Este protocolo quirúrgico es una guía paso a paso para insertar un catéter intratecal en el espacio subdural espinal de un roedor para administrar un tratamiento dirigido.
Artículo de método
Acceso al espacio subdural de la médula espinal del roedor para la administración del tratamiento
En este artículo
Resumen
Resumen
El tratamiento de enfermedades o lesiones de la médula espinal es un desafío, en parte, debido a las dificultades para desarrollar tratamientos efectivos que se puedan aplicar directamente a la médula. Los tratamientos actuales para la lesión de la médula espinal (LME), por ejemplo, son principalmente epidurales. Sin embargo, las terapias epidurales no permiten la interacción directa con la médula espinal, lo que reduce el efecto potencial del tratamiento. Aquí, se propone un método para acceder al espacio subdural en un modelo de roedores para un efecto más directo de un tratamiento dado. Utilizando el protocolo descrito, se realizó una implantación subdural exitosa de un dispositivo bioelectrónico para el registro/estimulación de la médula espinal, así como la inserción segura de un hidrogel cargado con neurotrofina-3. Los animales expuestos a este protocolo en ambas aplicaciones no mostraron cambios en la función de las extremidades posteriores o anteriores después del procedimiento, y no se desarrolló ninguna disfunción hasta 12 semanas después del procedimiento. Si bien los ejemplos presentados aquí son muy específicos, el protocolo propuesto se puede utilizar en una variedad de aplicaciones para permitir un tratamiento localizado más efectivo de los trastornos neurológicos de la médula espinal.
Introducción
Las enfermedades y lesiones de la médula espinal pueden tener efectos devastadores en millones de personas en todo el mundo, lo que resulta en importantes cargas sociales, económicas y de atención médica 1,2. Las lesiones de la médula espinal y las enfermedades neurodegenerativas pueden provocar disfunciones motoras, sensoriales y autonómicas crónicas que reducen la calidad de vida y la independencia de las personas afectadas. Los tratamientos actuales, como la intervención quirúrgica y la farmacoterapia, se centran en mitigar el trauma inicial y manejar las complicaciones secundarias3. Sin embargo, estos enfoques rara vez logran una regeneración neuronal sustancial o una recuperación funcional, lo que deja una necesidad urgente de intervenciones más efectivas que se dirijan a los mecanismos subyacentes.
Una preocupación principal para las estrategias de tratamiento actuales es la ubicación y la administración de un tratamiento deseado. Los tratamientos como la neuromodulación o la intervención farmacéutica tienen la capacidad de influir en la actividad neuronal, facilitar la recuperación funcional y restablecer potencialmente las conexiones en los circuitos espinales dañados4. La estimulación de la médula espinal puede conducir a mejoras en el control motor y reducir el dolor5. Sin embargo, estas estrategias se limitan actualmente a la administración indirecta al tejido lesionado, enfocada en el espacio epidural, sin considerar la barrera de la duramadre de la médula espinal 6,7,8. Si bien los tratamientos epidurales han demostrado beneficios clínicos, son limitados debido al acceso indirecto a las poblaciones neuronales diana, lo que lleva a efectos potencialmente reducidos de los agentes terapéuticos.
Nuestro grupo ha trabajado para superar estas limitaciones asociadas con las estrategias centradas en la epidural y explorar el potencial de la administración directa de tratamiento subdural en modelos de lesión de la médula espinal (LME). La inserción de catéteres en el espacio subdural permite que el tratamiento se aplique directamente a la médula espinal, proporcionando una mejor interacción con el tejido neural afectado 9,10. La administración subdural también reduce los efectos de barrera de la duramadre, mejorando la eficacia de la estimulación eléctrica y los sistemas de administración de fármacos dirigidos11,12. Este método podría mejorar la precisión y la eficacia del tratamiento, lo que podría conducir a mejores resultados en la recuperación funcional.
Este artículo describe un protocolo paso a paso para el acceso seguro al espacio subdural de la médula espinal de los roedores. Este procedimiento se centra en la región torácica de la columna vertebral (T10-T12), sin embargo, se puede implementar en diferentes lugares de la médula según sea necesario. Se especifican puntos de referencia anatómicos, lo que permite la identificación de la región, y se presentan instrucciones detalladas sobre la laminectomía, la durotomía y la penetración de la duramadre. También se presentan dos aplicaciones de este protocolo, incluida la implantación de un dispositivo de estimulación eléctrica, así como la administración de un sistema de administración de fármacos de hidrogel (Figura 1). Los pasos descritos son fácilmente reproducibles por investigadores con experiencia en cirugía de roedores. Este protocolo está escrito en el contexto de un modelo de contusión de LME; sin embargo, el modelo específico de lesión puede modificarse en función de los resultados experimentales deseados. La técnica descrita aquí no solo es prometedora para avanzar en el tratamiento de la LME, sino que también puede proporcionar una plataforma para futuras investigaciones sobre la reparación y regeneración de la médula espinal a través de intervenciones precisas y localizadas.
Protocolo
Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas éticas de la Universidad de Auckland y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal (AEC) de la institución y los Oficiales de Bienestar Animal (AWO) de la universidad. Se utilizaron ratas Sprague-Dawley hembras que pesaban 240-260 g y se alojaron en grupo (21 °C; 12 h:12 h, ciclo de luz: oscuridad) y se les dio acceso ad libitum a la dieta estándar para roedores antes y después de la cirugía. Se recomienda probar primero este protocolo en ausencia de un modelo de lesión, ya que la intención es proporcionar un acceso seguro al espacio subdural de la médula espinal del roedor. Este es un primer paso importante para demostrar que el protocolo se puede aplicar sin causar lesiones, lo que permite un examen más preciso de un modelo de lesión deseado. El protocolo es adecuado para combinarse con los diferentes modelos de lesiones utilizados por los grupos de investigación. Por lo tanto, el protocolo no describe pasos específicos de administración de lesiones, ya que variarán según la aplicación. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación preoperatoria
- Esterilice todos los instrumentos (Figura complementaria 1) y los consumibles relevantes.
- Pese la(s) rata(s) que se someterá a cirugía al día siguiente.
- Calcular las dosis adecuadas de medicamentos a administrar; bupivacaína (analgésico) @ 2 mg/kg, dosis - 0,08 ml/100 g; meloxicam (analgésico) @ 2 mg/kg, dosis - 0,04 mL/100 g; buprenorfina (analgésico) @ 0,03 mg/kg, dosis - 0,1 mL/100 g; enrofloxacina (antibiótico) @ 10 mg/kg, dosis - 0,08 mL/100 g12,13.
NOTA: La bupivacaína se administró por vía subcutánea en 3-4 sitios a lo largo del sitio quirúrgico antes de la incisión inicial.
2. Preparación quirúrgica
- Asegúrese de que el sistema de anestesia esté configurado correctamente (verifique si todos los tubos asociados con el sistema de oxígeno y anestesia están configurados correctamente).
- Prepare las inyecciones necesarias en función del peso de las ratas, así como una inyección de solución salina de 3 ml que se administrará antes del inicio.
- Asegúrese de que la almohadilla térmica (temperatura de mantenimiento 37 °C), la lámpara, el microscopio y la afeitadora estén configurados y funcionen.
NOTA: No se requiere un aumento específico para el microscopio de disección, ya que el aumento variará según las preferencias del usuario y la visibilidad durante el procedimiento.
PRECAUCIÓN: Asegúrese de que la temperatura del animal no baje de 35 ° C ni supere los 40 ° C durante el procedimiento
3. Preparación de animales
- Asegúrese de que todos los tubos asociados con el sistema de anestesia y el tanque de oxígeno estén conectados. Si utiliza el sistema de anestesia utilizado en este estudio (consulte la Tabla de materiales), ajuste la inducción de isoflurano al 3% e introduzca el peso del animal en el sistema de anestesia para establecer el caudal de oxígeno para la anestesia de mantenimiento (Figura complementaria 1A).
NOTA: Mantenga la anestesia a un nivel de mantenimiento adecuado para cada animal individual. Esto puede variar entre 1.3%-2% dependiendo del animal. - Coloque la rata en la cámara de inducción hasta que no pueda enderezarse, cambie al nivel de mantenimiento de isoflurano deseado y mueva la rata al cono de la nariz.
- Administre 3 ml de solución salina y las inyecciones de medicamentos requeridas, por vía subcutánea, antes del afeitado.
NOTA: Después de las inyecciones de solución salina y el afeitado, inyecte la bupivacaína en varios puntos a lo largo del sitio de incisión previsto - Mientras monitorea el nivel de anestesia del animal, prepare todos los instrumentos (microscopio, herramientas, paños estériles) en el área quirúrgica. Coloque un paño estéril para las herramientas en el área deseada y organice las herramientas en la cortina, manteniendo el campo estéril.
- Afeitar el pelaje a lo largo de la espalda del animal, desde la base del cuello hasta la parte superior de las caderas.
- Desinfecte el área con un exfoliante de clorhex, seguido de tintura de clorhex, con un movimiento circular que se mueva hacia afuera desde el centro del área afeitada (3x), y aplique lubricante en los ojos para evitar que se sequen.
- Transfiera la rata a la almohadilla térmica bajo el microscopio, coloque una cortina de prensa y sello sobre el área afeitada y corte un agujero lo suficientemente grande como para exponer el campo quirúrgico, pero no tan grande como para exponer el pelaje sin afeitar.
- Coloque una sonda de temperatura rectal para controlar la temperatura del animal y mantener ~37 °C con la almohadilla térmica. Administre controles de bienestar animal cada 5-10 minutos.
- Administre el reflejo del pedal para confirmar el plano quirúrgico de la anestesia y comenzar el procedimiento.
4. Disección de tejido de la columna vertebral
- Con una hoja de bisturí, haga una incisión lineal (~ 6-8 cm) en dirección rostral a caudal (Figura 2A), comenzando debajo de la base del cuello y extendiéndose sobre la joroba torácica, exponiendo las vértebras T9-T13.
- Empareje suavemente el tejido conectivo debajo del sitio de la incisión con fórceps Graefe o tijeras de microresorte, para exponer directamente el tejido muscular en la columna vertebral.
- Identifique el proceso T13 ubicando los dos tendones blancos en forma de V cerca de la mitad caudal de la incisión. El proceso espinoso directamente rostral a la V en el lado de la cola del animal es T13 (Figura 2B).
- Comenzando en T13 y subiendo hasta T9, haga pequeñas incisiones en los tejidos conectivos entre cada proceso para separarlos antes de despejar el músculo, para ayudar a mantener la ubicación a medida que avanza el procedimiento (Figura 2C). Luego, corte los canales en el músculo que corren paralelos a ambos lados de las apófisis espinosas usando microscripters. Haga esto en ambos lados de la columna vertebral para exponer la lámina de cada segmento espinal (Figura 2D).
- Coloque pinzas serrefinadas a ambos lados de las paredes musculares para mantener un campo de visión abierto a la columna vertebral. Fije un par a los lados de T13, otro en el borde T11/T12 y otro en T11/T10 (Figura 2E).
- Una vez que se formen canales claros, corte el tejido conectivo entre cada proceso con microtijeras o rongeurs (Figura 2F).
- Despeje los canales hasta que el tejido conectivo y el músculo se diseccionen limpiamente de cada lámina, desde la parte rostral de T13 hasta la parte caudal de T9, exponiendo los segmentos T10-12 para el procedimiento de laminectomía. La finalización exitosa se indica mediante una lámina claramente visible a ambos lados de los procesos.
NOTA: No se requiere un microscopio para el paso 4, pero se recomienda encarecidamente.
5. Laminectomía
- Localice la porción caudal de la lámina T12 que se superpone a la porción rostral de T13, coloque la punta de los rongeurs debajo y comience a quitar suavemente trozos de lámina, como se recomienda en los protocolos estándar de JoVE14,15 (Figura 2G).
NOTA: Use fórceps para agarrar el proceso espinoso de cada lámina para mantener la estabilidad y "levantar" suavemente las placas durante cada corte con los rongeurs (Figura 2G). Al deslizar la punta de los rongeurs debajo de la lámina, mantenga la presión hacia afuera lejos de la médula espinal para minimizar el daño potencial.
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no empujar demasiado los rongeurs por debajo al hacer cortes, ya que puede dañar la duramadre y / o la médula espinal. - Moviéndose de un lado a otro, continúe cortando trozos de hueso de la lámina T12 hasta que haya suficiente espacio para extender el corte hacia la línea media del proceso, exponiendo la médula espinal, con un orificio de aproximadamente 5 mm de ancho (Figura 2H).
NOTA: La extracción de hueso de la columna vertebral puede provocar sangrado que puede reducir la visibilidad durante el procedimiento. Use hisopos de algodón o toallitas enrolladas sin pelusa (Figura complementaria 1B) para controlar esto mientras realiza la laminectomía. - Trabaje los rongeurs debajo de la lámina a cada lado y luego despeje un canal uniforme hasta la porción craneal de T12 (Figura 2I).
NOTA: La médula espinal se hará visible a medida que se extraigan piezas de la placa laminar para cada segmento espinal. - Repita los pasos 5.1 a 5.3 para eliminar T11 y T10.
- Continuar la laminectomía, manteniendo cortes uniformes en ambos lados, moviéndose rostralmente hasta T9 (Figura 2J).
NOTA: Para los procedimientos de LME por contusión (consulte la sección Resultados representativos), la lámina por encima del segmento / segmentos de la médula espinal deseados debe despejarse lo suficiente como para permitir el uso de un dispositivo de lesión por contusión (consulte el área ensanchada en el medio de la Figura 2K). Para la administración de fármacos, la laminectomía puede ser lo suficientemente amplia como para visualizar la aplicación del compuesto deseado. - Enjuague suavemente el saco tecal con solución salina y prepare el área deseada para la durotomía una vez que se complete la laminectomía y se haya eliminado un área suficiente de T10-T12 (Figura 2K).
NOTA: Este procedimiento es específico para acceder a los segmentos espinales (T10-T12), sin embargo, estos métodos se pueden utilizar para realizar laminectomías en varios segmentos a lo largo de la columna vertebral.
6. Durotomía para aplicación de tratamiento
- Realice la durotomía (incisión de la duramadre) utilizando el endoscopio de disección para acceder al espacio subdural de la médula espinal (Figura 3A).
NOTA: Ajuste el aumento del endoscopio según la preferencia del cirujano por la visibilidad de la duramadre. - Doble una aguja de 27-G en un ángulo de 90 grados con el bisel hacia arriba (Figura 3B).
NOTA: Use un par de destornilladores de aguja o hemostáticos para agarrar la aguja al doblar. - Perfore suavemente la duramadre con la punta de la aguja en el punto de entrada deseado en la médula espinal (Figura 3B).
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no dañar la médula espinal subyacente o su vaso sanguíneo mediano. - Una vez perforada la duramadre, levante suavemente la aguja dorsalmente para rasgar un orificio circular en la duramadre, de no más de 2 mm, a cada lado del vaso sanguíneo de la línea media. Una durotomía exitosa está indicada por una pequeña cantidad de fuga de líquido cefalorraquídeo (LCR) de cualquiera de los orificios.
NOTA: Mantenga una distancia de al menos unos pocos mm del final de la laminectomía para permitir un acceso más fácil al espacio subdural. Si es necesario, vuelva a insertar con cuidado la punta de la aguja en el orificio inicial para aumentar su tamaño. - Asegúrese de que la posición seleccionada para la incisión de la durotomía y que la posición inmediatamente al frente esté libre de vasos sanguíneos ramificados desde el vaso sanguíneo de la línea media.
PRECAUCIÓN: NO dañe el vaso sanguíneo de la línea media, ya que esto causará un sangrado excesivo, impidiendo la finalización del procedimiento. - Usando los orificios hechos en la duramadre, administre el tratamiento deseado o implante un dispositivo en el espacio subdural. Para este protocolo, se utilizan catéteres intratecales para la administración del tratamiento para guiar el dispositivo de estimulación a su posición o inyectar el hidrogel (Figura 3C).
NOTA: Mantenga un campo de visión despejado limpiando continuamente la sangre y/o el LCR después de las durotomías. - Asegúrese de que las puntas de los catéteres sean visibles debajo de la duramadre antes de progresar hacia la médula espinal. Una aplicación exitosa está indicada por catéteres que se mueven suavemente a través de los pequeños vasos sanguíneos espinales mientras están debajo de la membrana dural.
- Después de administrar el tratamiento deseado (Figura 3D, E), coloque un trozo de espuma de gel quirúrgica estéril en el espacio creado por la laminectomía para ayudar en la hemostasia, la cicatrización de heridas y el mantenimiento de la estructura de la columna vertebral.
- Después de la colocación de la espuma de gel, use una sutura absorbible de polidioxanona 4-0 para cerrar la capa muscular y de piel por encima de la columna vertebral.
7. Cuidados postoperatorios
- Revise a los animales diariamente y administre los medicamentos postoperatorios requeridos (buprenorfina durante 2 días; enrofloxacina y meloxicam hasta por 5 días). Administrar 1-3 ml de solución salina por vía subcutánea según sea necesario (si se consume un <10% del peso corporal de agua durante 24 h durante el postoperatorio).
- Dependiendo del procedimiento, controle la función de la vejiga, la función motora, la escala de muecas y cualquier otro signo de bienestar animal.
- Retire las suturas de la piel aproximadamente 10-14 días después de la cirugía.
Resultados
El protocolo propuesto se aplicó en dos entornos experimentales diferentes. Los datos mostrados son representativos de los grupos no lesionados porque la intención era demostrar que las manipulaciones subdurales descritas en el procedimiento (en ausencia de un modelo de lesión) no afectan la función. Se implantó un dispositivo bioelectrónico (Figura 1A) o se administró un hidrogel (Figura 1B) en ratas Sprague-Dawley de 6 a 8 semanas de edad. La función motora de estos animales se comparó con la de los animales de control que se sometieron a cirugía simulada sin un procedimiento subdural utilizando la escala de función motora BBB. Aquí están representados varios grupos de animales, mostrando la viabilidad de cada procedimiento y su seguridad. Después de cada procedimiento, todos los animales mantuvieron una función motora normal sin diferencias en la puntuación de la BHE entre los grupos 7 días después del procedimiento, lo que indica la implementación segura del protocolo descrito. Además, un grupo de animales (Figura 4C) que demuestran una función motora de las extremidades posteriores deteriorada está representado para compararlo con los grupos de procedimiento subdural, para demostrar aún más que no se observaron efectos adversos en los grupos experimentales. Este grupo recibió un procedimiento de LM de contusión con una fuerza de 175 kdyn dispositivo de impacto, como se describe en la literatura previa12,13.
Implante bioelectrónico
Para la implantación del dispositivo, el protocolo incluye la creación de dos sitios de durotomía, uno para la entrada del catéter y otro para la salida, para facilitar el movimiento de los catéteres guía debajo de la duramadre y la colocación controlada del dispositivo. El dispositivo bioelectrónico consistía en dos brazos bifurcados unidos a una interfaz de PCB que está encapsulada por una carcasa biocompatible. Los brazos se conectan temporalmente a pequeños catéteres intratecales a través de una sutura de seda 7-0 para ayudar en el posicionamiento del implante. Los catéteres se tiran lentamente a través de los orificios de durotomía rostral, se deslizan debajo de la duramadre y a través de los orificios de durotomía de salida caudales al lugar de tratamiento. Luego, los brazos del implante adjuntos se tiraron y se colocaron en cada hemisección de la médula espinal. El extremo de la cola del implante se sutura al músculo unido al proceso T13. La carcasa se sutura al músculo trapecio / ancho rostral a la laminectomía. Luego, la piel se cierra alrededor de la base de la unidad de vivienda para proporcionar acceso externo.
Tratamiento con hidrogel
Para la administración de hidrogel, solo se requiere un punto de entrada. El hidrogel se administró a través de catéteres intratecales similares colocados en el mismo lugar que el dispositivo de estimulación. Los catéteres se cargaron con 10 μL de un hidrogel de poloxámero12 y se insertaron en el espacio subdural de la misma manera que los pasos de implantación del dispositivo. Una vez en su lugar, los catéteres se retrajeron lentamente mientras el hidrogel se liberaba continuamente debajo de la duramadre (Figura1B) en cada hemicordón. Después de cada procedimiento, los animales fueron monitoreados durante 7 días para garantizar una recuperación adecuada.
Se utilizó la escala Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) de 21 puntos para la evaluación de la función motora16. Los animales de ambos grupos fueron evaluados antes del procedimiento (línea de base) y a los 1, 3 y 7 días después de la cirugía. El comportamiento en campo abierto se evaluó directamente y mediante grabaciones de video ciegas. Las puntuaciones de la función motora para las extremidades posteriores izquierda y derecha de cada grupo se compararon con animales de control no operados y un grupo separado de LME para determinar el alcance de los efectos adversos de la cirugía. Los animales en el grupo de implantes o hidrogel no mostraron déficit en la función motora después de ninguno de los procedimientos, en comparación con los controles no operados o los animales con LME lesionados. Cabe destacar que el análisis histológico que confirma la ausencia de daño medular ya se ha publicado en nuestro trabajo anterior. Ese estudio demostró que el uso de este método para implantar un dispositivo no produce un trauma medular adicional hasta 7 días después del procedimiento11. Se observaron cambios mínimos en la actividad de los astrocitos (GFAP) y la microglía / macrófagos (Iba1) después de la implantación de un dispositivo en comparación con los animales de control. También se examinó el área de superficie y la redondez de las secciones de la médula espinal coronal directamente debajo del implante, sin mostrar cambios en la morfología.
Figura 1: Estrategias de tratamiento subdural. (A) Ejemplo del dispositivo de implante y (B) catéter/jeringa utilizado para inyectar el hidrogel. (C) Modelos representativos tanto del implante como de la inserción de hidrogel en la médula espinal de una rata. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de la laminectomía, representando el campo quirúrgico. (A) Orientación del animal para las imágenes quirúrgicas en la Figura 2 y Figura 3. (B) Puntos de referencia del tendón muscular para la ubicación del proceso T13 para guiar el inicio de la disección muscular. (C) Cortes perpendiculares para identificar cada proceso que se eliminará mediante laminectomía. (D) Canales musculares cortados paralelos a los procesos espinales para permitir el acceso a las placas óseas para su eliminación. (E) Clips de serrefina de Bulldog utilizados para sujetar el músculo / piel a ambos lados de la columna vertebral para proporcionar un espacio quirúrgico adecuado. (F) Extirpación de los tendones blancos que interconectan cada proceso antes del inicio de la laminectomía. (G) Campo quirúrgico al comienzo de la laminectomía a medida que se deslizan los rongeurs debajo de la placa T12 para comenzar a cortar el hueso. (H) La primera mitad del proceso T12 se extrae para exponer la médula espinal y dejar espacio adecuado para que el cirujano se mueva rostralmente y comience a extirpar los procesos restantes (T11 / T10). (I) Extirpación de la porción craneal de T12, con extirpación completa del segmento. (J) Laminectomía a mitad de camino completa en T11 usando cortes más anchos para la aplicación de un ejemplo de SCI de contusión. (K) Laminectomía completa después de la extirpación de los segmentos T10-T12, exponiendo completamente la superficie dorsal de la médula espinal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Pasos para realizar la durotomía y aplicar el tratamiento dirigido. (A) Esquema de la ubicación de los orificios en la duramadre de la médula espinal. (B) Campo quirúrgico que muestra una aguja de 27 G que penetra en la duramadre para crear la durotomía; esto se hace en ambos lados del vaso sanguíneo central como se ve en (A). (C) Inserción inicial de un catéter utilizado para la aplicación del tratamiento. (D) Dispositivo de estimulación eléctrica colocado en la médula espinal. (E) Catéteres cargados con hidrogel para inyección en la superficie de la médula espinal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Condición postoperatoria y función motora. (A) Imágenes representativas de animales después de la implantación del dispositivo y la administración de hidrogel. (B) Puntuaciones BBB representativas de animales con una lesión por contusión espinal en comparación con animales que se sometieron a un procedimiento subdural (implante o hidrogel) o animales de control que no tuvieron manipulación. Los tamaños de muestra de los grupos de control (no operados), LME e implantes fueron n = 5, y el tamaño de la muestra del grupo de hidrogel fue n = 3. Las barras de error representan el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Herramientas quirúrgicas. Fotografía de las herramientas quirúrgicas utilizadas. (1) Bisturí de hoja #10. (2) Micro tijeras Vannas. (3) Pinzas Graefe. (4) Clips de bulldog Serrefine. (5) Rongeurs. (6) Aguja de 27 G para durotomía. (7) Pinzas finas. (8) Jeringa de 1 ml para aplicación de solución salina según sea necesario. (9) Tijeras de disección. (10) Hemostáticos para sutura. (11) Hisopos de algodón puntiagudos. (12) Bolas de algodón esterilizadas. (13) Toallitas enrolladas sin pelusa. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura complementaria 2: Espacio subdural vs. epidural. Representación esquemática de la columna vertebral y la médula espinal, que demuestra la epidural vs. espacio subdural. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Discusión
La metodología presentada aquí proporciona instrucciones paso a paso para acceder al espacio subdural espinal y demuestra su seguridad y viabilidad a través de dos ejemplos de administración de tratamiento a la región torácica de la médula espinal11,12. Numerosos grupos de investigación han desarrollado enfoques en un intento de tratar la lesión de la médula espinal (LME) a través de intervenciones eléctricas o químicas. Las estrategias actuales, incluidos los dispositivos implantables para optogenética17 o la estimulación eléctrica18, así como las terapias farmacéuticas que utilizan hidrogeles19,20, han demostrado diversos grados de éxito para facilitar la recuperación y la rehabilitación. Sin embargo, la orientación precisa sigue siendo un desafío crítico, ya que la mayoría de los tratamientos actuales se administran fuera del espacio subdural. La técnica descrita aquí ofrece un enfoque prometedor para administrar intervenciones directamente a la médula espinal, incluido un medio de acceso a largo plazo al espacio subdural (Figura complementaria 2), que respalda la administración sostenida y dirigida de agentes terapéuticos para LME y afecciones neurodegenerativas. Esto tiene implicaciones importantes para eludir la barrera hematomedular, un desafío importante en el desarrollo de tratamientos efectivos para los trastornos de la médula espinal.
Laminectomy
Si bien los procedimientos de laminectomía en roedores se utilizan ampliamente 17,21,22, hay varios aspectos críticos del protocolo que deben tenerse en cuenta. Los puntos de referencia anatómicos utilizados en el protocolo anterior (paso 4.3; Figura 2A) permiten el acceso a la región torácica inferior de la médula espinal y son específicos para el trabajo de nuestro grupo. Si el procedimiento se va a aplicar a una región espinal diferente, se pueden contar segmentos rostrales o caudales a las vértebras iniciales para determinar la ubicación. Otra consideración crucial es el grado de eliminación de la lámina. Para minimizar el riesgo de lesiones no deseadas en la médula espinal durante el procedimiento, se deben eliminar al menos dos niveles contiguos. De este modo, se proporciona suficiente espacio para la durotomía y se garantiza una visualización adecuada. Esta precaución reduce el riesgo de lesionar los vasos sanguíneos pequeños durante la inserción del catéter. También se debe evitar la extracción excesiva de hueso de la pared lateral de la columna vertebral para evitar hemorragias innecesarias o inestabilidad de la columna vertebral después de la cirugía. Al mantener un equilibrio entre el acceso adecuado y la interrupción mínima, el procedimiento garantiza una administración de tratamiento más segura y precisa.
Durotomía e inserción de catéter
Realizar la durotomía requiere precisión para evitar penetrar en la médula espinal. La inserción incorrecta puede provocar hematomas o laceraciones en la médula espinal o los vasos sanguíneos subdurales. Las aberturas creadas en la duramadre deben ser lo suficientemente grandes como para acomodar la estrategia de tratamiento deseada, en este caso, el diámetro de los catéteres intratecales, sin comprometer la integridad de la membrana. Al realizar la durotomía, el líquido cefalorraquídeo puede filtrarse cuando se perfora la duramadre; sin embargo, la cantidad es mínima. Si bien los desgarros grandes en la duramadre pueden provocar complicaciones, la literatura previa sugiere que las punciones pequeñas como las utilizadas en el protocolo descrito (paso 6.4) pueden autocurarse a través de la deposición / vascularización de colágeno23, lo que no produce ningún efecto adverso medible después del procedimiento. Al colocar los catéteres, deben insertarse lo más paralelos posible a la médula espinal para minimizar el riesgo de lesiones por fuerza directa. Es necesario un manejo cuidadoso para evitar que se doble o se engarce, asegurando una inserción suave y un posicionamiento adecuado.
Cuidados postoperatorios
El cuidado postoperatorio después del procedimiento es una consideración importante dado que los roedores generalmente se alojan en grupos en condiciones estándar. El comportamiento agresivo o las interacciones sociales después de este procedimiento pueden afectar los resultados experimentales, según el tipo de tratamiento aplicado. Este protocolo da como resultado una línea de suturas de piel de 6-8 cm a lo largo de la espalda del animal. Se recomienda mantener animales de una sola casa durante 7-10 días después de la operación para permitir la cicatrización de heridas y evitar la posible eliminación de suturas por parte de un compañero de jaula. En el caso de una aplicación de administración de medicamentos, una vez que la incisión sana, se pueden reubicar en grupos anteriores sin comportamiento abiertamente agresivo ni complicaciones relacionadas con el procedimiento. En el caso de los dispositivos implantables, los animales solo deben alojarse en grupos de 2. Hemos encontrado que alojar animales en grupos de 3 o más puede resultar en complicaciones relacionadas con la agresión con los resultados del tratamiento.
Aplicaciones del tratamiento
Aunque el procedimiento descrito aquí se centra en la médula espinal torácica y dos estrategias de tratamiento específicas, es adaptable para otras regiones de la columna vertebral y aplicaciones terapéuticas adicionales. Se han realizado con éxito procedimientos de laminectomía similares en varios niveles de la columna vertebral en modelos de roedores. Sin embargo, el pequeño espacio subdural en los roedores presenta un desafío, dejando un margen mínimo de error durante la administración del tratamiento. Si bien los pasos de laminectomía y durotomía pueden ser realizados fácilmente por personas con experiencia en cirugías de roedores, la colocación precisa de un dispositivo o medicamento debajo de la duramadre sin causar lesiones puede requerir tiempo de capacitación adicional. Además de la capacitación quirúrgica, existen varios factores que pueden ayudar en la aplicación del tratamiento. Mantener un campo de visión despejado mientras se aplica el tratamiento es crucial. Al usar catéteres intratecales como se describe en este estudio, asegúrese de que no haya puntos irregulares o ásperos en los catéteres antes de insertarlos debajo de la duramadre. Como se mencionó anteriormente, la ubicación de la durotomía es extremadamente importante. Cuanto más lejos esté el punto de entrada del catéter de la lámina rostral restante, más fácil será que los catéteres se alineen y permanezcan paralelos a la médula espinal durante la inserción. También se debe tener en cuenta el momento de las estrategias de tratamiento en relación con una lesión. El trabajo futuro implicará el establecimiento de estos procedimientos en animales en varios momentos posteriores a la lesión para permitir posteriormente la evaluación de tratamientos destinados a abordar lesiones crónicas. Este protocolo representa un avance significativo en la aplicación del tratamiento de enfermedades neurológicas de la médula espinal y proporciona un enfoque versátil y preciso para administrar terapias directamente al tejido de la médula espinal.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo está financiado por CatWalk Spinal Cord Injury Trust y una beca de investigación HRC Sir Charles Hercus (BH). Este trabajo también fue apoyado por el Subsecretario de Defensa para Asuntos de Salud, avalado por el Departamento de Defensa, por un monto de US$534.258, a través del Programa de Investigación de Lesiones de la Médula Espinal bajo el Premio No. HT9425-23-1-0492. Los esquemas de la Figura 2A y la Figura 3A se generaron utilizando Biorender.com.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Jeringuillas de 1 mL y 3 mL | Amtech | ||
| Jeringuillas de tuberculina de 1 ml | BD | 302100 | |
| 2 pinzas Graefe | FST | 11051-10 | |
| Agujas de 25G para administración de medicamentos | Nipro | SH811 | |
| Agujas de 27G para la incisión dural | Nipro | SH816 | |
| 6 pinzas bulldog de tejido | FST | 18051-28 | |
| 70 % etanol | |||
| Baytril 5 mg/kg | Elanco | KV04UHU | |
| Guantes de látex de Biogel Surgeons | Molnlycke | 822775-01 | |
| Bupivicaína 2 mg/kg | Aspen Nueva Zelanda | 2023-02 | |
| Buprenorfina 0,05 mg/kg | Ceva (Vetergesic) | 9000320 | |
| Clorhex y tintura de ehtanol | Perrigo | K076A | |
| Frotado con clorhex | Schulke | LBL11258 | |
| Rongeurs curvados | FST | 16021-14 | |
| Pinzas Dumont #4 | FST | 11294-00 | |
| Gelfoam, esponja de gelatina estéril absorbible | GELFOAM | 09-0342-04-015 | |
| Jeringuilla Hamilton | Hamilton | 80314 | |
| Almohadilla térmica (37 oC) | Kent Scientific | SF-01 | |
| Hemostat | FST | 13004-14 | |
| Impactor y software Infinite Horizon | Sistemas de precisión e instrumentación (PSI) | IH-0400 | |
| Isoflurano | Medsource | Desconocido | |
| Metacam 2 mg/kg | Boehringer Ingelheim | D02818 | |
| Suturas no absorbibles (Ethilon 4-0, P-3) | Ethicon | 1603G | |
| O2 acuario | |||
| Microscopio Quirúrgico Omax | Jacobs Digital | W43DPT | |
| Prensa y sella film transparente para el drapeado | Me alegro | N/A | |
| Mango de bisturí | Herramientas Científicas Finas (FST) | 10004-13 | |
| Hojas de bisturí tamaño 10 | Amtech Medical | SH070 | |
| Suite de inducción Somnoflow | Kent Scientific | SF-01 | Sistema anestésico de bajo flujo |
| Almohadillas absorbentes estériles y algodón | Swisspers | N/A | |
| Cotonetes estériles (estándar + puntiagudo) | help@hand | N/A | |
| Solución fisiológica estéril 0,9% | Fabricado y autoclavado en laboratorio | N/A | |
| Secciones estériles de Kim Wipe enrollada | Ciencia Kimtech | 34155 | |
| Sonda de temperatura | Kent Scientific | SF-01 | |
| Tijeras de primavera Vannas | FST | 15903-08 | |
| Lubricante a base de agua | |||
| Balanzas | Cualquiera | N/A |
Referencias
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- Lee, B. B., Cripps, R. A., Fitzharris, M., Wing, P. C. The global map for traumatic spinal cord injury epidemiology: Update 2011, global incidence rate. Spinal Cord. 52 (2), 110-116 (2014).
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