El protocolo describe un ensayo de hibridación de inmunofluorescencia en tándem con tejido fijado en formol e incluido en parafina para detectar y cuantificar microARN y proteínas multiplexadas simultáneamente.
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Artículo de método
Amplificación y reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación
En este artículo
Resumen
Resumen
Cuando se utilizan métodos tradicionales de detección de imágenes de hibridación in situ (ISH) basados en sondas, los microARN (miARN) son difíciles de capturar debido a su tamaño, que oscila entre 19 y 25 nucleótidos. Sin embargo, dado que los miARN son reguladores epigenéticos clave que contribuyen a la fisiología normal y a numerosas condiciones patológicas, comprender el comportamiento espaciotemporal de los miARN es importante para desentrañar su función a nivel celular y subcelular. Esto crea una clara necesidad de técnicas adecuadas de detección y visualización. Por lo tanto, creamos la amplificación y el reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado (MARLIN), que se desarrolló y optimizó utilizando tinción de inmunofluorescencia múltiple y sondas de ácido nucleico bloqueado (LNA) dirigidas a un miARN. Este método puede cuantificar miARN con expresión de proteínas multiplexadas, lo que permite la cuantificación de miARN intracelular y extracelular dentro del microambiente tumoral (TME) con alta sensibilidad y reproducibilidad. El uso combinado de ensayos de detección de miARN y captura de proteínas también puede proporcionar una comprensión integral de las funciones celulares y los mecanismos reguladores dentro de ese TME.
Introducción
microARN
Aunque los microARN (miARN) son increíblemente pequeños, con una longitud de 19 a 25 nucleótidos, estas moléculas de ARN monocatenario son potentes reguladores de la expresión génica, modulando los ARN mensajeros (ARNm) postranscripcionalmente a través de interacciones específicas de secuencia1. En esencia, los miARN actúan como reguladores negativos al unirse a los ARNm diana, ya sea impidiendo su traducción o promoviendo su degradación a través de la escisión del ARNm, dependiendo del grado de complementariedad, lo que en última instancia conduce a una disminución de la producción....
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Protocolo
Este protocolo utiliza tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE) de secciones de tejido tumoral de ovario humano de pacientes con HGSC. Estas muestras se recolectaron de pacientes no tratadas previamente que se sometieron a cirugía citorreductora primaria para cáncer de ovario. Todas las muestras y datos clínicos se obtuvieron del repositorio de cáncer de ovario del Departamento de Oncología Ginecológica y Medicina Reproductiva bajo protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional del MD Anderson de la Universidad de Texas. El personal de recepción obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacient....
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Resultados
Al probar este protocolo, es importante tener dos secciones seriadas de la misma muestra representativa para mayor precisión y comparación. En este caso, se utilizó una muestra de cáncer de ovario de alto grado (HGSC) para comparar los resultados. Se utilizó un portaobjetos de control (Figura 2A-B) que solo pasaría por la tinción de miARN y un portaobjetos de prueba que se sometería a tinción de proteínas y m.......
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Discusión
Aunque se reconoce y comprende la importancia de los miARN, las observaciones tanto del desarrollo normal como de los estados de enfermedad se ven obstaculizadas actualmente por la dificultad de estudiar los miARN utilizando métodos estándar. La escasez de métodos in situ condujo al desarrollo de MARLIN (ensayo de miRNA FISH). Dada la homología y la corta longitud de los miARN, se convierte en un desafío visualizar su ubicación y efecto en la regulación posttranscriptómica. El d.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría reconocer a las siguientes personas, Chi Lam Au Yeung y Manjunath Nimmakayalu, que formaron parte del comité de tesis de Basant mientras se desarrollaba el ensayo. Además, Samuel Mok, quien seccionó y proporcionó las muestras utilizadas. Por último, agradecemos a Johan Doré y Dan Winkowski, que brindaron una amplia asistencia durante el análisis y el uso del software Visiopharm. Esta investigación fue financiada en parte por la Alianza para la Investigación del Cáncer de Ovario (OCRA 811621 y 891490), la Fundación Sie y el Fondo de Dotación Stephanie C. Stelter. Esta investigación se realizó en colaboración con el Centro ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10x solución salina con TIS bufferizada (TBS) pH 7,6 | Thermo Fisher Scientific | J62662 K7 | Para lavados intermitentes entre pasos |
| 1x Diluente/Bloqueo de Anticuerpos de Ópalo y nbsp; | Akoya Biosciences | ARD1001EA | Solución bloqueadora de proteínas |
| Diluyente de amplificación de automatización 1x Plus | Akoya Biosciences | FP1609 | Usado para diluir fluoróforos de ópalo |
| 20x Concentrado Amortiguador de citrato de sodio salino (SSC) | Sigma-Aldrich | S6639-1L | Para lavados de miARN tras la hibridación con sonda |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y nbsp; | Thermo Fisher Scientific/ Invitrogen | EN62248 / 62248 | Para tinción nuclear |
| Sistema de Hibridación ACD HybEZ II | ACD Biotechne | 321711 | Horno utilizado para regular la temperatura durante el protocolo miRNAscope |
| Anti-CD8 (D8A8Y), conejo mAb | Tecnologías de señalización celular | 85336S | Ejemplo de anticuerpo primario utilizado para optimizar este protocolo |
| Anti-digoxigenina (ratón) Conjugado HRP | Revvity Health Sciences Inc | NEF832001EA | Reactivo secundario utilizado para la detección de miARN |
| Anti-EpCAM (E6V8Y), Rabbit mAb | Tecnologías de señalización celular | 93790 | Ejemplo de anticuerpo primario utilizado para optimizar este protocolo |
| Polvo reactivo bloqueante | Akoya Biosciences | FP1012 | Solución bloqueadora de miARN |
| Alcohol etílico 100% (200 grados) | Pharmco | 111000200 | Para la deparafinización |
| Búfer EZ-AR1 | BioGeneX | HK521-XAK | Utilizado para la recuperación de antígenos de secciones de tejido FFPE en la fase de proteínas |
| Amortiguador EZ-AR1 Elegance | BioGeneX | HK546-XAK | Utilizado para la recuperación de antígenos de secciones de tejido FFPE en el paso de la sonda de miARN |
| Sistema IR EZ-Retriever | BioGeneX | MW015-IR | Microondas utilizado para la extracción de antígenos de secciones de tejido FFPE |
| Solución de Peróxido de Hidrógeno 30% | Sigma-Aldrich & nbsp; | HX0640-5 | Para la preparación de tejidos. Ayuda a bloquear la actividad endógena de la peroxidasa y a producir productos muy coloreados |
| Sonda de miARN miR-181c-3p | Qiagen | 339112 | Ejemplo de la sonda de miRNA utilizada para optimizar este protocolo |
| Conjunto de Búfer de miARN ISH (FFPE) de LNA miRCURY | Qiagen | 339450 | Usado para diluir la sonda de miRNA |
| Opal 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluoróforo para identificar anticuerpos primarios |
| Opal 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluoróforo para identificar anticuerpos primarios |
| Opal Anti-Ms + Rb HRP | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Anticuerpo secundario utilizado como agente de detección |
| Pierce 16% Formaldehído (w/v), libre de metanol | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Obtener un 3,7% de PFA para la preparación de tejidos |
| Antifundido de diamante ProLong | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Medios de montaje |
| RNAscope Proteasa Plus | ACD Biotechne | 322331 | Para permeabilizar secciones tisulares digiriendo parcialmente proteínas y exponer moléculas de miARN objetivo |
| Agua libre de ARN y nbsp; | Corning | 46-000-CM | Limpiar y preparar todo el equipo, y usarlo como diluyente cuando sea necesario... |
| Preadolescentes 20 | Sigma-Aldrich | P1379-25ML | Para crear TBS-T |
| Amplificación de señal de tiramida más cianina 3 | Akoya Biosciences | NEL744001KT | Fluoróforo para identificar miARN |
| Sondas de miARN U6 y Scramble | Qiagen | 339459 | Sondas de control opcionales |
| Grado histológico de xilenos | Thermo Fisher Scientific | UN1307 | Para la deparafinización |
Referencias
- Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature). Cancers. 14 (10), 2569(2022).
- Davis-Dusenbery, B. N., Hata, A. Microrna in cancer: The involvem....
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Reimpresiones y permisos
