Técnica de inyección subretiniana transescleral mínimamente invasiva optimizada en ratón

Resumen

Las inyecciones subretinianas son una técnica indispensable para el desarrollo preclínico de terapias para enfermedades de fotorreceptores y EPR. Describimos una técnica de inyección subretiniana transescleral optimizada en ratones que mejora las tasas de éxito intraoperatorio y minimiza el daño retiniano.

Resumen

El método convencional de administración de material al espacio subretiniano en el ratón implica la perforación dual de la retina neural, lo que causa un daño quirúrgico extenso. Esto conduce a la variabilidad en las medidas de resultado posteriores de la función visual, como los registros de electrorretinograma (ERG) o los ensayos de visión conductual, que confunden las evaluaciones de eficacia de las terapias experimentales. Para superar estas barreras, optimizamos una técnica de inyección subretiniana transescleral mínimamente invasiva en ratones. En esta técnica, se accede al fórnix superior utilizando un espéculo palpebral de alambre de tungsteno hecho a medida para realizar la peritomía conjuntival y la tenotomía. Se realiza una esclerotomía milimétrica con un cuchillo de diamante sin penetrar en la retina, a través del cual se inserta cuidadosamente una aguja de vidrio fina en un ángulo poco profundo. La carga útil se envía al espacio subretiniano mediante una bomba de microinyección. La tomografía de coherencia óptica (OCT) se utiliza para evaluar el tamaño y la posición de la ampolla subretiniana inmediatamente después de la inyección. Se compararon los resultados de esta técnica con el método transretiniano convencional realizado con una jeringa con resorte con una esclerotomía con aguja 33G. Las grabaciones de ERG indicaron una excelente preservación de la función retiniana en ratones inyectados transescleralmente, comparable a la de los ratones de control no inyectados. Por el contrario, se observó una reducción apreciable de la señal ERG en las cohortes inyectadas convencionalmente. En resumen, hemos optimizado una técnica mínimamente invasiva para la inyección subretiniana en ratones. Demostramos que esta técnica es un método robusto y eficiente para la administración de terapia génica que minimiza el daño anatómico a la retina y tiene un impacto mínimo en la función de la retina. Este método reduce el umbral para el desarrollo de terapias dirigidas tanto al epitelio pigmentado de la retina como a los fotorreceptores para tratar una amplia gama de enfermedades retinianas y maculares.

Introducción

La inyección subretiniana es un procedimiento quirúrgico ocular en el que se administra material al espacio potencial entre la retina y el epitelio pigmentado de la retina (EPR). En comparación con otros métodos de administración de fármacos al segmento posterior, como las inyecciones intravítreas o supracoroides, las inyecciones subretinianas logran el acceso más inmediato tanto a los fotorreceptores como al EPR. Para la administración de partículas de terapia génica viral, la inyección subretiniana logra tasas mucho más altas de transducción de fotorreceptores y EPR, lo que permite títulos virales más bajos y un menor riesgo de toxicidad viral¹. Además, el espacio subretiniano está anatómicamente confinado, lo que limita la propagación sistémica de partículas virales y reduce el riesgo de respuestas inmunes². En humanos, el perfil de seguridad de las inyecciones subretinianas es muy favorable, y la estructura y función de la retina se recuperan a los niveles basales dentro de 1 mes después de la inyección ^3,4. Las inyecciones subretinianas se utilizan en una serie de aplicaciones, como el trasplante de células madre y la administración de fármacos de moléculas pequeñas², siendo su uso más común la administración de vectores virales para tratamientos de terapia génica de enfermedades de la retina. Los títulos virales relativamente bajos, la exposición sistémica mínima y la alta tasa y especificidad de transducción asociadas con las inyecciones subretinianas las han convertido en una técnica indispensable en el campo de la retina. Las inyecciones subretinianas se utilizan con éxito en pacientes para el tratamiento de trastornos hereditarios de la retina, incluida la retinosis pigmentaria y la amaurosis congénita de Leber ^5,6.

Dada su importancia en este campo, la capacidad de realizar inyecciones subretinianas en ratones es crucial para los estudios preclínicos que investigan terapias para enfermedades hereditarias de la retina. Sin embargo, los métodos actuales para las inyecciones subretinianas en ratones tienen altas tasas de fracaso y a menudo causan daño quirúrgico a la retina, lo que puede limitar la confiabilidad y consistencia de las medidas de resultado funcionales. Convencionalmente, las inyecciones subretinianas en roedores se realizan por vía transretiniana, de modo que la aguja penetra en la retina anterior, pasa por el cristalino y entra en el espacio subretiniano como resultado de una segunda penetración en la retina ^7,8 (Figura 1A). Si bien es relativamente fácil de realizar, este procedimiento introduce una marcada inconsistencia en los resultados experimentales debido a la extensión variable del daño quirúrgico. Esto es particularmente limitante para los estudios que utilizan medidas de resultado de la visión conductual y funcional. Además, el cristalino es desproporcionadamente grande en ratones en comparación con los humanos; Esto aumenta significativamente el riesgo de daño al cristalino durante la inyección transretiniana, lo que hace que el animal sea inutilizable para las evaluaciones funcionales de la visión⁴.

Una opción alternativa es la vía de inyección transescleral, que evita estos problemas accediendo al espacio subretiniano mediante un abordaje posterior, donde la aguja penetra en la esclerótica, la coroides, la membrana de Bruch y el EPR ^4,9 (Figura 1B). Este enfoque minimiza el daño retiniano al evitar por completo la penetración en la retina. También se asocia con un reflujo reducido del material inyectado del espacio subretiniano¹⁰, lo que permite resultados más consistentes y cohortes experimentales más pequeñas. Aunque la técnica de inyección subretiniana transescleal en ratones ha sido descrita previamente en la literatura, su adopción generalizada sigue siendo limitada por su dificultad técnica, que puede impedir la tasa de éxito⁴. Aquí, describimos varias mejoras en el procedimiento de inyección transescleral, que facilitan y agilizan su realización, reducen la variabilidad experimental y mejoran las tasas de éxito de la inyección. Estas mejoras incluyen el desarrollo de un espéculo palpebral de ratón, la administración preoperatoria de atropina, la creación de una esclerotomía milimétrica con un cuchillo de diamante y la optimización del tamaño de la aguja y el enfoque de inyección. Esta técnica consigue una excelente cobertura de transducción viral de los fotorreceptores y del EPR, sin causar ningún impacto quirúrgico detectable por ERG.

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Duke y la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión.

1. Preparación de animales

1. Administrar una inyección intraperitoneal de 1 mg/kg de atropina (en un volumen total de 50 μL) 30 min antes de realizar la inyección subretiniana. Este paso aumenta en gran medida las tasas de éxito al prevenir los reflejos oculocardíacos y oculorespiratorios potencialmente letales desencadenados por la elevación transitoria de la presión intraocular durante la inyección^11,12.
   NOTA: Nuestra dosis de atropina está optimizada para ratones C57BL/6 y es posible que deba ajustarse para otras cepas de ratón. No hemos observado diferencias apreciables de sexo o edad en la dosis de atropina.
2. Durante todo el procedimiento, mantenga al ratón sobre una superficie cálida para maximizar la comodidad del animal y reducir el desarrollo de cataratas frías.
3. Anestesiar al ratón con isoflurano inhalado al 2% en oxígeno (2 L / min) hasta que se observe decúbito y el animal ya no responda al pellizco del dedo del pie. Aplique una gota de proparacaína al 0,5% en el ojo para anestesia tópica.
4. Aplicar una gota de la mezcla de ciclopentolato al 0,2% y fenilefrina al 1% en el ojo para dilatar la pupila para la obtención de imágenes postoperatorias de la ampolla subretiniana por OCT. La fenilefrina también sirve para reducir el sangrado intraoperatorio al contraer los vasos sanguíneos superficiales¹³.

2. Esclerotomía

1. Antes de comenzar el procedimiento, cargue una microaguja de vidrio con el volumen deseado de solución a inyectar. Conecte la aguja al microinyector, con una presión de compensación establecida en 5 hectopascales (hPa) para contrarrestar la acción capilar. Por lo general, usamos volúmenes de 1 μL para inyecciones subretinianas.
2. Coloque el ratón bajo un microscopio estereoscópico de disección. Utilice un aumento de 20x para los pasos 2.3-2.6 y un aumento de 50x para los pasos 2.7-3.5.
3. Para ratones jóvenes, realice una cantotomía lateral antes del procedimiento, para proporcionar un amplio acceso y visualización del sitio quirúrgico.
4. Exponga el fórnix superior con la ayuda de un espéculo de alambre en miniatura hecho a medida (Figura 1C). Inmovilizar el espéculo para permitir la retracción del párpado superior con las manos libres.
5. Con unas tijeras Vannas en ángulo, realice una incisión paralimbal (~ 1 mm posterior al limbo) en la conjuntiva superior y la cápsula de Tenon para exponer las 3-4 horas de reloj superiores de la esclerótica. Tenga cuidado de evitar perforar el seno venoso retroorbitario. Retire cualquier resto de la cápsula de Tenon que recubra el sitio de inyección previsto con cuidado pero a fondo.
6. Sujete el borde anterior de la peritomía conjuntival y la tenotomía con pinzas dentadas de bloqueo e inferoducto el globo suavemente para exponer la esclerótica superior. Inmovilice las pinzas bloqueadas para permitir la inferoducción con manos libres.
7. Aplique una gota de solución salina tamponada equilibrada (BSS) inmediatamente en el ojo para evitar que la esclerótica desnuda se seque. También encontramos útil el aumento óptico producido por la gota BSS.
8. Con un cuchillo de diamante, haga una esclerotomía precisa a ~ 12 en punto y ~ 1-2 mm del limbo. Coloque la cuchilla en un plano tangencial con respecto a la esclerótica para asegurarse de que la esclerotomía sea lo más pequeña y superficial posible.
   NOTA: Esto se hace por dos razones: (1) una esclerotomía pequeña permite un ajuste apretado de la aguja de vidrio, lo que reduce el reflujo durante el paso de inyección, y (2) una esclerotomía superficial es fundamental para evitar penetrar en la retina. Tenga en cuenta que puede aparecer una pequeña cantidad de sangre coroidea en el sitio de la esclerotomía, lo que no connota ninguna implicación negativa para el resultado del procedimiento.

3. Inyección subretiniana transescleral

1. En preparación para la inyección, use una esponja quirúrgica para eliminar suavemente todo el BSS de la superficie del ojo.
2. Sostenga la aguja biselada hacia abajo en un ángulo poco profundo con respecto a la esclerótica e introduzca la punta lenta y cuidadosamente en la esclerotomía para acceder al espacio subretiniano. Para evitar penetrar en la retina, hágalo en un ángulo relativamente poco profundo y lo suficientemente profundo como para despejar la abertura de la esclerotomía en 0,5-1 mm.
   NOTA: El bisel de la aguja se coloca hacia abajo para minimizar la posibilidad de parto coroideo y para reducir la probabilidad de perforar la retina con la punta de la aguja de avance.
3. Mientras sostiene la aguja en una posición estable, inicie la inyección a 500 hPa con un pedal y mantenga la presión ininterrumpida durante 15 s.
4. Para finalizar la inyección, mantenga la presión de inyección hasta que la aguja se retire por completo de la esclerotomía. Si la presión se interrumpe prematuramente mientras la aguja aún está en el espacio subretiniano, una gran parte de la carga útil inyectada puede salir rápidamente del ojo hacia la aguja por acción capilar.
5. Una vez que se retira la aguja, observe un reflujo parcial de la solución inyectada a través del sitio de la esclerotomía. Esto es de esperar, dado que el volumen de 1 μL excede la capacidad del espacio subretiniano incluso en ratones adultos. La ausencia de reflujo puede indicar una inyección fallida debido a un parto coroideo o intravítreo inadvertido.
6. Retire las pinzas de bloqueo y el espéculo del párpado del ojo. Tenga cuidado de evitar aplicar presión sobre el globo, ya que puede causar un mayor reflujo de la solución inyectada.
7. Inmediatamente después de la inyección, aplique un ungüento ocular lubricante abundante en el ojo para permitir la visualización de la ampolla subretiniana antes del^{OCT 14}.
8. Aplique ungüento tópico de eritromicina en el ojo y brinde cuidados postoperatorios generales al animal.

Resultados

Una inyección exitosa utilizando esta técnica transescleral genera una ampolla subretiniana observable en la OCT inmediatamente después del procedimiento de inyección (Figura 2A). Dado el desafío técnico de esta técnica, el paso de imagen es indispensable para identificar animales inyectados con éxito. Para los investigadores que planean utilizar esta técnica para experimentos de terapia génica, recomendamos realizar inyecciones de práctica con partículas de virus adenoasociados (AAV) que ll...

Discusión

La técnica descrita aquí introduce varias mejoras al enfoque de inyección transescleral descrito anteriormente⁴, que mejoran la confiabilidad del procedimiento y reducen aún más el daño quirúrgico al ojo. Una de esas mejoras es el uso de un espéculo para retraer el párpado superior, lo que permite un acceso estable, sin trabas y con manos libres al ojo. Los espéculos comerciales a menudo están mal optimizados, incluso para ratones adultos, y no están disponibles p...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Inyección de cloruro de sodio al 0,9%, USP	Hospira	PAA130066
Solución oftálmica de sulfato de atropina al 1%, USP	Akorn	NDC 17478-215-05
30° cuchillo de diamante	Katena	K2-6560
Iluminador LED de cuello de cisne dual AmScope de 6W	Alcance	LED-11CR
Tijeras Vannas en ángulo	Roboz	RS-5618
Solución de irrigación estéril BSS	Alcon	289010-0902
Gotas para dilatar los ojos con ciclomidril	Alcon	0065-0359-02	0,2% ciclopentolato, 1% fenilefrina
Puntas de pipeta epT.I.P.S. MicroloaderTM	Eppendorf	5242 956.003
Microinyector FemtoJet 4i	Eppendorf	E5252000021	Producto descatalogado
GenTeal Tears ungüento lubricante para los ojos	Alcon	16027802
Agujas de microinyección de vidrio	Clunbury Científico	B100-58-50	30° bisel. Diámetro: 50 µ m exterior, 29 µ m interior
Solución de isoflurano	Covetrus	29405
Microscopio de imagen de retina MICRON IV con OCT guiada por imágenes	Fénix	N/A
Microscopio estereoscópico SteREO Discovery.V8	Zeiss	495015-0001-000
Pinzas dentadas de bloqueo Stern-Castroviejo	Katena	K5-2552
Pinzas dentadas	Roboz	RS-5172
Hilos de limpieza de tungsteno para agujas de calibre 23s	Hamilton	18306
Ultracell PVA Lanzas Oculares	Médico de las Islas Vírgenes Británicas	40400-8
Jeringas de insulina Ultra-Fine2015	BD	328438	3/10 ml, 8 mm (5/16"), 31 G