Method Article

Detección secuencial de biomoléculas en muestras fijadas en formol e incluidas en parafina con imágenes de espectrometría de masas

DOI:

10.3791/68618

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October 24th, 2025

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1Department of Chemistry, University of Texas at Austin, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo de imágenes de espectrometría de masas para la detección secuencial de metabolitos, glicanos ligados a N y péptidos trípticos en muestras de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los tejidos son entornos celulares complejos, formados por una amplia gama de tipos de células y biomoléculas que interactúan entre sí para llevar a cabo las funciones del órgano. Tradicionalmente, las técnicas para el análisis de biomoléculas como metabolitos, glicanos y proteínas implicaban la homogeneización de tejidos, destruyendo toda la información espacial. Estos métodos tradicionales inhibieron la comprensión completa de las complejas interacciones moleculares intra y extracelulares. Las imágenes de espectrometría de masas (MSI), por otro lado, no solo preservan la información espacial de las biomoléculas en el tejido, sino que también permiten detectar múltiples clases de analitos de la misma sección de tejido a través del análisis secuencial con una resolución de casi una sola célula. Esto nos permite obtener una imagen más completa de las interacciones moleculares entre diferentes clases de biomoléculas. El protocolo presentado aquí describe los pasos para realizar imágenes de espectrometría de masas de metabolitos, glicanos ligados a N y péptidos trípticos secuencialmente de la misma sección de tejido a una resolución de 20 μm. La consideración concienzuda del orden en que se obtienen las imágenes de las clases de analitos, junto con un manejo cuidadoso de las secciones para garantizar la integridad, permite recopilar múltiples imágenes de alta calidad de la misma sección. Estos datos pueden integrarse posteriormente con otros datos ómicos espaciales (transcriptómica, inmunohistoquímica, etc.) recogidos de secciones seriadas, donde la misma célula puede ser analizada en estas secciones adyacentes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La Imagen por Espectrometría de Masas (MSI) es una poderosa técnica que permite la detección y visualización de cientos a miles de biomoléculas a partir de secciones delgadas de tejido, sin necesidad de un conocimiento a priori de las moléculas exactas presentes en el tejido, lo que la convierte en una excelente herramienta para el descubrimiento de biomarcadores1. Si bien diferentes laboratorios utilizan varios tipos de MSI, incluida la ionización por electropulverización por desorción (DESI)2,3, la ionización por electropulverización por desorción láser asistida por matriz infrarroja (IR-MALDESI)4 y la espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS)5, la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) sigue siendo la más utilizada y la más versátil. La mayoría de las clases de biomoléculas pueden ser detectadas por MSI adaptando la preparación de la muestra, incluido el lavado/pretratamiento del tejido, la digestión enzimática y la matriz/disolvente utilizado 6,7. MALDI MSI se ha utilizado para la detección de metabolitos, lípidos, glicanos, proteínas y péptidos proteolíticos.

Los estudios de MSI se han utilizado en una variedad de estudios clínicos y preclínicos para comprender mejor los mecanismos de la enfermedad 8,9, mejorar la clasificación y la estadificación del cáncer10,11, predecir el resultado del tratamiento12, mejorar el diagnóstico13 y determinar los márgenes tumorales moleculares14, entre otros. La mayoría de estos estudios se han centrado en la detección de una sola clase de analitos. Sin embargo, a menudo es interesante analizar más de una clase de biomoléculas de la misma muestra. Tradicionalmente, eso se ha realizado con secciones seriadas de tejidos. Pero más recientemente, se han mostrado ejemplos de análisis secuencial de múltiples clases de analitos de la misma sección de tejido. Por ejemplo, Yagnik et al. han demostrado imágenes lipídicas de tejido congelado seguidas de inmunohistoquímica MALDI de la misma sección para la clasificación del tipo de célula15. Clift et al. han demostrado la aplicación secuencial de PNGasaF, colagenasa y tripsina a secciones de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE) para obtener imágenes de glicanos ligados a N, proteínas de la matriz extracelular y proteínas generales, respectivamente16. Escobar et al. demostraron el análisis secuencial de glicanos ligados a N, O-GlcNAc y péptidos trípticos de la misma sección de tejido congelado17. Este tipo de experimentos se logran a través de una cuidadosa planificación experimental para analizar primero los analitos que se pierden más fácilmente, seguidos de los que son más estables en el tejido. En muchos casos, los lavados que se utilizan para eliminar clases de moléculas no deseadas ayudan a mejorar otras clases de moléculas6, una propiedad que se puede aprovechar, donde cada lavado que elimina la matriz aplicada anteriormente también ayuda a mejorar la señal de la siguiente clase de analitos a fotografiar.

Recientemente, publicamos un flujo de trabajo para el análisis secuencial de metabolitos, glicanos ligados a N y péptidos trípticos de la misma sección de tejido de cáncer de ovario FFPE18. Aquí, presentamos el flujo de trabajo detallado para el análisis de estas tres clases de biomoléculas de la misma sección de tejido; en la Figura 1 se detalla una descripción general del protocolo. Hasta donde sabemos, este es el primer protocolo que describe en detalle este flujo de trabajo para imágenes secuenciales de tejido FFPE. Brevemente, las secciones de tejido se desparafinan con xileno antes de recubrirlas con matriz de 1,5-diaminonaftaleno (10 mg / ml en acetonitrilo al 50%) para obtener imágenes de metabolitos en modo de iones negativos. A continuación, se retira la matriz, se rehidratan las secciones y se recuperan los antígenos, antes de rociarlas con PNGasa F (0,1 μg/μL en bicarbonato de amonio) para liberar glicanos ligados al N in situ. Después de la incubación, las secciones se recubren con una matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) (10 mg / ml en acetonitrilo al 70%, ácido trifluoroacético al 0,1%) y se obtienen imágenes en modo de iones positivos. A continuación, se retira de nuevo la matriz, se repite la rehidratación y la recuperación de antígenos, y las secciones se pulverizan con tripsina (0,075 μg/μL en bicarbonato de amonio) y se incuban antes de volver a recubrirlas con la matriz CHCA (10 mg/mL en acetonitrilo al 70%, ácido trifluoroacético al 0,1%) y se obtienen imágenes en modo de iones positivos. Todas las soluciones deben prepararse frescas, inmediatamente antes de su uso, y si es posible, los experimentos deben llevarse a cabo durante 3 días consecutivos. Si se producen retrasos, las secciones deben almacenarse en un congelador a -80 °C bajo desecación.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo utiliza tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE) recolectados de pacientes no tratadas previamente que se sometieron a cirugía citorreductora primaria para carcinoma de ovario seroso de alto grado. Todos los datos clínicos se obtuvieron del repositorio de cáncer de ovario del Departamento de Oncología Ginecológica y Medicina Reproductiva bajo protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional del MD Anderson de la Universidad de Texas. El personal de recepción obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes y los estudios se realizaron de acuerdo con pautas éticas reconocidas.

1. Preparación de muestras de imágenes de metabolitos

NOTA: Este protocolo asume que las secciones de tejido fijado en formol e incluido en parafina (4 μm de espesor) ya se han montado en portaobjetos de microscopio de vidrio, ya que las muestras clínicas generalmente deben ser seccionadas dentro de un núcleo de patología clínica por histotécnicos. Como el trabajo presentado aquí se realiza en el instrumento TOF al que se hace referencia, la medición ortogonal de TOF alivia la necesidad de portaobjetos conductores utilizados tradicionalmente en los experimentos MSI. El uso de portaobjetos de microscopio estándar también es más propicio para los flujos de trabajo estándar en los laboratorios de patología clínica, además de permitir el uso de tejido de archivo que ya está en los portaobjetos.

  1. Haga marcas fiduciales en las cuatro esquinas de la diapositiva con un trazador de diamante.
  2. Desparafina las secciones por inmersión en xileno de grado histológico durante 3 min.
    NOTA: El xileno es nocivo y debe usarse en una campana extractora química.
  3. Sumerja las secciones en xileno fresco durante 3 min.
  4. Deje que el portaobjetos se seque a temperatura ambiente.
  5. Coloque la diapositiva en un destino adaptador de diapositiva.
  6. Adquiera una imagen óptica del portaobjetos utilizando un escáner plano con una resolución de 4.800 ppp.
  7. Haga una matriz MALDI disolviendo 15 mg de 1,5-diaminonaftaleno (DAN) en 1,5 ml de ACN al 50%. Sonicar hasta que se disuelva por completo, ~5 min. Filtre la solución de matriz antes de cargarla en el bucle de muestra.
    NOTA: Se sospecha que DAN es un carcinógeno y debe usarse con el equipo de protección personal adecuado. La pulverización de matriz debe realizarse en una campana extractora química.
  8. Rocíe el portaobjetos con solución DAN utilizando un pulverizador de reactivos robótico con los siguientes parámetros: Velocidad de la pista - 1.200 mm/s; Espaciado de la pista - 3 mm; Temperatura de la boquilla - 60 °C; Altura de la boquilla - 40 mm; Caudal: 100 μl/min; Pases - 4; N 2 Presión - 10 psi; Patrón - CC
  9. Aplique 0,5 μl de fósforo rojo suspendido en metanol en una ubicación conocida del portaobjetos.

2. Recopilación de datos de imágenes de metabolitos

  1. Coloque las diapositivas preparadas en un adaptador de diapositivas II y cárguelas en un espectrómetro de masas timsTOF fleX MALDI QTOF.
  2. Cargue el método apropiado para la recopilación de datos en modo de iones negativos en timsControl con tims OFF. Si el instrumento aún no estaba en modo de iones negativos, espere al menos 25 minutos después de cambiar la polaridad para el equilibrio antes de la calibración y la recopilación de datos con los siguientes parámetros del instrumento para metabolitos: rango m / z - 50 - 600; Rango de escaneo láser: 16,0 μm tanto en X como en Y; Tamaño de campo resultante: 20,0 μm tanto en X como en Y; Disparos láser - 150; Fluencia láser - ~30%; Embudo 1 RF - 150.0 Vpp; Embudo 2 RF - 200.0 Vpp; RF multipolar - 200.0 Vpp; Energía de colisión - 10.0 eV; RF de colisión - 500.0 Vpp; Tiempo de transferencia - 55,0 μs; Almacenamiento PrePulse - 5.0 μs (Figura complementaria S1).
  3. Realice un perfil de destino (haga clic en el botón Generar ahora ) y un ajuste de enfoque (haga clic en el botón Ajustar ahora ) en la pestaña Portadora de muestra. Ajuste la posición del láser en X e Y, si es necesario en la pestaña del láser para asegurarse de que el láser esté exactamente alineado con la cruz.
  4. Recolecte un espectro de fósforo rojo sumando al menos cinco series de disparos láser desde el punto en la diapositiva.
  5. Realice una calibración haciendo clic en el botón Calibrar de la pestaña Calibración. Elimine cualquier pico con un error de ppm muy baja o alta.
    NOTA: Incluso los grupos de fósforo (P2 y P4) generalmente dan una señal muy débil. La puntuación de calibración debe ser del 100% antes de hacer clic en aceptar. Si no, despeje el espectro sumado y adquiera uno nuevo.
  6. Inicie el software flexImaging. La GUI de adquisición de imágenes se iniciará automáticamente.
  7. Seleccione Configurar una nueva ejecución de imágenes en la ventana Elegir ejecución de imágenes .
  8. Elija Flujo de trabajo clásico en la ventana Seleccionar flujo de trabajo .
  9. En la ventana Almacenamiento de datos , proporcione un nombre de ejecución de imágenes y un directorio de resultados para los datos.
    NOTA: No se deben usar espacios en los nombres de archivo.
  10. En la ventana Configuración de adquisición , elija Regiones de medición definidas por el usuario y escriba 20 en el cuadro Ancho de ráster . Haga clic en Examinar para seleccionar el método timsControl creado anteriormente.
  11. En la ventana Imagen de muestra , haga clic en Examinar para seleccionar la imagen óptica adquirida con el escáner plano.
  12. En la ventana Muestra de aprendizaje , realice una alineación de tres puntos entre la imagen óptica y la diapositiva; luego, mueva el portador de muestras al primer fiducial grabado en la diapositiva y alinee la cruz en timsControl con una característica distintiva en el grabado. Amplíe la imagen (se recomienda un zoom del 100%), configure la imagen de muestra en Establecer puntos de aprendizaje y haga clic en la misma ubicación en la imagen óptica. Repita este proceso 2 veces más para un total de tres puntos de aprendizaje. Haga clic en Siguiente para completar la enseñanza.
  13. Haga clic en Aceptar para salir del Asistente para nueva ejecución de imágenes.
  14. Compruebe la precisión de la enseñanza haciendo clic en el botón Colocar portador de muestras en el software. Acerque y haga clic en una característica distintiva del cuarto punto fiducial (no utilizado) en la imagen; el portador de muestras se moverá a esta posición dentro de timsControl. Confirme que la cruz se alinea con la entidad seleccionada. Si no se alinean, borre la enseñanza en flexImaging y repita el proceso de enseñanza para mejorar la precisión.
  15. En el software, seleccione la herramienta Agregar región de medición de polígonos y delinee los tejidos que se van a visualizar. Cada clic del mouse creará un punto de anclaje. Presione el botón de retroceso en el teclado para eliminar puntos, uno por uno. Una vez dibujada la región, haga doble clic con el ratón para cerrar el polígono.
  16. Verifique la señal disparando el láser en algunos lugares dentro del tejido. Haga clic en una ubicación de la imagen utilizando el botón Colocar portador de muestras , como en el Paso 2.14, para comprobar la enseñanza. El espectro estará dominado por picos de matriz alrededor de m/z 157 y 313; Amplíe la región M / Z por debajo de 154 y 250-300 para mostrar muchos picos de metabolitos y ácidos grasos de moléculas pequeñas, respectivamente. Ajuste la fluencia del láser según sea necesario para obtener una señal óptima.
  17. Guarde el método timsControl.
  18. Inicie la adquisición de imágenes haciendo clic en el botón Iniciar ejecución de AutoXecute en el software
    NOTA: La obtención de imágenes en modo de iones negativos con matriz DAN da como resultado la detección de numerosos metabolitos del ciclo del TCA, aminoácidos y ácidos grasos, entre otros.

3. Preparación de muestras para imágenes de glicanos ligados a N

  1. Después de retirar la muestra del espectrómetro de masas, retire la matriz DAN sumergiendo el portaobjetos en etanol al 100% (200 grados) durante 1 min.
  2. Rehidratar el portaobjetos en frascos Coplin: etanol fresco al 100% durante 1 min; etanol al 95% durante 1 min; etanol al 70% durante 1 min; Riegue durante 3 min; Agua fresca durante 3 min.
  3. Deje que el portaobjetos se seque durante ~ 15 min.
  4. Realice la recuperación de antígenos sumergiendo el portaobjetos en un tampón Tris de 100 mM (hecho disolviendo 6,06 g de Tris Base en 500 mL de agua y ajuste el pH según sea necesario), pH 9, en un frasco Coplin con una tapa colocada sin apretar en la parte superior que se coloca en una cámara de desmontaje con 500 mL de agua en la cámara. Calentar a 95 °C durante 20 min.
  5. Retire el frasco Coplin de la cámara de desmontaje y colóquelo sobre la mesa para que se enfríe durante 20 min.
  6. Cambie el tobogán por agua durante cinco cambios. Para los primeros tres, vierta la mitad de la solución y reemplácela con agua. Para los dos últimos, vierte toda la solución y reemplázala con agua.
  7. Deje que el portaobjetos se seque por completo.
  8. Cree una cámara de humedad para la incubación del portaobjetos después de la aplicación de PNGaseF. Corta un círculo de una toallita absorbente para cubrir el fondo de una placa de Petri de 100 mm de diámetro. Enrolle dos toallitas de laboratorio para crear almohadas a cada lado de la placa de Petri (Figura 2). Añadir 8 ml de agua para saturar estas toallitas y tapar la placa de Petri y colocarla en un horno a 37 °C durante al menos 30 min para precalentar.
    NOTA: El interior del plato debe parecer humeante.
  9. Prepare PNGaseF reconstituyendo 100 μg de enzima liofilizada en 200 μL de bicarbonato de amonio 100 mM, pH 7.8 y vórtice para mezclar. Transfiera la solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y diluya a 1 ml con agua.
  10. Rocíe el portaobjetos con PNGaseF utilizando el pulverizador de reactivos robótico con los siguientes parámetros. Utilice la bomba de jeringa para aplicaciones de bajo volumen / bajo caudal: Velocidad de la pista - 1200 mm / s; Espaciado de la pista - 3 mm; Temperatura de la boquilla - 45 °C; Altura de la boquilla - 40 mm; Caudal: 25 μl/min; Pases - 15; N 2 Presión - 10 psi; Patrón - CC
  11. Coloque el portaobjetos en la placa de Petri precalentada, con el pañuelo hacia arriba, con un extremo en cada una de las almohadillas de limpieza de laboratorio. Vuelva a colocar el portaobjetos y selle la placa de Petri con una película de sellado adhesiva. Coloque en el horno a 37 ° C y coloque una almohadilla térmica para reptiles a 40 ° C encima de la placa de Petri.
    NOTA: Esto mantiene la tapa en la parte más caliente del plato y evita que se forme condensación en la tapa y caiga sobre el pañuelo, lo que causará artefactos en las imágenes.
  12. Incube el portaobjetos durante 2 h para permitir que continúe la digestión.
  13. Retire el portaobjetos de la placa de Petri y déjelo secar durante ~ 5 min.
  14. Hacer la matriz MALDI disolviendo 15 mg de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) en 1,5 ml de 70% de ACN, 0,1% de TFA, 10 mM de fosfato de amonio.
    NOTA: TFA es cáustico y debe usarse en una campana con el equipo de protección personal adecuado.
  15. Sonicar hasta que se disuelva por completo, ~5 min.
  16. Filtre la solución de matriz antes de cargarla en el bucle de muestra.
  17. Rocíe el portaobjetos con CHCA utilizando el pulverizador de reactivos robótico con los siguientes parámetros: Velocidad de la pista - 1.200 mm/s; Espaciado de la pista - 3 mm; Temperatura de la boquilla - 75 °C; Altura de la boquilla - 40 mm; Caudal: 120 μl/min; Pases - 3; N 2 Presión - 10 psi; Patrón - HH
  18. Aplique 0,5 μl de fósforo rojo suspendido en metanol en una ubicación conocida del portaobjetos.

4. Recopilación de datos de imágenes de glicanos ligados a N

  1. Coloque las diapositivas preparadas en el objetivo del adaptador de diapositivas y cárguelas en el espectrómetro de masas MALDI QTOF.
  2. Cargue el método apropiado para la recopilación de datos en modo de iones positivos en timsControl. Si el instrumento aún no estaba en modo de iones positivos, espere al menos 25 minutos después de cambiar la polaridad para el equilibrio antes de la calibración y la recopilación de datos con los siguientes parámetros del instrumento para glicanos: rango m/z - 700-3500; Rango de escaneo láser: 16,0 μm tanto en X como en Y; Tamaño de campo resultante: 20,0 μm tanto en X como en Y; Disparos láser - 200; Fluencia láser - ~25%; Embudo 1 RF - 450.0 Vpp; Embudo 2 RF - 500.0 Vpp; RF multipolar - 500.0 Vpp; Energía de colisión - 10.0 eV; RF de colisión - 2,700.0 Vpp; Tiempo de transferencia - 140,0 μs; Almacenamiento PrePulse - 14.0 μs (Figura complementaria S2).
  3. Realice un perfil de objetivo (haga clic en el botón Generar ahora ) y un ajuste de enfoque (haga clic en el botón Ajustar ahora ) en la pestaña Portador de muestra . Ajuste la posición del láser en X e Y, si es necesario, en la pestaña láser para asegurarse de que el láser esté alineado con la cruz.
  4. Recolecte un espectro de fósforo rojo sumando al menos cinco series de disparos láser desde el punto en la diapositiva.
  5. Realice una calibración haciendo clic en el botón Calibrar de la pestaña Calibración. Elimine cualquier pico con un error de ppm muy baja o alta.
    NOTA: La puntuación de calibración debe ser del 100% antes de hacer clic en aceptar. Si no, despeje el espectro sumado y adquiera uno nuevo.
  6. Abra el archivo .mis utilizado anteriormente para la obtención de imágenes de metabolitos en el software.
  7. Guarde el archivo con un nuevo nombre que indique que se trata de datos de glicanos.
  8. En Editar | Propiedades de ejecución de imágenes, cambie el método de adquisición al método de glicanos deseado.
  9. Borra la enseñanza anterior usando Editar | Puntos de aprendizaje claros.
    NOTA: La corredera no estará exactamente en la misma posición después de quitarla y volver a cargarla en el adaptador de corredera.
  10. Realizar nuevas enseñanzas usando Editar | Establecer puntos de aprendizaje; establezca 3 puntos como se hizo en el Asistente de imágenes original (Paso 2.12).
  11. Compruebe la precisión de la enseñanza haciendo clic en el botón Colocar portador de muestras en el software. Acérquese y haga clic en una característica distintiva del cuarto punto fiducial (no utilizado) de la imagen. El portador de muestras se moverá a esta posición dentro de timsControl; Confirme que la cruz se alinea con la entidad seleccionada.
    NOTA: Si la mira no se alinea, borre la enseñanza y repita el proceso de enseñanza para mejorar la precisión.
  12. Guarde el archivo.
  13. Verifique la señal disparando el láser en algunos lugares dentro del tejido. Haga clic en una ubicación de la imagen utilizando el botón Colocar portador de muestra como en el paso 4.11 para comprobar la enseñanza. Confirme que el espectro tiene abundantes picos de glicanos con picos dominantes típicamente en m / z 1,663 y 1,809. Ajuste la fluencia del láser según sea necesario para obtener una señal óptima.
  14. Guarde el método timsControl.
  15. Inicie la adquisición de imágenes haciendo clic en el botón Iniciar ejecución de AutoXecue .

5. Preparación de muestras para imágenes de péptidos trípticos

  1. Retire la matriz CHCA sumergiendo el portaobjetos en etanol al 100% (200 grados) durante ~1 min
  2. Rehidrate el portaobjetos en frascos Coplin de la siguiente manera: Etanol fresco al 100% durante 1 min; etanol al 95% durante 1 min; etanol al 70% durante 1 min; Riegue durante 3 min; Agua fresca durante 3 min.
  3. Deje que el portaobjetos se seque durante ~ 15 min.
  4. Realice la recuperación de antígenos sumergiendo el portaobjetos en tampón Tris de 100 mM, pH 9, en un frasco Coplin con una tapa colocada sin apretar en la parte superior que se coloca en una cámara de desmoldeo con 500 ml de agua en la cámara. Calentar a 95 °C durante 20 min.
    NOTA: Esta segunda recuperación de antígenos es necesaria para desnaturalizar las proteínas para un acceso más eficiente de la tripsina a los sitios de escisión.
  5. Retire el frasco Coplin de la cámara de desmontaje y colóquelo sobre la mesa para que se enfríe durante 20 min.
  6. Cambie el tobogán por agua durante cinco cambios. Para los primeros tres, vierta la mitad de la solución y reemplácela con agua. Para los dos últimos, vierte toda la solución y reemplázala con agua.
  7. Deje que el portaobjetos se seque por completo.
  8. Prepare tripsina reconstituyendo 100 μg de enzima liofilizada en 200 μL de ácido acético 100 mM y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Alícuotas en tamaños apropiados para el experimento (normalmente 40 μL) y almacenar a -20 °C.
  9. Prepare una alícuota de 40 μL de tripsina agregando 350 μL de bicarbonato de amonio 100 mM, pH 7.8 y 39 μL de ACN. Mezclar bien.
    NOTA: El acetonitrilo (10% de ACN) aumenta la actividad de la tripsina en comparación con la solución acuosa y reduce la tensión superficial de la solución para pulverizar19.
  10. Rocíe el portaobjetos con tripsina usando un rociador de reactivos robótico con los siguientes parámetros. Utilice la bomba de jeringa para aplicaciones de bajo volumen/bajo caudal: Velocidad de la pista - 750 mm/s; Espaciado de la pista - 3 mm; Temperatura de la boquilla - 30 °C; Altura de la boquilla - 40 mm; Caudal: 10 μl/min; Pases - 12; N 2 Presión - 10 psi; Patrón - HH
  11. Coloque un cuadrado de toallita absorbente en el fondo de una placa de Petri de 100 mm de diámetro; asegúrese de que las esquinas toquen el borde del plato y distribuya 1 ml de agua sobre la toallita.
  12. Coloque el portaobjetos encima de la toallita, con el pañuelo hacia arriba, coloque la tapa en la placa de Petri y selle la placa de Petri con una película adhesiva de sellado.
  13. Incubar el portaobjetos durante 4 h a 37 °C para permitir que la digestión continúe.
  14. Retire el portaobjetos de la placa de Petri y déjelo secar durante ~ 5 min.
  15. Hacer matriz MALDI disolviendo 15 mg de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) en 1,5 ml de 70% de ACN, 0,1% de TFA, 10 mM de fosfato de amonio.
  16. Sonicar hasta que se disuelva por completo, ~5 min.
  17. Filtre la solución de matriz antes de cargarla en el bucle de muestra.
  18. Rocíe el portaobjetos con CHCA utilizando un pulverizador de reactivos robótico con los siguientes parámetros: Velocidad de la pista - 1200 mm/s; Espaciado de la pista - 3 mm; Temperatura de la boquilla - 75 °C; Altura de la boquilla - 40 mm; Caudal: 120 μl/min; Pases - 4; N 2 Presión - 10 psi; Patrón - HH
  19. Aplique 0,5 μl de fósforo rojo suspendido en metanol en una ubicación conocida del portaobjetos.

6. Recopilación de datos de imágenes de péptidos trípticos

  1. Coloque las diapositivas preparadas en un adaptador de diapositivas y cárguelas en un espectrómetro de masas timsTOF MALDI QTOF.
  2. Cargue el método apropiado para la recopilación de datos en modo de iones positivos en timsControl. Si el instrumento aún no estaba en modo de iones positivos, espere al menos 25 minutos después de cambiar la polaridad para el equilibrio antes de la calibración y la recopilación de datos utilizando los siguientes parámetros del instrumento para péptidos: rango m / z - 600-4500; Rango de escaneo láser: 16,0 μm tanto en X como en Y; Tamaño de campo resultante: 20,0 μm tanto en X como en Y; Disparos láser - 200; Fluencia láser - ~25%; Embudo 1 RF - 450.0 Vpp; Embudo 2 RF - 500.0 Vpp; RF multipolar - 600.0 Vpp; Energía de colisión - 10.0 eV; RF de colisión - 3400.0 Vpp; Tiempo de transferencia - 180.0 μs; Almacenamiento PrePulse - 18.0 μs (Figura complementaria S3).
  3. Realice un perfil de destino (haga clic en el botón Generar ahora ) y un ajuste de enfoque (haga clic en el botón Ajustar ahora ) en la pestaña Portadora de muestra. Ajuste la posición del láser en X e Y, si es necesario, en la pestaña del láser para asegurarse de que el láser esté alineado con la cruz.
  4. Recolecte un espectro de fósforo rojo sumando al menos cinco series de disparos láser desde el punto en la diapositiva.
  5. Realice una calibración haciendo clic en el botón Calibrar de la pestaña Calibración. Elimine cualquier pico con un error de ppm muy baja o alta. Confirme que la puntuación de calibración es del 100% antes de hacer clic en aceptar. Si no, despeje el espectro sumado y adquiera uno nuevo.
  6. Abra el archivo .mis utilizado anteriormente para la obtención de imágenes de glicanos.
  7. Guarde el archivo con un nuevo nombre que indique que se trata de datos de péptidos.
  8. En Editar | Propiedades de ejecución de imágenes, cambie el método de adquisición al método peptídico deseado.
  9. Borra la enseñanza anterior usando Editar | Puntos de aprendizaje claros.
    NOTA: La corredera no estará exactamente en la misma posición después de quitarla y volver a cargarla en el adaptador de corredera.
  10. Realizar nuevas enseñanzas usando Editar | Establecer puntos de aprendizaje; establezca tres puntos como se hizo en el Asistente de imágenes original (Paso 2.12).
  11. Compruebe la precisión de la enseñanza haciendo clic en el botón Colocar portador de muestras . Acérquese y haga clic en una característica distintiva del cuarto punto fiducial (no utilizado) de la imagen. El portador de muestras se moverá a esta posición dentro de timsControl; Confirme que la cruz se alinea con la entidad seleccionada.
    NOTA: Si la mira no se alinea, borre la enseñanza y repita el proceso de enseñanza para mejorar la precisión.
  12. Guarde el archivo.
  13. Verifique la señal disparando el láser en algunos lugares dentro del tejido. Haga clic en una ubicación en la imagen usando el botón Colocar portador de muestra como en el Paso 6.11 para verificar la enseñanza. Confirme que el espectro tiene abundantes picos peptídicos con picos dominantes típicamente en m / z 944, 1,105 y 1,198. Ajuste la fluencia del láser según sea necesario para obtener una señal óptima.
  14. Guarde el método timsControl.
  15. Inicie la adquisición de imágenes haciendo clic en el botón Iniciar ejecución de AutoXecue .

7. Tinción histológica

NOTA: Hay varios métodos disponibles para la hematoxilina y la eosina. Aquí se presenta un método de Carazzi modificado que se usa con frecuencia en este laboratorio.

  1. Retire la matriz CHCA sumergiendo el portaobjetos en etanol al 100% durante 1 min.
  2. Tiñe el portaobjetos de la siguiente manera: etanol al 95% durante 30 s; etanol al 70% durante 30 s; Agua durante 30 s; Hematoxilina durante 2 min; Agua durante 30 s; etanol al 70% durante 30 s; etanol al 95% durante 30 s; Eosina durante 1 min; etanol al 95% durante 30 s; etanol al 100% durante 30 s; Xileno durante 2,5 min; Cubreobjetos con medio de montaje.
  3. Deje que el portaobjetos se seque durante >1 h y elimine las burbujas presionando suavemente el cubreobjetos.
  4. Digitalice con un escáner digital de portaobjetos.

8. Visualización de datos

NOTA: Hay un análisis extenso que se puede hacer con SCiLS Lab que está más allá del alcance de este protocolo. Aquí, solo describiremos la creación básica de archivos, la visualización de datos y la búsqueda de picos en bases de datos para la identificación putativa.

  1. Inicie SCiLS Lab 2025b y elija Nuevo.
  2. Seleccione los archivos de datos que se cargarán en el software.
    NOTA: Con SCiLS Lab Pro, se pueden cargar varios archivos de datos que se recopilaron con los mismos parámetros para normalizarlos entre sí y visualizarlos simultáneamente.
  3. Organice las muestras en el diseño preferido. Mueva las muestras haciendo clic con el botón izquierdo y arrastrando. Gire las muestras haciendo clic con el botón derecho y arrastrando. Seleccione Siguiente.
  4. En la ventana Configuración del eje de masa , realice los ajustes necesarios. Los valores predeterminados generalmente funcionan bien para los datos timsTOF. Haga clic en Siguiente.
  5. En la ventana Búsqueda de características , establezca los valores adecuados para el picking de picos automatizado durante la importación. Haga clic en Siguiente.
    NOTA: Esto no funciona bien para los datos de metabolitos del tejido FFPE y debe omitirse.
  6. La configuración de importación se visualizará en la ventana Resumen de importación . Haga clic en Importar.
  7. Proporcione un nombre de archivo y una ubicación para guardar el archivo SCiLS.
    NOTA: Dependiendo del tamaño del archivo, la importación puede tardar entre unos minutos y varias horas.
  8. Cuando se complete, aparecerá una ventana de resumen . Haga clic en Abrir conjunto de datos importado para interactuar con el archivo SCiLS.
  9. En la parte superior derecha del software, haga clic en el menú desplegable junto a Normalización y seleccione Raíz cuadrada media.
    NOTA: Este es el método más apropiado para los datos timsTOF dada la escasez de los datos de centroide importados y proporcionará la mejor visualización.
  10. En archivo | Propiedades del archivo, establezca el ancho del intervalo en un valor adecuado, normalmente de 10 a 15 ppm para los datos timsTOF. Confirme que el valor es adecuado evaluando si abarca el ancho de un pico en el espectro promedio.
  11. Amplíe el espectro promedio en la parte inferior del software, ya sea haciendo clic y arrastrando o girando la rueda del mouse hacia adelante.
  12. Seleccione un pico para visualizar colocando la cruz en el vértice y haciendo clic con el botón izquierdo en la rueda del mouse.
  13. Agregue iones de interés a la lista activa de imágenes de iones presionando control + barra espaciadora.
  14. Guarde la lista de características seleccionadas haciendo clic en el botón Guardar como lista de características en la parte inferior de la ventana de imágenes de iones en el lado derecho del software.
  15. Abra una lista de entidades guardada haciendo clic en Archivo | Tabla de características y búsqueda usando MetaboScape para ID putativos de metabolitos o glicanos, si MetaboScape está instalado y configurado en la misma red. Alternativamente, convierta los archivos SCiLS a archivos .imzML para importarlos a METASPACE (https://metaspace2020.org/) para su identificación putativa.
    NOTA: Puede encontrar una descripción completa de las capacidades de SCiLS Lab en el Manual del usuario en la opción del menú Ayuda .

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Results

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La finalización de este protocolo debería dar como resultado tres conjuntos de datos MSI sólidos de la misma sección de tejido. En la visualización del espectro completo de los datos de metabolitos, el espectro estará fuertemente dominado por picos de matriz en m / z 157 y 315. Esto es normal para el tejido FFPE. Muchas señales de metabolitos y ácidos grasos se observarán al acercar los rangos m / z < 155 y entre 250 y 300. La Figura 3 muestra ejemplos de rangos de espectro completo y amp...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La recopilación de datos secuenciales de MSI de una sola sección de tejido requiere una cuidadosa atención a los detalles. Hay algunos pasos que son absolutamente cruciales para lograr datos de alta calidad. Primero, se debe tener cuidado si se prepara más de un portaobjetos al mismo tiempo. Al colocar los portaobjetos o moverlos entre frascos Coplin, tenga cuidado de no colocar dos portaobjetos en la misma posición en el frasco. Esto dará como resultado una exposición inadecuada al solv...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EHS y el Centro de Imágenes de Espectrometría de Masas de la Universidad de Texas en Austin cuentan con el apoyo de un Premio del Instituto de Investigación y Prevención del Cáncer de Texas (RP240559). Esta investigación fue financiada en parte por la Alianza para la Investigación del Cáncer de Ovario (OCRA 811621 y 891490), la Fundación Sie y el Fondo de Dotación Stephanie C. Stelter. Esta investigación se realizó en colaboración con el Centro Central de Citometría de Flujo e Imágenes Celulares, que cuenta con el apoyo en parte de los Institutos Nacionales de Salud a través de la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico P30 CA016672 del M. D. Anderson y el Especialista en Investigación del NCI 1 R50 CA243707-01A1 de Jared Burks.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5-diaminonaftalenoFisher ScientificD010125GMatriz MALDI para imágenes de metabolitos
AcetonitriloFisher ScientificA955-4Disolvente de grado LC-MS utilizado para la preparación de matrices
Ácido &alfa;-ciano-4-hidroxicinámicoSigma-Aldrich70990-1G-FMatriz MALDI para imágenes de glicanos y péptidos
Bicarbonato de amonioFisher ScientificA643-500Tampón para enzimas
Fosfato de amonioSigma-Aldrich467782-50GAditivo para reducir los grupos de matrices durante la obtención de imágenes
Cámara de desmontaje NxGenBiocare MedicalN/ASe utiliza para la recuperación de antígenos de tejidos
EtanolFisher Scientific04-355-223Disolvente de grado LC-MS utilizado para la preparación y tinción de matrices
Pulverizador de reactivos robótico M5Imágenes HTXN/ASe utiliza para la aplicación de enzimas y matrices a los tejidos.
MetanolFisher ScientificA456-4Disolvente de grado LC-MS para la fabricación de suspensión de fósforo rojo
Tripsina de grado MSFisher ScientificPI90058Enzima para la digestión de proteínas
Adaptador de corredera MTP IIBruker Daltonics8235380Adaptador para insertar portaobjetos de micrscopio en el espectrómetro de masas
Escáner de diapositivas digital NanoZoomer SQCorporación HamamatsuN/ASe utiliza para generar imágenes de microscopía digital de tejido teñido
Escáner plano Perfection V600EpsonN/ASe utiliza para generar una imagen óptica del portaobjetos para la recopilación de datos MSI
Sello de PetriFisher Scientific50-212-518Para sellar la placa de Petri durante la digestión enzimática
PNGaseFBiografía de BulldogNZPP550LYEnzima para la escisión de glicanos ligados a N de proteínas
Fósforo rojoSigma-AldrichModelo 04004-250GCalibrador MALDI para modo de iones positivos y negativos
Laboratorio SCiLS (2025b)Bruker DaltonicsN/ASoftware para la visualización de datos MSI
espectrómetro de masas timsTOF fleX QTOFBruker DaltonicsN/ASe utiliza para la recopilación de datos de espectrometría de masas
Ácido trifluoracéticoFisher Scientific85183Aditivo de matriz para disminuir el pH para imágenes en modo de iones positivos
Tris BaseFisher ScientificBP152-500Tampón para la recuperación de antígenos
AguaFisher ScientificW64Disolvente de grado LC-MS utilizado para matrices, enzimas y tinciones
WypAll X60Fisher Scientific19-413-113Toallita absorbente para incubación de enzimas humidificadas
XilenoFisher ScientificX3P-1GALAgente desbrozante para tinción

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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