuerpo: Ki67BethylA700-021CFClon: BLR021E
Anticuerpo: LCK CST2984BFClon: D88
Anticuerpo: MFAP5N/AN/APMID: 31332047 / Clon: 130A y nbsp; (Nota: diseñado a medida) 
Anticuerpo: AMECST56856BFClon: 1A4
Anticuerpo: VEGFSTB-Fluidigm3163028DClon: G153-494
Anticuerpo: VISTACST64953BFClon: D1L2G
AZ-AR1 Elegance Citra BioGeneXHK546-XAKAmortiguador de recuperación de antígenos
Alcohol etílico 100% (200 grados)Pharmco111000200Para la deparafinización
EZ y ndash; Retriever IRBioGeneXMW016-IRSistema de recuperación de antígenos para secciones de tejido FFPE
Sistema de Hibridación HybEZ IIACD Biotechne321710El sistema consta de: horno HybEZ (PN 321710/321720), una bandeja de control de humedad (PN 310012) y papel humidificante HybEZ (2 hojas PN 310025), bandeja de lavado EZ-Batch (PN 321717), portadeslizantes EZ-Batch (PN 321716)
Pluma PAP de barrera hidrofóbica ImmEdge VectorLabsH-4000Corral de barrera hidrofóbico
Solución Intercalador IRThermo Fisher Scientific y nbsp;NC1038184Utilizado para identificar células nucleadas
KERATIN 18/8CST 4546BFClon: C51
Metal OligosVariosVariosEtiqueta metálica que va de T1 a T12 según lo que se necesite
Agua libre de nucleasas (NFW)Corning 46-000-CM Limpiar y preparar todo el equipo, y usarlo como diluyente cuando sea necesario
RNAscope Protease Plus ACD Biotechne322331 Utilizado para permeabilizar las membranas celulares de muestras
Portaportaportaobjetos RNAscope EZ-BatchACD Biotechne310017Diseñado para procesar manualmente hasta 20 láminas de forma eficiente
Kit de reactivos RNAscope HiPlex12 v2 ACD Biotechne324409Reactivos para RNAScope
Sonda RNAscop HiPlex - Sondas objetivoACD BiotechneVariosRango de T1 a T12 dependiendo de cuál se necesite
Solución de descontaminación RNasa RNaseZapThermo Fisher ScientificAM9782Una solución de descontaminación superficial que destruye RNasas
Soporte para portaportaobjetos para microscopio de estante de tinción 24 lugares Plástico resistente a productos químicosÓptima Científica3028Para teñir múltiples láminas
Preadolescentes 20Thermo Fisher Scientific y nbsp;AAJ20605APPara lavados intermitentes entre pasos
Bloqueo de proteínas de ultravisiónThermo Fisher Scientific y nbsp;TA125PBQBúfer de bloqueo

Referencias

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