Method Article

Perfil espacial completo de transcriptomas independientes de la especie a través de Stereo-seq

DOI:

10.3791/68619

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October 31st, 2025

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1Department of Hematopoietic Biology and Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Veterinary Medicine & Surgery, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Genetics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo presenta un protocolo para realizar perfiles transcriptómicos espaciales completos del ARN del huésped, viral, fúngico y del microbioma a partir de secciones de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina utilizando Stereo-seq, que permite el mapeo de alta resolución de diversos transcriptomas mientras preserva la arquitectura del tejido.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La composición espacial de las células dentro del huésped, así como las bacterias o las cargas virales dentro del tejido, pueden afectar la interacción de los tipos de células y analitos que impulsan la célula a través de procesos específicos del tipo de célula. Stereo-seq para tejidos FFPE utiliza cebado aleatorio para códigos de barras espaciales, que es diferente de los métodos de transcriptómica espacial estándar, que utilizan A'tailing para capturar ARN mensajero (ARNm) o basado en sondas para capturar transcripciones específicas de especies. Estos métodos no abarcan el conocimiento más actual sobre el impacto y la importancia de otros tipos de ARN de ARN largo no codificante, ARN mitocondrial, microARN u otras especies, ARN, como microbiano, viral y fúngico. Aquí se describe un procedimiento paso a paso desde el corte de tejido hasta la preparación de la biblioteca para la aplicación de estéreo-seq independiente de la especie espacial con detección de ARN utilizando una metodología de sonda aleatoria, que es compatible con tejidos incrustados en parafina fija en formol (FFPE). Este método Stereo-seq tiene una perla de captura aleatoria de 0,22 μm de tamaño que se repite en una matriz cada 0,5 μm, lo que permite la resolución subcelular a partir de una tecnología basada en secuenciación. Como este método detecta tanto el ARN del huésped como el que no es del huésped, el protocolo requiere consideraciones específicas para permitir la determinación de lo que hay dentro del tejido frente a lo que se depositó en el tejido durante el proceso de recolección, preservación, corte y detección (es decir, contaminantes ambientales y de manipulación). Por último, este protocolo permite tener una resolución de alto nivel (unicelular) de especies de ARN múltiples dentro de un contexto espacial, lo que proporciona información sobre el intra e interactoma de tipos celulares y especies patológicas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las tecnologías espacio-ómicas han revolucionado el estudio de la heterogeneidad celular de los tejidos al permitir la cuantificación simultánea de múltiples dianas, ADN (genómica), ARN (transcriptómica), metabolitos (metabolómica) o proteínas (proteómica)1. La resolución de estos diferentes ensayos a menudo varía, lo que proporciona diferentes limitaciones al medir analitos, ya sea con una mayor dispersión al medir una sola célula 2,3 o contexto espacial nativo4. Por el contrario, los métodos a granel como la secuenciación de ARN solo proporcionan una expresión génica promedio en muestras completas y oscurecen la heterogeneidad celular2, o la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq)2,3, que requiere disociación tisular para la secuenciación de una sola célula, a menudo requiere filtrado. Por lo tanto, estos métodos excluyen las células grandes y los agregados, mientras que los métodos bioinformáticos intentan eliminar fragmentos y dobletes, todos los cuales inducen sesgos 5,6,7. La transcriptómica espacial conserva la arquitectura tisular proporcionando información crítica sobre la organización y las interacciones celulares. La mayoría de los métodos de secuenciación espacial no dirigidos no tienen resolución de una sola célula, por lo que requieren la deconvolución de las áreas de captura espacial que contienen de 10 a 100 células 8,9,10. Sin embargo, en la última década, la transcriptómica espacial ha superado las necesidades de estos métodos, ya que ha habido avances en la resolución, áreas de captura más grandes y la integración de enfoques multiómicos, ya sea utilizando estrategias experimentales o técnicasnovedosas 1,11,12.

La secuenciación ómica de resolución espacial mejorada (Stereo-seq) proporciona una resolución a nanoescala (500 nm) y un área de captura a escala centimétrica, con una captura transcriptómica completa independiente de la especie que permite la captura de ARN codificante, no codificante y no huésped13. Este método es actualmente la resolución más alta para la transcriptómica espacial y tiene opciones para proporcionar los campos de visión más grandes. Sin embargo, este método tiene algunas limitaciones notables, incluidos los requisitos de tiempo y mano de obra de alrededor de 15 horas de tiempo práctico, que abarcan 4 días para completar las bibliotecas listas para la secuenciación. En comparación, otras tecnologías de transcriptómica espacial basadas en secuenciación, como la transcriptómica espacial basada en sondas, la transcriptómica espacial basada en matrices de captura de poliA, Slide-seq y los códigos de barras deterministas en tejidos para secuenciación ómica espacial (DBiT-seq) generalmente requieren de 5 a 8 h de tiempo de manipulación durante 2 a 3 días (Tabla 1). Para muchos investigadores, estos avances superan los desafíos técnicos y son ideales para construir atlas espaciales transcriptómicos completos para estudiar la progresión de la enfermedad a nivel celular y subcelular, particularmente si se superponen con otras tecnologías1.

El protocolo Stereo-seq tiene posibilidades más allá de la transcriptómica tradicional de ARNm, que se basa en sondas poli-T para capturar transcripciones de ARNm poliadeniladas. Estos métodos se pueden modificar agregando poliadenilación a tejidos frescos14 o sondas específicas de especies para conjuntos de genes predefinidosobjetivo 15 para análisis de expresión espacial. En cambio, Stereo-seq utiliza sondas de nucleótidos aleatorios para seleccionar diversos ARN independientemente de la especie, incluidos ARN microbianos, ARN fúngicos, ARN virales y ARN no poliadenilados, como ARN potenciadores, ARN circulares y ARN largos no codificantes (lncRNAs)16. Teóricamente, es posible capturar ARN más pequeños o elementos reparadores como pequeños ARN de interferencia (ARNip), microARN (miARN) y transposones17. Sin embargo, actualmente la bioinformática y el mapeo de estos ARN siguen siendo un desafío y, a menudo, se filtran durante la alineación inicial, que generalmente utiliza un corte de 30 pb.

Aquí se describe un protocolo detallado, con nuestras modificaciones para la captura aleatoria de nucleótidos de un fabricante en chips de nanobolas de ADN (DNB) para garantizar una mejor comprensión y manejo de un protocolo Stereo-seq ilustrado en la Figura 1. Este protocolo incluye estrategias para que los biólogos moleculares prueben nuevos tejidos FFPE en Stereo-seq con captura aleatoria de nucleótidos para producir rendimientos más consistentes y más altos a partir de muestras archivadas y tejidos grasos de menor calidad. El protocolo descrito está optimizado para muestras FFPE de la mayoría de los órganos, independientemente de la especie de origen. Sin embargo, este protocolo no incluye las modificaciones actuales necesarias para manejar tejidos difíciles como la médula ósea, que requieren descalcificación.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este documento de métodos no se proporcionan datos clínicos para la muestra de paciente con carcinoma de ovario seroso de alto grado sin tratamiento previo. Sin embargo, los datos clínicos asociados se recopilaron siguiendo los protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Departamento de Oncología Ginecológica y Medicina Reproductiva del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas, de los participantes que dieron su consentimiento informado por escrito.

NOTA: Se recomienda usar una mascarilla quirúrgica y guantes durante todo el protocolo para evitar la contaminación por ARNasa. Se recomienda a los investigadores con cabello largo que lo recojan o incluso usen una redecilla para el cabello. Utilice siempre agua estéril libre de nucleasas (NFW) y tubos de ADN/ARN de baja unión y sin nucleasas para maximizar el rendimiento. Los tejidos no mamíferos, como los tejidos vegetales, pueden requerir una optimización de la adherencia, que involucra poli-L-lisina (PLL) y tiempos de permeabilización prolongados debido a las paredes celulares. Si bien la captura molecular sigue siendo teóricamente factible, se necesita una validación experimental ya que los tejidos vegetales aún no se han probado en nuestro flujo de trabajo actual.

1. Evaluar la calidad del ARN y el valor de distribución de fragmentos de ARN 200 puntuaciones

  1. Evalúe la calidad del ARN utilizando el valor de distribución de fragmentos de ARN 200 (DV200), que mide el porcentaje de ARN superior a 200 pb.
  2. Utilice dos secciones de 10 μm del mismo bloque de tejido destinadas al procesamiento Stereo-seq.
    NOTA: El procesamiento inmediato es óptimo, pero las muestras se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 semana, a -20 °C durante 4 semanas o a -80 °C durante 6 meses.
  3. Extraiga ARN utilizando un protocolo de extracción de ARN selectivo sin tamaño como lo describe Patel et al.18 para permitir una evaluación precisa de la distribución de los tamaños de fragmentos de ARN.
  4. Evalúe la calidad del ARN con uno de los siguientes utilizando un analizador de fragmentos para determinar la puntuación DV200, o el porcentaje de área bajo la curva que representa fragmentos de ARN de más de 200 pb. Idealmente, el tejido debe tener una puntuación DV200 (> 50%) y una concentración (> 10 ng/μL).

2. Limpieza del espacio de trabajo

  1. Limpie todas las superficies con un 30% de lejía. Deje que las superficies se sequen durante al menos 30 minutos para evitar la formación de cloroformo por la combinación de lejía y etanol.
  2. Limpie las superficies con toallitas de descontaminación de ADN (DDW). Rocíe todas las superficies con solución de descontaminación de ARNasa (RDS) y luego etanol al 70% preparado con NFW.
    NOTA: Nunca mezcle lejía ni ningún otro alcohol. Esta combinación produjo cloroformo, que es altamente tóxico y puede causar pérdida del conocimiento, daño a los órganos o la muerte incluso con exposiciones bajas.

3. Preparación del chip de captura de oligonucleótidos aleatorios (N-chip) de Stereo-seq

  1. Limpie el espacio de trabajo como se describe en los pasos 2.1 y 2.2, incluidos todos los sistemas utilizados en este paso.
  2. Retire el chip N de Stereo-seq de su embalaje, registre la identificación del chip y limpie los bordes del chip N de Stereo-seq y el portaobjetos de vidrio con etanol al 100% sin tocar el chip. Deje secar completamente al aire.
  3. Aplicación de resina para asegurar el chip al portaobjetos (Opcional para usuarios que usan xilenos).
    NOTA: Aunque los proveedores comerciales a menudo recomiendan agentes de limpieza sin xileno, se ha observado que los agentes de limpieza sin xileno pueden ser menos efectivos dependiendo de la mezcla de parafina. A menudo no son compatibles con ciertos plásticos, resinas sintéticas o tejidos incrustados en cera de abeja, y no eliminan de manera eficiente las parafinas muy reticuladas o de alto punto de fusión. Si no está seguro de la composición de parafina utilizada para incrustar la muestra, se recomienda utilizar xilenos para una limpieza óptima. Además, los xilenos pueden eliminar mejor los tejidos grasos, como el seno, el ovario, el óvulo o el tejido cerebral.
    1. Agite o mezcle bien la resina para asegurarse de que quede homogéneamente blanca. Con una micropipeta, aplique cuidadosamente 10 μL de resina cerámica curable por UV alrededor del borde del chip N Stereo-seq (Figura 2A).
      NOTA: La resina puede causar irritación de la piel y los ojos y puede provocar reacciones alérgicas en la piel con la exposición repetida. Al pipetear o manipular esta resina, use siempre guantes de nitrilo, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. Trabaje en un área bien ventilada y use una máscara cuando use grandes volúmenes o si calienta la solución y evite el contacto directo con la piel o los ojos.
    2. Use un hisopo de espuma sellado, elimine el exceso de resina, dejando solo una línea delgada alrededor del borde de la viruta. Coloque la diapositiva en el dispositivo de curado UV, asegurándose de no tocar la superficie de la viruta.
    3. Coloque el chip aplicado con resina encima de una máscara opaca en la fuente de luz UV de 405 nm para iluminar la parte posterior del portaobjetos y cure durante 5 minutos. Esto se ilustra en la Figura 2B.
      NOTA: No sobreexponga el chip N de Stereo-seq a la luz ultravioleta y no toque la resina en la superficie del chip, ya que puede causar efectos perjudiciales para las nanobolas.
    4. Después del curado, use hisopos de espuma sellados empapados en cada uno de los siguientes: etanol 100% de grado molecular; etanol al 70%; y finalmente NFW para limpiar alrededor del borde donde se colocó la resina. Si se desprenden manchas blancas, limpie el borde nuevamente. Nunca toque la superficie del chip (Figura 2C).
    5. Deje que la diapositiva se seque al aire por completo. Después de la inspección, almacene las virutas durante la noche a 4 °C con un desecante si es necesario. Sin embargo, se recomienda continuar con la preparación y el corte de chips inmediatamente cuando sea posible.
      NOTA: Siempre use el equipo de protección personal adecuado, incluidas las gafas con protección UV, cuando trabaje con luz UV. Manipule el etanol y la resina en un área bien ventilada, preferiblemente una campana extractora. Deseche los materiales de desecho de acuerdo con las pautas institucionales.
  4. Preparación de chips con poli-L-lisina (opcional para tejidos grasos o tejidos con problemas de adherencia).
    1. Limpie el espacio de trabajo como se describe en los pasos 2.1 y 2.2, incluidos todos los sistemas utilizados en este paso.
      NOTA: No rocíe productos químicos directamente en la máquina de PCR. Para todos los pasos previos a la PCR, trabaje en una campana de PCR, si es posible, para evitar la contaminación, incluida la amplificación previa del ADNc.
    2. Sumerja el chip tres veces en NFW fresco usando un tubo cónico de 50 ml.
    3. Seque la viruta con aire comprimido, utilizando toda la fuerza del aire comprimido en un ángulo de aproximadamente 60 ° a 80 ° en diagonal (45 °) a través de la superficie de la viruta desde aproximadamente 5 cm de distancia de la superficie de la viruta (Figura 2E). Si la superficie parece turbia, repita el lavado con NFW fresco y seque nuevamente (la superficie de la nube generalmente significa que la cerámica no se lavó o curó lo suficiente en los pasos anteriores).
    4. Aplique 150 μL de solución de PLL para cubrir toda la superficie del viruta. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente (22 °C a 25 °C). Esto se ilustra en la Figura 2D.
    5. Retire la solución de PLL y lave el chip dos veces con agua libre de nucleasas durante 10-15 s.
    6. Seque los bordes de la diapositiva con cuidado después del segundo lavado (sin tocar la viruta).
    7. Seque firmemente la viruta con aire comprimido, utilizando toda la fuerza del aire comprimido en un ángulo de aproximadamente 60 ° a 45 ° que atraviesa diagonalmente la superficie de la viruta desde aproximadamente 5 cm de distancia de la superficie de la viruta (Figura 2E).
      NOTA: El chip debe estar completamente seco dentro de los 30 s o menos. Si tarda más que esto, el DNB se verá perturbado, lo que provocará artefactos en la captura.
    8. Proceda al montaje dentro de 1 h y mantenga la viruta seca.
      NOTA: Si la superficie de la viruta parece turbia después del secado, lávela con NFW nuevo y repita el proceso de secado. Si hay artefactos en la superficie del chip después del secado, esto puede causar problemas de captura en esas áreas. Evite usar PLL para adherirse si el tejido no lo requiere. Tocar el chip puede causar arañazos y pérdida de áreas de captura antes de la liberación de ADNc, o una captura desigual después de la liberación. La resina en la superficie del chip conduce a una pérdida moteada de áreas de captura. Colocar el chip demasiado cerca de la boquilla de aire comprimido puede crear cristales y un rocío de marcas de DBN dañadas en la superficie del chip; Sin embargo, esto es raro y generalmente ocurre solo si la boquilla casi toca el chip y la botella de aire comprimido está demasiado fría. Se recomienda practicar este procedimiento varias veces con chips de evaluación, ya que este paso es técnicamente desafiante.

4. Sección y montaje de tejidos

  1. Asegúrese de que el espacio de trabajo esté limpio como se describe en los pasos 2.1 y 2.2. Asegúrese de que se utilicen nuevas cuchillas y NFW para todos los baños de agua y hielo durante el corte y montaje de tejidos. No toque el chip directamente y solo cubra el 80% del chip con un pañuelo de papel.
    NOTA: Se recomienda utilizar un grosor de 5 μm para tejido estándar o 4 μm para tejido con alto contenido de grasa. Utilice una cinta de secciones seriadas para hacer coincidir las modalidades entre las muestras, si corresponde.
  2. Secar los portaobjetos a 42 °C durante 3 h en un horno o en una máquina de PCR con la tapa abierta. A continuación, transfiera los portaobjetos o cambie la temperatura en el horno o en la máquina de PCR a 37 °C y hornee durante la noche durante 12-48 h. Se recomienda utilizar alrededor de las 18 h.
  3. Punto de parada opcional: Después del secado, selle los portaobjetos en bolsas de aluminio con desecante a 4 °C durante un máximo de 1 semana antes de continuar.
    NOTA: Los tiempos de secado más largos pueden reducir la integridad del ARN. Un secado demasiado corto dará como resultado una menor adhesión del tejido al portaobjetos. Hornear a una temperatura más alta puede reducir la integridad del ARN. Los portaobjetos se pueden enviar para procesamiento externo (por ejemplo, análisis de host). Sin embargo, no se recomienda el envío para el análisis del microbioma debido al aumento de la contaminación potencial durante el tránsito.

5. Desparafina las diapositivas

  1. Asegúrese de que el espacio de trabajo esté limpio como se describe en los pasos 2.1 y 2.2.
  2. Prepare reactivos para la desparafinación y el protocolo Stereo-seq.
    1. Alícuotas de los reactivos necesarios: Dos 30 mL de Xilenos en tubos cónicos de 50 mL, dos 30 mL de etanol al 100% en tubos cónicos de 50 mL.
    2. Prepare los siguientes reactivos diluidos con NFW: etanol al 96 % por chip (se requieren 2 cónicos o 1 ml), etanol al 90 % por chip, etanol al 80 % por chip, etanol al 70 % por chip, etanol al 50 % por chip, etanol al 30 % por chip, 2,5 ml de citrato de sodio (SSC) 5x de una solución 20x, 5 ml de HCl 0,01N (diluir HCl 0,1 N con NFW a pH 2). Para diluciones de etanol, prepare una solución de 30 ml en tubos cónicos de 50 ml o una solución de 500 μl en un tubo de 1,5 ml si usa juntas de silicona.
    3. Prepare las siguientes soluciones y manténgalas en hielo: i) 32,5 ml de 0,1x SSC de una solución 5x (mantenga 30 ml de solución en un tubo cónico y coloque los otros 2,5 ml en un tubo de 5 ml para uso futuro), ii) 400 μl de 0,1x SSC con 5% de RI, mantenga en hielo.
    4. Prepare los siguientes reactivos diluidos con HCl 0,1 N.
      1. Prepare una solución de reactivo de permeabilización (PR) 10x agregando 1 ml de HCl 0.1 N al reactivo liofilizado proporcionado comercialmente.
        NOTA: Mantener en hielo solo durante 1 h, asegurarse de alícuota para uso futuro y congelar a -20 °C.
      2. Preparar 500 μL de 1x solución PR (diluir una alícuota 10x PR solution con HCl 0,01 N, mantener en hielo hasta 6 h).
        NOTA: Es fundamental que el pH del HCl de 0,01 N esté dentro del 10% del pH 2,0, ya que las enzimas a base de pepsina funcionan de manera óptima a pH 2.
  3. Desparafina los portaobjetos sumergiéndolos en xilenos (recomendado) durante 2 rondas de 20 minutos cada una.
  4. Inmediatamente, rehidratar la muestra con etanol (100%, 96%, durante 2 rondas, 5 min cada una, seguidas de 90%, 70%, 50% y 30% durante 1 ronda, 2 min). Finalmente, rehidratar con NFW durante 1 min. Para las diluciones de etanol, use 30 ml de solución en un tubo cónico de 50 ml para cada portaobjetos si prepara muestras para estudios de microbioma, o use 30 ml por cada dos portaobjetos si prepara muestras que no son de microbioma. Para todas las diluciones posteriores, prepare 30 ml de solución en un tubo cónico de 50 ml o, si usa juntas de silicona, use 500 μl de solución por viruta de 1 cm2 para cubrir completamente el área de la viruta.
    OPCIONAL: Se sugiere colocar una cámara de silicona de un portaobjetos de extracción de 3 cámaras alrededor del chip para crear un sello después del paso de etanol al 100%, como se ilustra en la Figura 2F-H. Esto permite el uso de volúmenes más pequeños de reactivos y reduce el riesgo de dañar el chip. Alternativamente, se pueden usar tubos cónicos de 50 ml para sumergir completamente el portaobjetos Stereo-seq durante todo el procedimiento.

6. (Opcional) Imágenes nucleares y tinción de ssDNA

NOTA: Deje que el reactivo de desreticulación FFPE alcance la temperatura ambiente (~25 °C) antes de usarlo en 6.1. Son posibles otras soluciones de tinción, pero actualmente se requiere la tinción nuclear de fluorescencia para la segmentación unicelular y la agrupación celular de datos transcriptómicos.

  1. Tinción de fluorescencia con colorante de ADN monocatenario (ssDNA)
    1. Prepare 2 μL de solución de tinción de ssDNA en tampón SSC diluyendo el reactivo Qubit ssDNA con tampón SSC 5x a una dilución 1:1 por 1 a 2 chips.
      NOTA: La dilución de ssDNA puede cambiar según el microscopio utilizado al obtener imágenes.  Por lo tanto, los nuevos microscopios deben probarse con un conjunto de diluciones de colorante de ssDNA utilizando un chip de evaluación y tejido de prueba para determinar el mejor rango dinámico.
    2. Cree una mezcla maestra de la solución de tinción (200 μL por chip) utilizando una dilución 1:20 de inhibidor de ARNasa (RI), dilución 1:200 de la dilución de ssDNA y el SSC 5x restante.
    3. Agregue la solución de tinción (150 μL por chip) e incube en la oscuridad durante 5 min a temperatura ambiente. Retire suavemente la solución de tinción de la esquina del chip con una pipeta.
      NOTA: Si usa la cámara de silicona extraíble, retírela antes de teñir el chip con la mezcla de tinte ssDNA.
    4. Lave el chip dos veces con 0,1x SSC (150 μL por chip cada vez) durante 10-15 s. Seque los bordes de la diapositiva cuidadosamente con papel para lentes después del segundo lavado (sin tocar el chip).
    5. Agregue ~ 3-5 μL de glicerol (use menos para un microscopio invertido) para montar el trébol (tenga cuidado con las burbujas).
      NOTA: Asegúrese de que se aplica el volumen correcto de glicerol en el área del portaobjetos, generalmente alrededor de 4 μL para un chip de 1 cm2. El uso excesivo de glicerol puede hacer que el cubreobjetos se mueva cuando el portaobjetos se sostiene verticalmente. El uso de muy poco glicerol aumenta el riesgo de daño tisular cuando se retira el cubreobjetos y puede introducir burbujas, lo que puede afectar negativamente los resultados de las imágenes y la segmentación unicelular.
    6. Deje caer el cubreobjetos desde aproximadamente 1 cm de altura sobre el chip. Si usa un microscopio intervenido, asegúrese de que el cubreobjetos no se deslice cuando se sostenga verticalmente. Si lo hace, vuelva a montar sin agregar más glicerol.
    7. Capture imágenes fluorescentes de tejido teñido con ssDNA con un microscopio de campo amplio con una superposición del 10% entre los mosaicos de imágenes.
      NOTA: Se recomienda hacer un mapa de enfoque manual de 9-13 puntos con un microscopio de campo amplio utilizando un objetivo de 10x. Se puede usar un microscopio confocal, pero es mucho más sensible a los cambios focales en el tejido y el chip.
    8. Unir software de procesamiento de imágenes como ImageJ, utilizando la superposición teórica para generar el posicionamiento aproximado de cada mosaico y, posteriormente, realizar una superposición computacional de coincidencia de píxeles para ajustar el mosaico de imágenes
    9. Procese imágenes en el software StereoMap y asegúrese de que Image QC pase antes de continuar.
    10. Sumerja el portaobjetos Stereo-seq en 30 ml de 0,1x SSC hasta que se desprenda el cubreobjetos.

7. Proceso de desencrucijado

NOTA: Evite tocar o inclinar el chip durante este paso y pipetee suavemente.

  1. Asegúrese de que el reactivo de desreticulación FFPE esté a temperatura ambiente cálida (~ 25 ° C) e inspeccione para asegurarse de que no haya partículas que enturbien la solución. Si las partículas son visibles, calentar a 55 °C y enfriar a 30 °C antes de su uso.
  2. Encienda el termociclador con los siguientes ajustes: 30 °C para el equilibrio (una tapa calefactada de 85 °C); 95 °C para una incubación de 30 min; Tiempo de espera infinito de 4 °C.
  3. Ensamble la junta del casete, luego coloque la corredera del chip Stereo-seq en el casete.
  4. Agregue el reactivo de reticulación FFPE (400 μl por chip) en el pocillo del casete que contiene el chip. Aplique cinta de sellado al casete y confirme que esté bien sellado.
  5. Comience la incubación de 30 minutos a 95 °C desde el paso 7.2. Una vez transcurridos 10 minutos, coloque 10 ml de metanol en un recipiente de 15 ml (se necesitará aproximadamente 1 ml por portaobjetos) en un congelador a -20 °C.
  6. Retire con cuidado el chip del termociclador, transfiera el casete al banco y retire la cinta de sellado.
  7. Retire y deseche el reactivo de desreticulación FFPE con una pipeta. Una vez que se hayan retirado todos los reactivos de desreticulación, separe y deseche el casete y la junta.
  8. Equilibre la diapositiva Stereo-seq a temperatura ambiente ~ 23 ° C. Bajo una campana extractora estéril, seque el borde del portaobjetos y aplique una nueva cámara de silicona (si corresponde). Añadir 500 μL de metanol frío del congelador a -20 °C, asegurándose de que toda la sección esté completamente sumergida durante 20 min.
    NOTA: Alternativamente, todo el portaobjetos Stereo-seq se puede sumergir en un tubo cónico de 50 ml lleno de 30 ml de metanol enfriado.
  9. Precaliente la solución 1x PR en un bloque seco a 37 °C durante 10 min antes de usarla unos 5 min antes del final de la fijación con metanol (paso 7.8).
  10. Una vez completada la fijación, mueva el portaobjetos a una campana extractora estéril. Limpie el exceso de metanol en el portaobjetos y espere a que se evapore el metanol restante en el chip (~5 min). Ensamble un nuevo casete y una junta. Una vez que el metanol se haya evaporado por completo, coloque la corredera de chip Stereo-seq en el casete.

8. Permeabilización y transcripción inversa

NOTA: Para los pasos 8.1-8.11, pipetee lentamente y no toque el chip. El exceso de presión provocará difusión o marcas en los DNB.

  1. Agregue 200 μL de reactivo de permeabilización al chip. Aplique cinta de sellado al casete deslizante Stereo-seq y asegúrese de que esté bien sellado.
  2. Incubar a 37 °C durante 30 min.
  3. Prepare el tampón de lavado añadiendo 380 μl de 0,1x SSC y 20 μl de RI (inhibidor de ARN) para cada portaobjetos. Hacer 400 μL por portaobjetos y mantener en hielo hasta su uso.
  4. Extraiga los reactivos para la transcripción inversa FFPE (FFPE RT), luego gire todo lo siguiente y mantenga la mezcla de enzimas, oligos y dímeros en hielo. Caliente el tampón FFPE RT a temperatura ambiente (~23 °C).
  5. 5 min antes del final de la permeabilización, prepare 200 μL por chip de mezcla FFPE RT. Agregue tampón FFPE RT (158 μL), mezcla de enzimas FFPE RT (30 μL), oligo FFPE RT (10 μL) y dímero FFPE (2 μL). Mezcle esto suavemente y manténgalo en hielo.
  6. Manteniendo el chip en el termociclador, cambie la temperatura de incubación a temperatura ambiente (~ 23 ° C). Retire el sello y deseche suavemente la solución 1x PR.
  7. Lave el chip muy suavemente con 200 μL de 0,1x SSC (con 5% de RI) por chip de 1 cm2 .
  8. Retire 0.1x SSC (con 5% de RI) de la esquina del chip.
  9. Agregue 200 μl de solución FFPE RT a la esquina del chip.
  10. Aplique cinta de sellado al casete deslizante Stereo-seq y asegúrese de que esté bien sellado; de lo contrario, la evaporación reduce el rendimiento.
  11. Iniciar el protocolo FFPE RT reacción isotérmica de incubación a 42 °C con tapa calentada a 45 °C durante (5 a 24 h).
    NOTA: Se recomienda incubar durante 12 a 16 h y ser consistente en todos los experimentos.

9. Liberación y purificación de ADNc

NOTA: Para los pasos 9.6-9.7, pipetee lentamente y no toque el chip. El exceso de presión provocará difusión o marcas en los DNB.

  1. Prepare 400 μL de tampón de liberación de ADNc calentando el tampón de liberación de ADNc a 55 °C para disolver cualquier precipitado que pueda haberse formado.
  2. Equilibre el tampón de liberación de ADNc a una temperatura ambiente cálida (25 °C). No ponga hielo.
  3. Gire el tampón de liberación de ADNc y la enzima de liberación de ADNc a 100 x g en una centrífuga de mesa antes de su uso.
  4. Prepare el tampón de ADNc agregando 20 μL de enzima de liberación a 380 μL de tampón de liberación de ADNc.
  5. Manteniendo el chip en el termociclador, cambie la temperatura de incubación a temperatura ambiente (~ 23 ° C). Retire el sello y retire y deseche suavemente la solución FFPE RT.
  6. Lave el chip una vez, increíblemente suavemente, con 0,1 veces SSC por chip (200 μL).
  7. Retire 0,1x SSC de la esquina del chip, pipeteando con mucha precaución.
  8. Agregue 400 μL de la solución de liberación de ADNc preparada a cada chip.
  9. Selle el casete deslizante Stereo-seqs aplicando cinta de sellado (o cubierta de PCR) al casete. Asegúrese de que el casete esté bien sellado para evitar cualquier evaporación, fuga o contaminación.
  10. Incubar a 55 °C durante ≥ 5 h (mínimo de 5 h hasta 24 h) con la tapa calentada a 60 °C.
    NOTA: Se recomienda incubar durante 5 a 7 h o mantener la consistencia en todos los experimentos con 2 h.

10. Recoge la mezcla de liberación de ADNc

  1. Precalentar NFW a 37 °C (al menos 500 μL por chip de 1 cm2).
  2. Retire el sello y la pipeta vigorosamente en cada esquina y centro del chip sobre el tejido, pero no raspe ni toque el tejido. Reúna toda la mezcla de liberación de ADNc del chip y transfiérala a un tubo de centrífuga de 1,5 o 2,0 ml. Registre los números de identificación del chip (ID del chip) en cada tubo.
  3. Agregue 350 μL de NFW precalentado directamente sobre la superficie del chip. Y una vez más pipetee vigorosamente con una pipeta más pequeña (P100 o P200), inclinando la punta para aplicar más fuerza de cizallamiento, pero sin tocar el tejido ni desechar el chip.
  4. Combine el lavado del paso 10.3 (350 μL) con la mezcla de liberación de ADNc del paso 10.2 (400 μL). Asegúrese de combinar solo las muestras de un solo chip.
  5. Coloque 100 μL de NFW en el chip, selle la diapositiva del chip Stereo-seq en el casete y guárdelo en el refrigerador hasta el final del protocolo.
    NOTA: En casos de bajo rendimiento, considere volver a liberar el ADNc. La presencia de ADN en el chip se puede evaluar utilizando un tinte de ssDNA y reimaginando con o sin cubreobjetos.

11. Recoger la limpieza de perlas de ADNc

  1. Vuelva a suspender el ADNc del paso 10.4 con un volumen igual de perlas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI). Mezcle hasta que las perlas se distribuyan uniformemente por toda la solución para seleccionar fragmentos de ADN de más de ~ 100 pb.
  2. Incubar durante 10 min a una temperatura de 27 °C a 37 °C (se recomiendan 30 °C).
    1. Durante la incubación. Prepare 5 ml de etanol fresco al 80% en NFW por cada 2 chips procesados.
  3. Tome los tubos con la mezcla de perlas incubadas y gírelos brevemente a 100 x g en una centrífuga de mesa.
  4. Coloque los tubos en una rejilla de separación magnética e incube durante al menos 5 minutos (hasta que el líquido se aclare).
  5. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar las perlas y guárdelo en un tubo limpio y etiquetado. Etiquete la liberación de ADNc con ID de chip y fecha.
  6. Agregue 1,5 ml de etanol al 80% a los tubos sin alterar las perlas e incube durante 30 s antes de retirar el etanol.
  7. Repita el paso 11.6 una vez más, esta vez eliminando la mayor cantidad de etanol posible con una punta de pipeta pequeña sin alterar las perlas.
  8. Seque al aire las perlas en los tubos hasta que ya no sean reflectantes. El tiempo variará, así que verifique regularmente para evitar que se seque demasiado (grietas), lo que resultará en un bajo rendimiento.
    NOTA: Mida la humedad y la temperatura de la habitación. A altas temperaturas (27 °C) y baja humedad (menos del 20%), las perlas se secarán muy rápidamente (3 a 5 min). A bajas temperaturas (23 °C) y alta humedad (más del 40%), las perlas se secarán mucho más lentamente (7 a 15 min).
  9. Retire los tubos de perlas de la gradilla magnética, agregue 22 μL de NFW y mezcle por vórtice.
  10. Incubar en un baño seco o en una máquina de PCR a 27 °C durante 5 a 15 min.
  11. Centrifugar brevemente y volver a colocar el tubo en la rejilla de separación magnética hasta que el líquido se aclare (2 a 5 min).
  12. Transfiera 21 μl de sobrenadante que contiene ADNc al tubo de PCR de 0,2 ml marcado con muestra sin alterar las perlas.
  13. Repita los pasos 11.9 a 11.12 para cada tubo, recolectando un total de 42 μL de ADNc. Continúe directamente con la amplificación del ADNc (pasos 12.1 a 12.8).
    NOTA: El retraso en el inicio de la amplificación dará como resultado una disminución del rendimiento, un aumento de las lecturas cortas y la degradación de la plantilla de ADN monocatenario.

12. Amplificación de ADNc

  1. Retire la mezcla de amplificación de ADNc y los cebadores de ADNc FFPE del congelador y colóquelos en hielo húmedo para descongelar.
  2. Centrifugue la mezcla de amplificación de ADNc y los cebadores de ADNc FFPE en una centrífuga de mesa a ~ 100 x g.
  3. Agregue 50 μL de solución de amplificación de ADNc y 8 μL de cebadores de ADNc FFPE a cada tubo de ADNc a partir de 42 μL de (paso 11.13) y colóquelo en un termociclador con el adaptador de tapa plana para evitar la deformación del tubo.
  4. Ejecute el programa termociclador para la amplificación del ADNc: desnaturalización inicial: 95 °C durante 5 min; ciclos: [98 °C durante 20 s, 58 °C durante 20 s, 72 °C durante 3 min] × 15 ciclos; extensión final: 72 °C durante 5 min; temperatura de mantenimiento: 12 °C (si se procesa inmediatamente) / 4 °C (si se mantiene durante la noche).
  5. Mida la concentración de ADN de 1 μL de ADNc antes y después de la limpieza de perlas.
    NOTA: La cantidad de producto de ADNc antes de la limpieza debe calcularse para exceder 1 μg por cada chip de 1 cm². La concentración posterior a la limpieza debe ser de al menos 10 ng/μL. Los rendimientos más bajos se asocian típicamente con una menor diversidad de bibliotecas. La pérdida significativa de muestras en esta etapa se correlaciona con las puntuaciones DV200; sin embargo, DV200 no es un predictor perfecto de resultados.
  6. Repita la limpieza de perlas de ADNc de los pasos 11 (limpieza de perlas) utilizando el producto de PCR del paso 12.4, con tres modificaciones: use un bastidor magnético de PCR más pequeño, agregue solo 200 μL de etanol al 80% en el paso 11.6 y vuelva a suspender en 22 μL de tampón Tris-EDTA (TE) (pH 8) en el paso 11.9.
  7. Guarde las perlas en un tubo con 20 μL de NFW, etiquetadas con los nombres de las muestras, el código de barras, la fecha y la identificación del chip.
  8. Mida la distribución de fragmentos de ADNc utilizando un analizador de fragmentos. El rango de tamaño del fragmento debe estar entre 250-400 pb. Si los fragmentos son demasiado pequeños, repita la limpieza de perlas pero use temperatura ambiente (~ 25 ° C) en lugar de 27 ° C.
    PUNTO DE PARADA OPCIONAL: Después de medir el ADNc, se puede almacenar a -20 °C durante un máximo de 1 mes y a -80 °C durante un máximo de 1 año. Las perlas se pueden almacenar en NFW durante 1 semana a 4 °C. No congele las cuentas.

13. Preparación de la biblioteca (Día 4)

  1. Preparación de la mezcla de reacción de amplificación
    1. Retire la solución de amplificación de PCR de biblioteca, los conjuntos de códigos de barras de biblioteca, el producto de ADNc y NFW. Descongele el ADNc y los reactivos en hielo y agua a temperatura ambiente y centrifugue a 100 x g durante 10 s.
  2. Determine la estrategia de código de barras de la biblioteca para cada 25 μl de mezcla de cebadores de código de barras de PCR.
    NOTA: Para este secuenciador, todas las bases deben representarse por igual en cada posición de un conjunto de códigos de barras. Por lo tanto, la mayoría de los kits comerciales compatibles con esto están diseñados con tétradas de código de barras predefinidas (conjuntos de cuatro). Estas tétradas se pueden aplicar a muestras individuales cuando se dividen en un carril de secuenciación, o se pueden agrupar para obtener una sola muestra cuando se secuencia una muestra por carril. Mantener códigos de barras equilibrados es imperativo, ya que los códigos de barras no equilibrados reducirán la cantidad de datos utilizables generados por el secuenciador.
  3. Determine el volumen de ADNc para 20 ng (por ejemplo, 10 ng/μL necesitarían 2 μL). Con esto, haga una solución NFW (25 μL) de ADNc diluido (diluido a ~ 1 ng / μL).
  4. Combine la mezcla de amplificación de biblioteca (50 μL) con ADNc diluido en NFW (25 μL) y la mezcla de cebadores de código de barras de PCR (25 μL) en el tubo de PCR de 0,2 ml.
  5. Mezclar el pocillo pipeteando y centrifugar a 100 x g durante 10 s. (No agitar en vórtice)
  6. Coloque los tubos de PCR de 0,2 ml en el termociclador y asegúrese de tener un inserto para evitar que los tubos se aplasten.
  7. Ejecute el programa termociclador para la amplificación del ADNc: desnaturalización inicial: 95 °C durante 5 min; ciclos: [98 °C durante 20 s, 58 °C durante 20 s, 72 °C durante 3 min] × 8 ciclos; extensión final: 72 °C durante 5 min; temperatura de mantenimiento: 12 °C (si se procesa inmediatamente) / 4 °C si se mantiene durante la noche.
    NOTA: Es posible utilizar cantidades variables de ADNc de entrada para preparar la biblioteca. Sin embargo, la cantidad utilizada afectará la cantidad de ciclos de PCR necesarios para la amplificación. Por ejemplo, el proveedor recomienda 20 ng de ADN de entrada y el uso de 8 ciclos. También es posible utilizar 40 ng con 7 ciclos u 80 ng con 6 ciclos. No se recomienda usar menos de 20 ng o más de 80 ng de ADNc de entrada.

14. Limpieza de perlas de amplificación de la biblioteca

  1. Cuantifique el producto de biblioteca sin procesar como se hizo en el paso 12.5.
  2. Repita la limpieza de perlas del paso 11 (limpieza de perlas) utilizando el producto de la biblioteca sin procesar del paso 13.7 con tres modificaciones: use una proporción de perlas de 0.8: 1 al producto, use un bastidor magnético de PCR más pequeño, use solo 200 μL de etanol al 80% en comparación con el paso 11.7 y vuelva a suspender en 22 μL de tampón TE (pH 8) en el paso 11.9. Prepare alrededor de 1 ml de etanol fresco al 80% por dos chips de 1 cm2 .
  3. PUNTO DE PARADA OPCIONAL: Después de medir la biblioteca, se puede almacenar a -20 °C hasta por 1 mes y a -80 °C hasta por 1 año. Las perlas se pueden almacenar en NFW durante 1 semana a 4 °C. No congele las cuentas.

15. Sistema DNBSEQ-T7RS para secuenciar DNB cebados con oligonucleótidos aleatorios Stereo-Seq

  1. Usando un kit PE75 en el sistema DNBSEQ-T7RS, asigne los ciclos como 25 para la lectura 1 y 62 para la lectura 2 (PE25 + 62), seguido de un índice de 10 pb:
    1. La primera lectura (leer 1 de 25 ciclos) captura el ID de chip espacial (CID) o la información específica de la ubicación de los códigos de barras basados en chip.
    2. La segunda lectura (leer 2 de 62 ciclos) captura el identificador molecular (MID), una secuencia aleatoria de 6 pb, directamente unida a los insertos de genes con 3 ciclos oscuros adicionales utilizados para la corrección de fases y la calibración de desplazamiento de códigos de barras. A esto le sigue un inserto genético de 30-59 pb de la lectura 2, que se identifica mediante el mapeo de genomas o transcriptomas conocidos.
      NOTA: Son posibles inserciones de genes más largas, pero requerirían diferentes kits finales emparejados y modificaciones en el flujo de trabajo de mapeo.
    3. El ciclo de índice para la demultiplexación cubre 10 bps según los códigos de barras de secuenciación agrupados en el paso 13.2.
      NOTA: Tiempo de secuenciación típico de aproximadamente 10-12 h para una celda de flujo de 75 PE. La secuenciación se realiza con mayor frecuencia en un núcleo de secuenciación o en una instalación comercial, y no es un proceso interno para la mayoría de los laboratorios, ya que requiere un DNBSEQ-T7RS o un instrumento de secuenciación similar.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los datos a continuación demuestran la capacidad de realizar la segmentación de una sola célula utilizando la tubería SAW y el mapeo a ARN no poliadenilados como el ARNt (TRDMT1) de una sección FFPE. Los datos imparciales de Stereo-seq permiten examinar la importancia no solo de los ARNm, sino también de los ARNt, los ARNr y los ARN que no son del huésped (si es pertinente). Utilizando la salida directa de la tubería SAW16 y la est...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo Stereo-seq es muy detallado e implica varios pasos críticos que requieren precisión, sincronización y un entorno limpio para garantizar el éxito, especialmente con perfiles de microbioma o no huésped que pueden requerir precauciones específicas.

Se requiere el uso de agua libre de nucleasas durante todos los pasos, y el chip de captura no debe tocarse con nada más que la muestra y los reactivos. Tenga mucho cuidado al usar el ensamblaje del casete...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que este trabajo no fue financiado por Complete Genomics. Sin embargo, Complete Genomics está apoyando los costos de publicación de este artículo.  No se les dio una copia anticipada ni información sobre el contenido.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación fue financiada en parte por la Alianza para la Investigación del Cáncer de Ovario (OCRA 811621 y 891490), la Fundación Sie y el Fondo de Dotación Stephanie C. Stelter. Esta investigación se realizó en colaboración con el Centro Central de Citometría de Flujo e Imágenes Celulares, el Departamento de Medicina y Cirugía Veterinaria y el Centro de Tecnología Genómica Avanzada, que cuenta con el apoyo en parte de los Institutos Nacionales de Salud a través de la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico P30 CA016672 del M. D. Anderson y el Especialista en Investigación del NCI 1 R50 CA243707-01A1 de Jared Burks.

También nos gustaría agradecer a Compete Genomics, específicamente a Brandon Vanderbush y Tanzeen Yusuff por la capacitación técnica y la resolución de problemas, así como a Jia "Jackie" Zhao, Yongfu Wong y Erin Petrilli. Los autores recibieron un conjunto de reactivos FFPE OMNI y de secuenciación, así como acceso al Programa de Acceso Temprano T7, de Complete Genomics a un precio con descuento. Además, se proporcionaron algunos reactivos de forma gratuita para su uso en este estudio.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 mL tubos centrífugos DNAse/RNAsa regularThermo Fisher Scientific / Invitrogen3456Para mezclar reactivos (otras bandas están bien) 
100% etanolSigma-AldrichE7023Grado molecular
Tubos centrífugos cónicos estériles de polipropileno de 15 mLThermo Fisher Scientific / Invitrogen339650Usado para alicuotas 
20x Concentrado  Amortiguador de citrato de sodio salino (SSC)Sigma-AldrichS6639-1LSe usaba para fabricar 5 veces SSC para teñir y 1 SSC para pasos de lavado y retirar la cubierta.
Instrumento bioanalizador 2100AgilentDescontadoInstrumento: Bioanalizador
Cámara de 3 pozos, extraíbleIbidi80381Cámara de silicona para reducir volúmenes durante la rehidratación y la fijación de metanol.
Fuente de luz ultravioleta de 405nmVariosN/APara curar resina UV
Tubos centrífugas cónicos estériles de polipropileno de 50 mLThermo Fisher Scientific / Invitrogen339652Usado para alicuotas y para deparafinización 
Alcohol isopropanol estéril al 70%Texwipe TX3270Para la descontaminación superficial  
Kit de ADN de Alta Sensibilidad AgilentAgilent5067-4626Para la caracterización de ADNc y bibliotecas por bioanalizadores
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilent5067-1513Para la caracterización de ARN por bioanalizadores
Lámina de aluminioVariosN/APara cubrir la lámina durante la tinción de ssDNA.
Beckman Coulter SPRIselectBeckman Coulter Ciencias de la Vida  B23317/B23318/B23319Limpieza de cuentas de SPRI cDNA y biblioteca
LejíaVariosN/ALimpieza de la estación de trabajo eliminando la contaminación por microbioma
Hisopos de espuma sellados CONSTIXContec19161023Para una limpieza precisa con resina
CubiertaSigma-AldrichBR470045-2000EA
Paquetes desecantesVariosN/APaquetes desecantes sin RNasa y sin polvo.
Mascarilla facial desechableThermo Fisher Scientific / Invitrogen12-888-001Protección, contaminación por ARNasa y esterilidad 
Toallitas de borrado de ADNSigma-AldrichL9060-250EADescontaminación limpiando superficies (toallitas húmedas)
Tubos de unión de ADN 1,5 mLEppendorf y Eppendorf;22431021Usado para la recopilación de ADNc y amplificaciones posteriores a la biblioteca.
Tubos de unión de ADN 2 mLEppendorf y Eppendorf;22431048Se utiliza para la recogida de ADNc antes de la amplificación.
DNBSEQ OneStep DNB Make Reactive KitGenómica completa940-001891-00Reactivos para la preparación y amplificación de nanobolas de ADN (DNB)
Kit de reactivos de limpieza DNBSEQ-T7RSGenómica completa940-001903-00Cartucho para lavado tras completar la secuenciación
Kit de reactivos de carga DNBSEQ-T7RS DNBGenómica completa940-001894-00Reactivos y placas para cargar los DNB en la celda de flujo
Celda de flujo de secuenciación DNBSEQ-T7RSGenómica completa940-001902-001 carril/celda de flujo
Kit de reactivos para visualización estéreo-seq DNBSEQ-T7RSGenómica completa940-001893-00El cartucho y los reactivos para secuenciar.
Sistema DNBSEQ-T7RSGenómica completaEste conjunto de visualización estéreo-seq utiliza la tecnología DNBSEQ. Una secuenciación comienza con la hibridación de un ancla de ADN, luego se une una sonda fluorescente al DNA Nanoball (DNB) mediante la química combinatoria de secuenciación de ancla de sonda (cPAS). Finalmente, el sistema de imagen de alta resolución captura la señal fluorescente. Tras el procesamiento digital de la señal óptica, el secuenciador genera información de secuenciación de alta calidad y precisa.
Aire comprimido para desempolvarMatinM-6318Es importante usar esta marca o una con propelente similar.
Cuchillas de Microtomo Rito de FiloThermo Fisher Scientific / Invitrogen4280LHistología - Usada al seccionar muestras
Congelador a prueba de explosionesVariosN/APara enfriar el metanol antes y durante la fase de fijación del metanol.
Pinceles de histologíaVariosN/AHistología - Usada al seccionar muestras
Ácido clorhídricoSigma-Aldrich2104-50MLPara diluir la enzima de premuliablización en 0,01 N HCl (pH 2). La concentración estándar de stock para la solución de HCl es 0,1 N.
Sistema de imagenVariosN/AGC Stomics Imager, Lecia, Evo Revolution
Solución de descontaminación RNaseZap RNasa InvitrogenThermo Fisher Scientific / InvitrogenAM9780Limpieza de la estación de trabajo eliminando la contaminación por ARNAsa
Limpiaparabrisas delicados Kimtech  Kimtech34155Para secar bancos, equipos, pipetas, etc.
Bata de laboratorioVariosN/AEquipo de Protección Personal (EPI)
Papel para lentesThermo Fisher Scientific / Invitrogen11-997Diversas obras para secar las láminas sin hacer sheading
Toallitas de borrado de ADN LookoutSigma-AldrichL9060Limpieza de estación de trabajo eliminando la contaminación por PCR
Rack de Separación Magentic 5uL - 0,2 Permagen LabwareMSRLV08Para la separación de perlas en tubos de PCR
Rack Magjet 12x1,5 mLThermo Fisher Scientific / InvitrogenMR02Para la separación de perlas en tubos de 1,5 mL
Microtomo Rotatorio ManualLeicaRM2235Histología - Usada al seccionar muestras
Methonal ≥ 99,9%, adecuado para inmunofluorescencia, HPLCSigma-Aldrich34860Para la fijación (debe ser de grado HPLC)
Pinzas microdisecadorasSigma-AldrichF4142-1EAHistología - Usada al seccionar muestras
MicropipetaVariosN/A
Agua sin nucleasas de grado molecular no tratada con DPECVariosN/ADiluciones y elución de cuentas
Guantes de nitriloVariosN/AEPI
HornoVariosN/APara hornear chips
Tubos PCR 0,2 mL con condensadores acopladosVariosN/APara aplicaciones de PCR
Cubiertas de PCR  VariosN/AReemplazo si el adhesivo de la cubierta proporcionada es débil
Campana y capucha PCR Estación de trabajoMystaireMY-PCR24-010Para los pasos de pre-PCR (ARN a ADNc)
Medidor de pHVariosN/AMedidor de pH para confirmar el pH del HCl.
Solución de poli-L-lisinaSigma-AldrichA005-COpcional para aumentar la adhesión tisular a la astilla
Fluorómetro Qubit 4Thermo Fisher Scientific / InvitrogenP33226Uterización; Medición de cantos de ADN
Kits de cuantificación de dsDNA de qubitsThermo Fisher Scientific / InvitrogenP32851Para medir cuantificaciones de ADNc y bibliotecas
Kit de ensayo de ADN ssDNA de qubitThermo Fisher Scientific / InvitrogenP10212Tinción de ssDNA (Solo se utilizó el tinte)
Bloque de hielo sin ARNVariosN/AHistología - Se utiliza al seccionar muestras para hidratar bloques antes de seccionar
Solución de descontaminación RNasa RNaseZapThermo Fisher Scientific / InvitrogenAM9782Una solución de descontaminación superficial que destruye ARNs
RNeasy FFPE KitQiagen73504 & 19093Para la extracción de ARN y la extracción de ARN Medición DV200  
Sculpt Ultra White ResinSiraya TechN/AResina curable por UV resistente a altas temperaturas
Kit de preparación de biblioteca de códigos de barras Stereo-seq 16STOmics / Genómica Completa111KL160Para construir la biblioteca OMNI FFPE estéreo de secuencia
Kit de accesorios FFPE estéreo de seguimientoSTOmics / Genómica Completa310AK002Piezas de accesorios espaciales OMNI del kit 211SN114
Corredera de chip N-seq estéreo (1cm x 1cm)STOmics / Genómica Completa210CN114Chip espacial OMNI parte del kit 211SN114
Adaptador PCR estéreo-seq STOmics / Genómica Completa301AUX001Para los pasos de hibridación PCR modificados para encajar tres, similares al adaptador de hibridación Situ PCRmax
Kit de transcriptómica estéreo-seq NSTOmics / Genómica Completa211KN114Parte del kit 211SN114 del OMNI Espacial
Diseño quirúrgico cuchilla industrial de afeitar de propósito generalThermo Fisher Scientific / Invitrogen13-812-236Histología - Usada al seccionar muestras
pH de la solución tampón de TE 8.0Sigma-Aldrich8890Para eluir cDNA y bibliotecas
Cicladores térmicosBioRad / varios1861096 /12015392 / variosMáquina PCR con tapa manual o opciones de pozo profundo (T100 Thermal Cycler / PTC Tempo Deepwell Thermal Cycler, etc.)
Kits de tampón de pH todo en uno Thermo Scientific OrionThermo Fisher Scientific / Invitrogen13-624-500
Baño de flotación de tejidos - Digital XH-1003EstrenoNC0779538Histología - Usada al seccionar muestras
Gafas con protección UVVariosN/APor seguridad durante el curado UV
XilenosSigma-Aldrich247642Para la deparafinización

References

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