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Artículo de método

Amplificación y reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación

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DOI:

10.3791/68617

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7 de octubre de 2025

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1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

En este artículo

Resumen

El protocolo describe un ensayo de hibridación de inmunofluorescencia en tándem con tejido fijado en formol e incluido en parafina para detectar y cuantificar microARN y proteínas multiplexadas simultáneamente.

Resumen

Cuando se utilizan métodos tradicionales de detección de imágenes de hibridación in situ (ISH) basados en sondas, los microARN (miARN) son difíciles de capturar debido a su tamaño, que oscila entre 19 y 25 nucleótidos. Sin embargo, dado que los miARN son reguladores epigenéticos clave que contribuyen a la fisiología normal y a numerosas condiciones patológicas, comprender el comportamiento espaciotemporal de los miARN es importante para desentrañar su función a nivel celular y subcelular. Esto crea una clara necesidad de técnicas adecuadas de detección y visualización. Por lo tanto, creamos la amplificación y el reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado (MARLIN), que se desarrolló y optimizó utilizando tinción de inmunofluorescencia múltiple y sondas de ácido nucleico bloqueado (LNA) dirigidas a un miARN. Este método puede cuantificar miARN con expresión de proteínas multiplexadas, lo que permite la cuantificación de miARN intracelular y extracelular dentro del microambiente tumoral (TME) con alta sensibilidad y reproducibilidad. El uso combinado de ensayos de detección de miARN y captura de proteínas también puede proporcionar una comprensión integral de las funciones celulares y los mecanismos reguladores dentro de ese TME.

Introducción

microARN
Aunque los microARN (miARN) son increíblemente pequeños, con una longitud de 19 a 25 nucleótidos, estas moléculas de ARN monocatenario son potentes reguladores de la expresión génica, modulando los ARN mensajeros (ARNm) postranscripcionalmente a través de interacciones específicas de secuencia1. En esencia, los miARN actúan como reguladores negativos al unirse a los ARNm diana, ya sea impidiendo su traducción o promoviendo su degradación a través de la escisión del ARNm, dependiendo del grado de complementariedad, lo que en última instancia conduce a una disminución de la producción de proteínas del gen objetivo. Si bien los miARN son básicamente ARN no codificantes, aproximadamente el 40% de todos los miARN todavía se encuentran dentro de intrones o exones de genes codificadores de proteínas2. El propósito funcional de los miARN abarca varios procesos biológicos clave, como la proliferación celular, la angiogénesis, la apoptosis, etc. En particular, la desregulación de los miARN se ha implicado en la tumorigénesis, ya que la expresión aberrante de miARN específicos y la regulación génica mediada por miARN se ha asociado con la transformación oncogénica en múltiples tipos de cáncer3.

Desde su descubrimiento, los miARN se han investigado ampliamente en diversas enfermedades debido a su expresión específica de tejidos y funciones reguladoras, y su desregulación está relacionada con muchas enfermedades, incluidos los trastornos neurodegenerativos, los trastornos autoinmunes y varios cánceres 4,5,6. Los patrones de expresión de los miARN se pueden correlacionar con el tipo de cáncer, la etapa y las variables clínicas, lo que hace que el perfil de miARN sea una herramienta valiosa para el diagnóstico y pronóstico del cáncer 4,5,6,7. El descubrimiento de nuevos miARN también se ha acelerado por los avances en las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, lo que mejora la comprensión de la participación de los miARN en diversos procesos biológicos8. La importancia de los miARN fue subrayada por el Premio Nobel de Medicina 2024 otorgado a Victor Ambros y Gary Ruvkun por su descubrimiento de la función del miARN en la regulación postranscripcional9.

Como biomarcadores valiosos para el diagnóstico y pronóstico de enfermedades, se ha explorado el potencial terapéutico de los miARN, lo que ha llevado al desarrollo de fármacos dirigidos a miARN. El potencial terapéutico de los miRNAs en el tratamiento del cáncer radica en su capacidad para regular coordinadamente módulos de genes, restaurando potencialmente las funciones celulares normales10. Anteriormente, las terapias anticancerígenas basadas en miARN se han desarrollado como monoterapia o en combinación con terapias dirigidas existentes para mejorar las respuestas al tratamiento y aumentar las tasas de curación11. El espectro dinámico de los miARN los ha posicionado como recursos esenciales para estrategias innovadoras de tratamiento del cáncer. En el contexto de la resistencia terapéutica, dirigirse a los miARN se ha mostrado prometedor para reducir la recurrencia y la resistencia a los tratamientos tradicionales contra el cáncer, mejorando potencialmente la supervivencia del paciente al dirigirse a las células cancerosas12. Al explorar las funciones de los miARN en la modulación de las actividades de varios tipos de células en el microambiente tumoral (TME), se pueden descubrir tratamientos contra el cáncer únicos y clínicamente relevantes.

Ensayos disponibles para detectar miARN
Actualmente, el método más común para la medición de miARN se basa en el ARN extraído para PCR cuantitativa en tiempo real (q-RT-PCR) o secuenciación de próxima generación (NGS), perdiendo contexto espacial. Hay empresas que proporcionarán ensayos de microARN TaqMan, que utilizan cebadores de bucle de tallo específicos para la síntesis de ADNc, y productos químicos basados en colorantes SYBR Green con síntesis universal de ADNc. Estos ensayos pueden ofrecer una alta sensibilidad y especificidad y pueden ejecutarse en una gama de instrumentos q-RT-PCR. Desafortunadamente, los ensayos TaqMan no pueden proporcionar una cuantificación absoluta, lo que puede conducir a problemas como falsos positivos y variabilidad en los resultados13. Además, a pesar de su alta sensibilidad, la aplicación de estos ensayos en diferentes tipos de muestras puede verse limitada por la necesidad de una preparación extensa de la muestra y la posible interferencia de otros componentes de la muestra.

Secuenciación de próxima generación (NGS): miRNA-seq es cada vez más popular para el análisis de expresión diferencial en todo el miRNome de biofluidos. Un beneficio de las tecnologías NGS como miRNA-seq es que permiten análisis paralelos masivos de la expresión de miARN en todo el genoma, lo que permite la cuantificación de miARN individuales, la identificación de variaciones de secuencia y el descubrimiento de nuevos miARN14. Un inconveniente sustancial de los métodos basados en secuenciación, como el kit de preparación de muestras de ARN pequeño IlluminaTruSeq, es la inducción de sesgos cuantitativos, que afectan la precisión de los análisis de expresión diferencial, debido en gran parte a la homología y las longitudes de lectura más pequeñas de los miARN14. No solo eso, sino que la presencia de isomiRs (variantes que difieren en secuencia o longitud de la secuencia canónica de miARN) y artefactos técnicos pueden complicar la interpretación de los datos, lo que puede conducir a detecciones erróneas y factores de confusión en los ensayos de biomarcadores14. Además, diferentes herramientas para el análisis de datos de miRNA-seq, como sRNAbench y miRDeep2, pueden producir resultados variables, lo que afecta la consistencia y confiabilidad del descubrimiento de nuevos miRNA15,16. Incluso algo como la tecnología de microarrays puede ser insuficiente en la mayoría de los casos. Aunque puede proporcionar una plataforma potente y de alto rendimiento para detectar miARN o niveles de expresión génica, lo que la hace adecuada para estudios de todo el genoma, la tecnología aún está limitada por el número de miARN previamente identificados y no puede verificar directamente las interacciones miARN-diana, lo que limita su utilidad en estudios funcionales17.

El factor más importante que se puede destacar aquí al comparar todas estas opciones disponibles es la falta de contexto espacial. No proporcionan ningún contexto en relación con la morfología del tejido o la distribución espaciotemporal dentro de las células. Es necesario visualizar el comportamiento espaciotemporal de los miARN para desentrañar su función a nivel celular y subcelular. Actualmente, se puede acceder a los ensayos de hibridación in situ (ISH) de miRNAscope, generalmente utilizando métodos de detección cromogénica. Si bien estos ensayos permiten la visualización de miARN con resolución de una sola célula, los resultados carecen de calidad, lo que dificulta la diferenciación entre la expresión de miARN y el fondo de la muestra. En general, muchos de estos producen ensayos de baja calidad, que no son confiables y generalmente requieren cuantificación manual.

Por lo tanto, desarrollamos la amplificación y el reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado (MARLIN) utilizando tinción de inmunofluorescencia multiplex (mediante tinción de proteína Opal) y sondas de ácido nucleico bloqueado (LNA) dirigidas a un miARN, dentro de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE). Logramos esto mediante la implementación de un sistema de amplificación de señal de tiramida (TSA) que se activa mediante un anticuerpo conjugado anti-digoxigenina (DIG) peroxidasa de rábano picante (HRP). El HRP actúa como catalizador de la TSA, mientras que el Anti-DIG se adhiere a la investigación del LNA. Este ensayo es de particular utilidad para comprender la naturaleza esencial de los miR en la modificación posttranscriptómica con proteínas y potencialmente otros ARN simultáneamente. Además, debido a la falta de un ensayo disponible comercialmente que pueda cuantificar tanto la expresión de miARN como la de proteínas, MARLIN proporciona una forma eficaz de comprender las relaciones in situ de los miR y las proteínas dentro de las muestras FFPE.

Los resultados iniciales de la cuantificación de miR-181c-3p utilizando MARLIN demostraron la viabilidad del análisis paralelo de miARN y proteínas dentro del contexto espacial nativo del tejido FFPE ovárico humano. Más allá de este ejemplo, basado en los componentes de MARLIN, es teóricamente posible expandirse hasta cuatro proteínas utilizando fluoróforos de multiplexación fluorescentes comerciales como Alexa Fluor u otros colorantes de moléculas pequeñas18.

Además, dado que esta metodología emplea variaciones en los métodos histológicos estándar, debe ser compatible con otros tejidos FFPE de mamíferos, dada la selección adecuada de sondas y anticuerpos. Esta metodología preserva la arquitectura espacial y permite la cuantificación de la colocalización celular y subcelular de miARN y proteínas. Este enfoque aborda una brecha crítica en la biología espacial mediante el mapeo de los patrones de coexpresión de miARN-proteína y la distribución espacial, que se pueden contextualizar directamente dentro de las arquitecturas de tejidos nativos. Aquí presentamos MARLIN con una descripción gráfica detallada en la Figura 1. Si bien el protocolo presentado está optimizado para miR-181c-3p, es posible estudiar otros miR, dado un diseño de sonda apropiado. Los parámetros críticos para este método incluyen: la evaluación de la calidad del tejido y la optimización de las concentraciones de la sonda. Se recomienda evaluar la integridad del ARN del bloque tisular utilizando una métrica DV200 utilizando dos secciones de 10 μm y extrayendo el ARN utilizando un protocolo que conserve todos los tamaños de fragmentos de ARN. Las muestras con una puntuación DV200 superior a 50 o mejor, y las concentraciones del protocolo, deben analizarse sistemáticamente.

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Protocolo

Este protocolo utiliza tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE) de secciones de tejido tumoral de ovario humano de pacientes con HGSC. Estas muestras se recolectaron de pacientes no tratadas previamente que se sometieron a cirugía citorreductora primaria para cáncer de ovario. Todas las muestras y datos clínicos se obtuvieron del repositorio de cáncer de ovario del Departamento de Oncología Ginecológica y Medicina Reproductiva bajo protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional del MD Anderson de la Universidad de Texas. El personal de recepción obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes y los estudios se realizaron de acuerdo con pautas éticas reconocidas.

1. Preparación de tejidos

  1. Hornee todas las muestras de FFPE durante la noche a 60 °C y limpie cada equipo y herramienta con agua sin ARNasa. Asegúrese de que las secciones tengan un grosor de alrededor de 5 μm.
    NOTA: Este protocolo se ha optimizado para tumores de ovario, pero se puede usar potencialmente con otros tipos de tejido después de realizar más pruebas.
  2. Realice la desparafinación con tres rondas de xileno durante 5 min en cada ronda y 10 rondas de rehidratación durante 3 min en cada ronda (100% etanol (EtOH) 2x, 95% EtOH 2x, 70% EtOH 2x, 50% EtOH 2x, 30% EtOH 2x). Lavar con 1x solución salina tamponada con tris (TBS) durante 2 min, una vez.
    NOTA: Este paso de desparafinado, aunque recomendado, es opcional y depende del tipo de tejido.
  3. Después de la desparafinación y rehidratación, aplicar una solución de Peróxido de Hidrógeno al 3% (H2O2) durante 10 min. Lavar durante 2 minutos con 1x TBS, 2x. Luego, aplique una solución de paraformaldehído (PFA) al 3,7% durante 10 min. Lavar durante 2 minutos con 1x TBS, 2x.
    NOTA: Este paso es opcional y solo debe considerarse para tejidos grasos o muestras propensas a desprenderse.
  4. Proceda a la primera ronda de recuperación de antígenos. Este protocolo utiliza el sistema IR EZ-Retriever. Siguiendo las instrucciones del sistema, cocine las muestras en el microondas mientras se sumergen en tampón EZ-AR1 fresco a 95 °C durante 15 min. Dejar enfriar durante 20 min.
  5. Lavar durante 2 min con 1x TBS. Luego, durante 2 minutos con 1x TBS-T (1x TBS con 0.1% Tween), 2x.

2. Aplicación de proteínas

  1. Dibuje una barrera alrededor de cada sección de tejido con un bolígrafo de barrera hidrofóbico.
  2. Agregue 1x solución bloqueadora de anticuerpos (suficiente para cubrir toda el área del tejido) e incube durante 30 min a temperatura ambiente en una cámara de humedad (humedad ambiental e incontrolada).
  3. Posteriormente, diluir el primer anticuerpo primario con la misma solución de bloqueo, aplicar lo suficiente para cubrir toda el área del tejido y dejar incubar durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara de humedad.
    NOTA: Durante el desarrollo de este protocolo, se utilizó Anti-CD8 en una dilución de 1:75.
  4. Lavar durante 2 min en 1x TBS-T, 3x. A continuación, añadir el HRP Anti-Ms + Rb y dejar incubar las muestras durante 10 min a temperatura ambiente en una cámara de humedad (humedad ambiente y humedad no controlada).
  5. Lavar durante 2 min en 1x TBS-T, 3x. Diluir el primer fluoróforo con el diluyente de amplificación a 1:100 e incubar durante 10 min a temperatura ambiente en la cámara de humedad.
    NOTA: Durante el desarrollo de este protocolo, se utilizó un fluoróforo de emisión de 690 nm. A partir de este punto, se recomienda utilizar una iluminación mínima durante el resto del procedimiento después de aplicar la primera ronda de fluoróforo.
  6. Lavar durante 2 min en 1x TBS-T, 3x. Comience la segunda ronda de tinción de anticuerpos con la segunda ronda de recuperación de antígenos en el microondas, sumergiendo nuevamente las muestras en tampón EZ-AR1 fresco a 95 °C durante 15 min, luego enfriando durante 20 min.
  7. Lavar durante 2 min con 1x TBS. Luego lavar durante 2 minutos con 1x TBS-T, 2x.
  8. Vuelva a aplicar la solución bloqueadora de anticuerpos 1x durante 30 min en una cámara de humedad a temperatura ambiente (humedad ambiente y humedad no controlada).
  9. Diluir el segundo anticuerpo primario con la misma solución de bloqueo, aplicar lo suficiente para cubrir toda el área del tejido y dejar incubar durante la noche a 4 °C en una cámara de humedad durante al menos 16 h.
    NOTA: Durante el desarrollo de este protocolo, se utilizó Anti-EpCAM en una dilución de 1:200.
  10. Comience al día siguiente lavando durante 2 minutos en 1x TBS-T, 3x. A continuación, añadir el HRP Anti-Ms + Rb y dejar incubar las muestras durante 10 min a temperatura ambiente en una cámara de humedad (humedad ambiente y humedad no controlada).
  11. Lavar durante 2 min en 1x TBS-T, 3x. Diluir el segundo fluoróforo con el diluyente de amplificación a 1:100 e incubar durante 10 min a temperatura ambiente en la cámara de humedad.
    NOTA: Durante el desarrollo de este protocolo, se utilizó un fluoróforo de emisión de 620 nm.

3. Aplicación de la sonda

  1. Lavar durante 2 min en 1x TBS-T, 3x.
  2. Inicie la tercera y última extracción de antígenos con EZ-AR1 Elegance en el microondas a 107 °C durante 15 min. Dejar enfriar durante 20 min. Lavar durante 3 min en 1x TBS.
  3. Aplicar RNAscope Proteasa Plus (suficiente para cubrir toda la zona del tejido) y mantener a 40 °C durante 30 min. Usa un horno. Lavar durante 5 min en 1x TBS, 2x.
  4. Realice la preparación de la sonda mediante desnaturalización a 90 °C durante 4 min de la sonda de ARN LNA. A continuación, diluya inmediatamente la sonda utilizando el tampón miRNA-ISH. Agite y gire la solución de la sonda.
    NOTA: Durante el desarrollo de este protocolo, se utilizó la sonda objetivo miR-181c-3p a una dilución de 1:250.
  5. Aplicar la sonda (suficiente para cubrir toda la zona del tejido) y volver a colocar en el horno durante 1 h a 60 °C. Lavar durante 5 min en 5x tampón de citrato sódico salino (SSC).
  6. Realice cinco lavados estrictos en SSC precalentado a 60 °C en el siguiente orden y diluciones durante 5 min cada ronda: una ronda de 5x SSC, dos rondas de 1x SSC y dos rondas de 0,2x SSC.
  7. Lavar durante 5 min en 0,2x SSC a temperatura ambiente. Incubar con tampón de bloqueo durante 30 min a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Use una combinación de 1x TBS y polvo reactivo de bloqueo al 0,5%, asegúrese de agitar y centrifugar la solución de bloqueo antes de la aplicación.
  8. Aplicar un conjugado HRP anti-digoxigenina (ratón) (para estas muestras se utilizó una dilución de 1:500) e incubar durante 30 min a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
  9. Lavar durante 5 min en 1x TBS-T, 3x Aplicar una dilución recomendada de 1:50 del fluoróforo de Amplificación de Señal de Tiramida más Cianina 3 (TSA+Cy3) durante 10 min en una cámara de humedad a temperatura ambiente (humedad ambiente y no controlada). Asegúrese de agitar y centrifugar la solución TSA+Cy3 antes de la aplicación.
  10. Lavar durante 5 min en 1x TBS-T, 3x.

4. Tinción nuclear y montaje

  1. Aplicar la solución de trabajo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (suficiente para cubrir toda el área del tejido) durante 5 min a temperatura ambiente en una cámara humidificada (humedad ambiente y no controlada).
    NOTA: Para este protocolo, se utilizó una dilución de 1:1000, con el stock DAPI de trabajo diluido en TBS).
  2. Lavar durante 5 min en 1x TBS-T, 3x. Al finalizar, aplique cubreobjetos con medios de montaje y deje que los portaobjetos se sequen durante 10 min. Almacene los portaobjetos a 4 °C en la oscuridad entre 24 y 72 h antes de la obtención de imágenes y hasta tres meses después.

5. Imágenes y análisis

  1. Para obtener imágenes, use un microscopio de escaneo de portaobjetos (preferido) con un aumento de 40x.
  2. Realice un análisis cuantitativo posterior para enumerar los puntos utilizando DAPI y contratinción de proteínas para la segmentación y el fenotipado celular.
    NOTA: Durante este protocolo, utilizamos imágenes con un Phenoimager HT. Los escaneos de diapositivas completas se capturaron con un aumento de 40x utilizando filtros apropiados para los fluoróforos presentes, y las imágenes multiplexadas se exportaron como archivos OME-TIFF. Las imágenes escaneadas se cargaron en el software de análisis de imágenes Visiopharm para su análisis cuantitativo.

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Resultados

Al probar este protocolo, es importante tener dos secciones seriadas de la misma muestra representativa para mayor precisión y comparación. En este caso, se utilizó una muestra de cáncer de ovario de alto grado (HGSC) para comparar los resultados. Se utilizó un portaobjetos de control (Figura 2A-B) que solo pasaría por la tinción de miARN y un portaobjetos de prueba que se sometería a tinción de proteínas y m...

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Discusión

Aunque se reconoce y comprende la importancia de los miARN, las observaciones tanto del desarrollo normal como de los estados de enfermedad se ven obstaculizadas actualmente por la dificultad de estudiar los miARN utilizando métodos estándar. La escasez de métodos in situ condujo al desarrollo de MARLIN (ensayo de miRNA FISH). Dada la homología y la corta longitud de los miARN, se convierte en un desafío visualizar su ubicación y efecto en la regulación posttranscriptómica. El d...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría reconocer a las siguientes personas, Chi Lam Au Yeung y Manjunath Nimmakayalu, que formaron parte del comité de tesis de Basant mientras se desarrollaba el ensayo. Además, Samuel Mok, quien seccionó y proporcionó las muestras utilizadas. Por último, agradecemos a Johan Doré y Dan Winkowski, que brindaron una amplia asistencia durante el análisis y el uso del software Visiopharm. Esta investigación fue financiada en parte por la Alianza para la Investigación del Cáncer de Ovario (OCRA 811621 y 891490), la Fundación Sie y el Fondo de Dotación Stephanie C. Stelter. Esta investigación se realizó en colaboración con el Centro Central de Citometría de Flujo e Imágenes Celulares, que cuenta con el apoyo en parte de los Institutos Nacionales de Salud a través de la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico P30 CA016672 del M. D. Anderson y el Especialista en Investigación del NCI 1 R50 CA243707-01A1 de Jared Burks.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10x solución salina con TIS bufferizada (TBS) pH 7,6 Thermo Fisher Scientific  J62662  K7Para lavados intermitentes entre pasos
1x Diluente/Bloqueo de Anticuerpos de Ópalo y nbsp;Akoya BiosciencesARD1001EASolución bloqueadora de proteínas
Diluyente de amplificación de automatización 1x PlusAkoya Biosciences FP1609Usado para diluir fluoróforos de ópalo
20x Concentrado  Amortiguador de citrato de sodio salino (SSC)Sigma-AldrichS6639-1LPara lavados de miARN tras la hibridación con sonda
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y nbsp;Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenEN62248 / 62248Para tinción nuclear
Sistema de Hibridación ACD HybEZ IIACD Biotechne321711Horno utilizado para regular la temperatura durante el protocolo miRNAscope
Anti-CD8 (D8A8Y), conejo mAbTecnologías de señalización celular85336SEjemplo de anticuerpo primario utilizado para optimizar este protocolo
Anti-digoxigenina (ratón) Conjugado HRPRevvity Health Sciences IncNEF832001EAReactivo secundario utilizado para la detección de miARN
Anti-EpCAM (E6V8Y), Rabbit mAbTecnologías de señalización celular93790Ejemplo de anticuerpo primario utilizado para optimizar este protocolo
Polvo reactivo bloqueanteAkoya Biosciences FP1012Solución bloqueadora de miARN
Alcohol etílico 100% (200 grados)Pharmco111000200Para la deparafinización
Búfer EZ-AR1BioGeneXHK521-XAKUtilizado para la recuperación de antígenos de secciones de tejido FFPE en la fase de proteínas
Amortiguador EZ-AR1 EleganceBioGeneXHK546-XAKUtilizado para la recuperación de antígenos de secciones de tejido FFPE en el paso de la sonda de miARN
Sistema IR EZ-RetrieverBioGeneXMW015-IRMicroondas utilizado para la extracción de antígenos de secciones de tejido FFPE
Solución de Peróxido de Hidrógeno 30% Sigma-Aldrich & nbsp;HX0640-5 Para la preparación de tejidos. Ayuda a bloquear la actividad endógena de la peroxidasa y a producir productos muy coloreados
Sonda de miARN miR-181c-3pQiagen339112Ejemplo de la sonda de miRNA utilizada para optimizar este protocolo
Conjunto de Búfer de miARN ISH (FFPE) de LNA miRCURYQiagen339450 Usado para diluir la sonda de miRNA
Opal 620Akoya Biosciences FP1495001KTFluoróforo para identificar anticuerpos primarios
Opal 690 Akoya Biosciences FP1497001KTFluoróforo para identificar anticuerpos primarios
Opal Anti-Ms + Rb HRPAkoya BiosciencesARH1001EAAnticuerpo secundario utilizado como agente de detección
Pierce 16% Formaldehído (w/v), libre de metanolThermo Fisher Scientific28908Obtener un 3,7% de PFA para la preparación de tejidos
Antifundido de diamante ProLongThermo Fisher ScientificP36970Medios de montaje
RNAscope Proteasa PlusACD Biotechne322331Para permeabilizar secciones tisulares   digiriendo parcialmente proteínas y exponer moléculas de miARN objetivo
Agua libre de ARN y nbsp;Corning 46-000-CM Limpiar y preparar todo el equipo, y usarlo como diluyente cuando sea necesario...  
Preadolescentes 20Sigma-AldrichP1379-25MLPara crear TBS-T
Amplificación de señal de tiramida más cianina 3Akoya Biosciences NEL744001KTFluoróforo para identificar miARN
Sondas de miARN U6 y ScrambleQiagen339459Sondas de control opcionales
Grado histológico de xilenosThermo Fisher ScientificUN1307Para la deparafinización

Referencias

  1. Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature). Cancers. 14 (10), 2569(2022).
  2. Davis-Dusenbery, B. N., Hata, A. Microrna in cancer: The involvement of aberrant microrna biogenesis regulatory pathways. Genes Cancer. 1 (11), 1100-1114 (2010).
  3. Peng, Y., Croce, C. M. The role of microRNAs in human cancer. Signal Transduct Targeted Ther. 1 (1), 15004(2016).
  4. Shi, Y., et al. Mirnas and cancer: Key link in diagnosis and therapy. Genes. 12 (8), 1289(2021).
  5. Juźwik, C. A., et al. MicroRNA dysregulation in neurodegenerative diseases: A systematic review. Prog Neurobiol. 182, 101664(2019).
  6. Pauley, K. M., Cha, S., Chan, E. K. L. Microrna in autoimmunity and autoimmune diseases. J Autoimmun. 32 (3-4), 189-194 (2009).
  7. Lee, Y. S., Dutta, A. Micrornas in cancer. Ann Rev Pathol Mech Dis. 4 (1), 199-227 (2009).
  8. Thomson, D. W., et al. Assessing the gene regulatory properties of argonaute-bound small rnas of diverse genomic origin. Nuc Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
  9. Kim, Y. K., Han, J. Nobel-winning microRNA, the microRNAestro of gene silencing. Mol Cells. 47 (11), 100123(2024).
  10. Lai, X., Eberhardt, M., Schmitz, U., Vera, J. Systems biology-based investigation of cooperating microRNAs as monotherapy or adjuvant therapy in cancer. Nuc Acid Res. 47 (15), 7753-7766 (2019).
  11. Garzon, R., Marcucci, G., Croce, C. M. Targeting micrornas in cancer: Rationale, strategies and challenges. Nat Rev Drug Disc. 9 (10), 775-789 (2010).
  12. Jiao, X., et al. MicroRNA: The impact on cancer stemness and therapeutic resistance. Cells. 9 (1), 8(2019).
  13. Lin, B., Jiang, J., Jia, J., Zhou, X. Recent advances in exosomal miRNA biosensing for liquid biopsy. Molecules. 27 (21), 7145(2022).
  14. Farrell, D., et al. The identification of circulating miRNAs in bovine serum and their potential as novel biomarkers of early Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection. PLoS One. 10 (7), e0134310(2015).
  15. Aparicio-Puerta, E., et al. Srnabench and srnatoolbox 2022 update: Accurate mirna and sncrna profiling for model and non-model organisms. Nuc Acid Res. 50 (W1), W710-W717 (2022).
  16. Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. Mirdeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nuc Acid Res. 40 (1), 37-52 (2012).
  17. Chou, C. H., et al. Mirtarbase 2016: Updates to the experimentally validated miRNA-target interactions database. Nuc Acid Res. 44 (D1), D239-D247 (2016).
  18. Porichis, F., et al. High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry. Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).
  19. Eichert, A., et al. The crystal structure of an 'all locked' nucleic acid duplex. Nuc Acid Res. 38 (19), 6729-6736 (2010).
  20. Viratham Pulsawatdi, A., et al. A robust multiplex immunofluorescence and digital pathology workflow for the characterisation of the tumour immune microenvironment. Mol Oncol. 14 (10), 2384-2402 (2020).
  21. Janati-Idrissi, S., et al. Looking for a needle in a haystack: De novo phenotypic target identification reveals hippo pathway-mediated mir-202 regulation of egg production. Nuc Acid Res. 52 (2), 738-754 (2024).

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