Artículo de método

Destacando la transición del citocromo C mitocondrial mediante microscopía electrónica de inmunotransmisión

DOI:

10.3791/68633

⸱

15 de agosto de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Department, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Critical Care Medicine, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan, 3Sichuan Scientist Biotechnology Co., Ltd, 4Department of Critical Care Medicine, Deyang Hospital Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 6Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo describe métodos para estudiar los cambios micromorfológicos en las neuronas y la transición del citocromo c mitocondrial mediante microscopía electrónica de inmunotransmisión.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los cambios de ubicación de las proteínas en la microestructura a menudo presentan un mecanismo de regulación preciso a nivel de orgánulos patológicos. Cómo capturar con precisión la ubicación de esta transferencia de proteínas de orgánulos tiene un significado y un valor positivos para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades. Las mitocondrias juegan un papel central en la necrosis y la vía intrínseca de la apoptosis. En condiciones normales, el citocromo c (Cyt c) solo existe entre las membranas interna y externa de las mitocondrias y en el núcleo. Cuando las células sufren apoptosis, la permeabilidad de la membrana interna mitocondrial se altera y Cyt c se libera de las mitocondrias al citoplasma. En este estudio, se estableció un modelo de rata de lesión por isquemia-reperfusión cerebral, y los cambios micromorfológicos de las neuronas sometidas a apoptosis se mostraron mediante microscopía electrónica de inmunotransmisión. Además, muestra con mayor precisión la visión del marcado de inmunooro que transfiere Cyt c de la matriz mitocondrial al citoplasma después de una lesión por isquemia-reperfusión cerebral. La técnica de microscopía electrónica de inmunotransmisión presentada en este protocolo es adecuada para la demostración de cualquier transición de posición de proteínas a nivel microscópico.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Según el estudio de la carga mundial de morbilidad de 2021, el accidente cerebrovascular fue la3ª causa principal de muerte y la4ª causa principal de años de vida ajustados por discapacidad. Hubo 11,9 millones de nuevos eventos de accidente cerebrovascular, en los que el accidente cerebrovascular isquémico constituyó el 65,3% (7,8 millones)1. La muerte neuronal ocurre después de la isquemia cerebral, incluida la necrosis y la apoptosis. El tejido cerebral más gravemente afectado sufre posteriormente la muerte celular necrótica. Las neuronas en la penumbra isquémica o zona de periinfarto pueden sufrir apoptosis después de varias horas o días2. Además de las funciones bioenergéticas y metabólicas, las mitocondrias también juegan un papel central en la vía intrínseca de la apoptosis 3,4,5,6.

Cyt C es una proteína codificada por genes nucleares. En condiciones normales, Cyt C solo existe entre las membranas interna y externa de las mitocondrias y en el núcleo. La vía apoptótica mediada por su liberación se asocia con el control regulador de los miembros de la familia Bcl-2. Después de ser estimulados por la apoptosis, se forman oligómeros de Bax/Bak y se insertan en el poro de la membrana externa mitocondrial, lo que resulta en cambios en la presión osmótica mitocondrial y pérdida del potencial transmembrana. Cyt C se libera de las mitocondrias al citoplasma, donde se une al activador de la apoptosis 1 para formar el complejo apoptótico y activar la pro-caspasa-9. A su vez, se activan la caspasa-3 y la caspasa-7, lo que inicia la cascada de caspasas e induce la apoptosis celular7.

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) puede observar claramente los cambios en la estructura celular en diferentes etapas de la apoptosis. La observación morfológica por microscopía electrónica es un método confiable para determinar la apoptosis8. Sin embargo, no puede observar cambios en Cyt C en la ultraestructura. Existen varias técnicas para detectar proteínas específicas en la ultraestructura: citometría de flujo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, espectrofotometría y Western blotting. Sin embargo, no pueden capturar con precisión los cambios de ubicación de la proteína en la microestructura. El oro coloidal tiene partículas de diferentes tamaños y la densidad electrónica del oro coloidal es alta. La tecnología Immunogold es especialmente adecuada para estudios de localización de microscopía inmunoelectrónica de una o varias etiquetas. Debido a su coloración roja clara a oscura inherente, el oro coloidal también es susceptible de observación bajo microscopía óptica. Cuando se marcan proteínas específicas con Immunogold, los cambios de ubicación se pueden visualizar por medio de un TEM a una resolución subcelular9.

Este protocolo describe el resaltado de la transición de Cyt C mitocondrial mediante microscopía electrónica de inmunotransmisión (IEM). El objetivo general de este método es visualizar la translocación subcelular de Cyt C durante la apoptosis inducida por isquemia usando IEM. La razón de ser de la IEM es marcar Cyt C con oro coloidal y visualizar sus cambios de localización a resolución subcelular utilizando TEM9. El IEM puede observar los cambios dinámicos de las proteínas a nivel espacial, proporcionando un medio poderoso para explicar las actividades fisiológicas y patológicas10.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El programa de animales ha sido aprobado por el Comité de Ética de SLAS (Número de edición de IACUC: SYST-2024-018). Aquí, se criaron 6 ratas SD macho libres de patógenos (200-220 g) en jaulas de ventilación independientes, manteniendo el ambiente de laboratorio a 22-25 °C y 45%-65% de humedad relativa. Todas las ratas se sometieron a alimentación adaptativa durante 1 semana con agua libre y dieta durante el período.

1. Establecimiento del modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO)

  1. Divida aleatoriamente las ratas en el grupo MCAO y el grupo de operación simulada, con tres ratas en cada grupo. Consulte la Figura 1 para ver el diagrama de flujo experimental.
  2. Verifique el equipo involucrado en este protocolo de acuerdo con la lista de la Figura 2.
  3. Para establecer un modelo de MCAO de lesión por isquemia-reperfusión en ratas, utilice el procedimiento de sutura intraluminal.
  4. Ayunar a las ratas durante 12 h antes de la cirugía con agua accesible.
  5. Anestesiar ratas SD con isoflurano al 2% (ver Tabla de materiales) en una mezcla de aire y oxígeno a 0,6 L / min. Confirme la anestesia adecuada cortando la piel de las extremidades con fórceps; Las ratas no deben tener retracción ni reflejo en las piernas. Sujete las ratas completamente inconscientes en la mesa de operaciones y mantenga la temperatura corporal a 37 ° C con un mantenedor de temperatura animal. Cierre los ojos con cinta adhesiva durante la cirugía para evitar la sequedad.
  6. Retire el pelaje alrededor del cuello con una afeitadora eléctrica y desinfecte la piel con betadine. Realice una incisión en la línea media del cuello de 1,5 cm con tijeras quirúrgicas (consulte la tabla de materiales), realice una disección roma en el músculo y la fascia perivascular y exponga la tráquea para localizar la arteria carótida común derecha (CCA), la arteria carótida externa (ECA) y la arteria carótida interna (ICA). Las herramientas quirúrgicas deben esterilizarse para prevenir infecciones.
  7. Lime el extremo distal del ECA con una sutura quirúrgica 6-0 y coloque otra sutura quirúrgica sin apretar alrededor del extremo proximal del ECA hasta el punto de bifurcación. Tenga cuidado de no dañar el nervio vago.
  8. Sujete el CCA y el ICA con clips vasculares y haga una pequeña incisión en el ECA entre dos suturas quirúrgicas.
  9. Introduzca la sutura de monofilamento en la luz de ECA hacia el CCA, apriete la sutura quirúrgica alrededor del muñón de ECA para asegurar la sutura intraluminal y evitar el sangrado. Asegúrese de que la sutura de monofilamento coincida con el peso del animal para minimizar el daño y lograr un volumen de infarto objetivo del 40% en el hemisferio ipsilateral.
  10. Corte la parte restante del ECA para liberar el tocón y colóquelo debajo del punto de bifurcación de modo que esté aproximadamente en línea con el ICA.
  11. Retire el clip microvascular del ICA, continúe avanzando la sutura hasta que se sienta una leve resistencia, lo que indica la oclusión de la arteria cerebral media; Esta longitud suele ser de unos 2 cm. Ata bien la sutura alrededor del monofilamento. Retire el otro clip microvascular del CCA.
  12. Cierre la incisión con sutura quirúrgica y coloque a la rata en una jaula de recuperación, cuide al animal hasta 2 h después de la isquemia.

2. Restauración del flujo sanguíneo de la arteria cerebral media

  1. Antes de la reanestesia, verifique el neuroscore con la escala Longa Score para evaluar el éxito de la cirugía como se describe en el paso 3.
  2. Anestesiar a la rata como se indicó anteriormente y volver a abrir la incisión. Coloque un clip microvascular en el CCA, retire la sutura de oclusión hasta la mitad del ICA hasta que el extremo de la sutura sea visible a través del ICA.
  3. Coloque otro microclip en el ICA sobre la ubicación de la sutura intraluminal, retire completamente la sutura oclusiva y ate el muñón del ECA. Reperfusión durante 24h.
  4. Retire los clips del CCA y el ICA. Cierre la incisión con una sutura quirúrgica. Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg; ver Tabla de materiales) por vía subcutánea.
  5. Vuelva a colocar a la rata en la jaula, proporcione agua y comida triturada, y cuídela hasta que recupere la conciencia. Mantener la temperatura corporal de las ratas a 37± 0,5 °C durante todo el procedimiento experimental.

3. Evaluación de neuroscore

  1. Califique los déficits neurológicos después de la operación y 24 h después de la reperfusión utilizando la Longa Score Scale11: (0) sin déficit; (1) no extender completamente la pata delantera izquierda (lado paralizado); (2) dar vueltas hacia la izquierda (lado paralizado); (3) caer a la izquierda (lado paralizado); (4) no caminar espontáneamente y disminución de la conciencia; (5) muerto.
    NOTA: Tres operadores fueron evaluados de acuerdo con los estándares anteriores.

4. Recolección de tejido cerebral

  1. Recolectar tejidos cerebrales 24 h después de la reperfusión después de que se puntúen y evalúen los déficits neurológicos.
  2. Anestesiar a la rata como se describió anteriormente. Cortar la piel para exponer la cabeza y el cuello y cortar la médula cervical de la columna cervical con unas tijeras quirúrgicas (ver Tabla de materiales).
  3. Separe y retire los músculos posteriores del cuello. Retire con cuidado el cráneo con fórceps curvos (consulte la Tabla de materiales). Preste atención a la duramadre al separar el cráneo para evitar rascarse los tejidos cerebrales. Extirpar los tejidos cerebrales por completo.
  4. Coloque los tejidos cerebrales en el fijador TEM e IEM preenfriado a 4 °C y guárdelo en el refrigerador a 4 °C.

5. Operación simulada

  1. Para operaciones simuladas, realice todos los procedimientos como se indicó anteriormente, excepto que no se realiza la oclusión.

6. Preparación e imágenes de secciones ultrafinas

  1. Preparación de secciones ultrafinas TEM
    1. Fijación: Determine el sitio de muestreo de tejido fresco para minimizar el daño mecánico como tracción, contusión y extrusión, y asegúrese de que el grosor del tejido no exceda los 2 mm. Asegúrese de que el volumen del tejido no exceda 1 mm x 1 mm x 1 mm.
    2. Fijar con fijador TEM a 4 °C durante 24 h. Lavar 3 veces durante 15 min cada una en tampón de fosfato PB 0,1 M (pH 7,4; ver tabla de materiales).
    3. Post fijación: Añadir ácido ósmico al 1% ·0,1 M PB (ver Tabla de Materiales) durante 2 h a temperatura ambiente (25 °C).
    4. Deshidratación: Deshidratar el tejido sucesivamente en etanol al 30% durante 10 min, etanol al 50% durante 10 min, etanol al 70% durante 15 min, etanol al 90% durante 15 min, etanol absoluto durante 15 min y acetona al 100% durante 15 min.
    5. Inmersión de las encías: Sumerja los tejidos sucesivamente en la solución de resina epoxi SPI-Pon 812: acetona = 1:3 durante 30 min, solución SPI-Pon 812: acetona = 1:1 durante 30 min y solución SPI-Pon 812: acetona = 3:1 durante 1 h (ver Tabla de materiales).
    6. Polimerización e inclusión: Sumerja la muestra en SPI-Pon 812 puro durante la noche a 37 °C, cámbiela a SPI-Pon 812 fresco durante 8 h y polimerice a 60 °C durante 48 h (consulte la tabla de materiales).
    7. Corte: Cortar el bloque incrustado semifinamente a 0,8 μm de espesor con una cuchilla de diamante, teñir con azul de aminotolueno a 25 °C durante 5 min. Localice y seleccione áreas con neuronas densamente empaquetadas con un microscopio óptico para una observación de gran aumento. Realice secciones ultrafinas con un micrótomo a 90 nm de espesor. Coloque las muestras en rejillas de cobre recubiertas de 200-Mesh formvar (consulte la tabla de materiales).
    8. Post-tinción: Tiñe las rejillas en acetato de uranilo a 25 °C durante 15 min, luego tiñe las rejillas en citrato de plomo a 25 °C durante 5 min.
  2. Preparación de la sección ultrafina del IEM
    1. Realice los pasos 6.1.1-6.1.4.
    2. Inmersión de las encías: Sumerja los tejidos sucesivamente en la solución L. R. Resina blanca: Etanol = 1: 3 durante 2 h, solución L. R. Resina blanca: Etanol = 1: 1 durante 2 h y solución L. R. Resina blanca: Etanol = 3: 1 durante 2 h.
    3. Polimerización e inclusión: Sumerja la muestra en resina blanca L. R. pura durante la noche a 4 °C, cámbiela a resina blanca L. R. fresca durante 4 h a 25 °C y polimerice a 55 °C durante 78 h.
    4. Seccionamiento (como se hizo en el paso 6.1.7): Cortar los bloques incrustados semifinamente a 0,8 μm de grosor, teñir con azul de aminotolueno a 25 °C durante 5 min. Localizar y seleccionar áreas con neuronas densamente empaquetadas con un microscopio óptico. Realice secciones ultrafinas a 90 nm de espesor. Coloque las muestras en rejillas de cobre.

7. Etiquetado de Immunogold

  1. Enjuague 2 veces con PBS y 1 vez con tampón de glicina a 25 ° C durante 5 min cada uno, luego agregue tampón de fosfato al 2% de albúmina sérica bovina (PBS-BSA) e incube durante 30 min.
  2. Incubar en la solución de anticuerpo primario (anticuerpo policlonal de conejo contra el citocromo C) a 37 °C durante 2 h. El anticuerpo primario se diluye con PBS-BSA en una proporción de 1:50.
  3. Enjuague con PBS a 25 °C durante 5 veces durante 5 minutos cada uno. Incubar en la solución de anticuerpo secundario marcado con oro coloidal (IgG anticonejo de cabra conjugada con oro) a 25 °C durante 1 h. El anticuerpo secundario se diluye con PBS-BSA en una proporción de 1:20 (ver Tabla de materiales).
  4. Enjuague con PBS a 25 °C durante 5 veces durante 5 minutos cada uno. Enjuague con agua destilada a 25 °C durante 5 veces durante 5 minutos cada uno (consulte la tabla de materiales).
  5. Post-tinción: Tiñe las rejillas en acetato de uranilo a 25 °C durante 10 min, luego tiñe las rejillas en citrato de plomo a 25 °C durante 2 min (ver Tabla de materiales).
  6. Tome imágenes de la sección ultradelgada y tome fotos en un microscopio electrónico de transmisión a 80 kV.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La evaluación de neuroscore confirma el éxito de MCAO, según Longa Score Scale, ratas en el grupo MCAO presentaron al menos círculos hacia la izquierda (neuroscore 2). Las ratas del grupo de operación simulada no mostraron una disfunción neurológica obvia (neuroscore 0). No se observó mortalidad durante el día de la cirugía. El neuroscore de los animales se enumera en la Tabla 1.

El análisis IEM del grupo MCAO reveló neuronas con núcleos encogidos y densidad de electrones cito...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El objetivo principal de la terapia de reperfusión en el accidente cerebrovascular isquémico agudo es restaurar la perfusión sanguínea a la región isquémica. Ahora podemos lograr este objetivo a través de la trombólisis intravenosa, el tratamiento endovascular y la terapia antitrombótica. Sin embargo, la restauración de la perfusión sanguínea conduce a una lesión por isquemia-reperfusión, agrava la necrosis neuronal y la apoptosis, lo que conduce a un deterioro neurológico. Durante la is...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por el Proyecto Especial de Investigación Científica sobre Medicina Tradicional China de la Administración Provincial de Medicina Tradicional China de Sichuan (2021MS414).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución salina normal al 0,9%Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.
200 rejillas de cobre recubiertas de mallaZhongjingkeyi Technology Co., Ltd.BZ10262a
220-230g MCAO MonofilamentosBeijing Cinontech Co., Ltd.A4-243250
Etanol absolutoChengdu  Kelong  Química Co., Ltd.
acetonaChengdu  Kelong  Química Co., Ltd.
Sistema de anestesia animalRayward Life Technology Co., Ltd.R500
Rayward Life Technology Co., Ltd.69020
Mesa para hornearShenzhen Bangqi Chuangyuan Technology Co., Ltd.CT-946
Cizalla óseaHerramientas de ciencia fina16102-11
moldes de incrustación capsularZhongjingkeyi Technology Co., Ltd.Centrífuga GP130-B
SCILOGEXD3024R
Microscopía óptica de campo claro convencionalZeiss (Alemania)Pinzas
(10 cm)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.
Cuchillo de diamanteDiatome (Suiza)DU4530
Pinzas de disecciónRayward Life Technology Co., Ltd.F12018-10
Pinzas de disecciónRayward Life Technology Co., Ltd.F12010-10
Horno eléctrico de secado rápidoShanghai YiHENG Scientific Instrument Co., Ltd.DHG-9030A
Afeitadora eléctricaYiwu Kemei Electric Appliances Co., Ltd.KM-PG5002
Fluido de fijaciónSichuan Scientist Biotechnology CO., Ltd.Diapositiva de vidrio SC0001
Nantong Mevid Life Science Co., Ltd.
Cabra conjugada con oro anti-conejo lgGSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Pinzas hemostáticas (12,5 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL068
Pinzas hemostáticas (14 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL002
IsofluranoRayward Life Technology Co., Ltd.
L. R. Resina BlancaTianjin Tainuo Science and Technology Co., Ltd.
Citrato de plomoSPI (EE. UU.)GA10701
PortaagujasTecnología médica Jiachi Co., Ltd.
Tetróxido de osmioTED PELLA (EE. UU.)4008-220501
PBSServicebioG4202
Anticuerpo policlonal de conejo contra el citocromo  Affinity Biosciences, Ltd.AF0146
RatasBeijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd.
Kit de resina de incrustación SPI-Pon 812SPI (US)GS02660
Microscopio estereoscópicoSunny Optical Technology Co., Ltd.Tijeras de cabeza recta Soptop SZMN
(10 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL063
Pinzas oftálmicas rectas (10 cm)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.
Tijeras quirúrgicasRayward Life Technology Co., Ltd.S14001-10
Microscopía electrónica de transmisiónHitachi (Japón), Ltd.HT7800
ultramicrotomoLeica (Alemania)UC7
Acetato de uranioSPI (EE. UU.)GS02624
H2008340020231012012023120501Mantenedor de temperatura animal oftálmicas curvas Primo Star 211001220518001D1110942024071201AGR1281A10044036898028110322241102187881211001

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD 2021 Nervous System Disorders Collaborators. Global, regional, and national burden of disorders affecting the nervous system, 1990-2021: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet Neurol. 23 (4), 344-381 (2024).
  2. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (3), 231-341 (2008).
  3. Li, G. R., et al. Albiflorin: a promising natural monoterpene glycoside with potential therapeutic benefits for multiple physiological systems. Food Med Homol. , (2025).
  4. Ye, X. S., et al. The food and medicine homologous Chinese Medicine from Leguminosae species: A comprehensive review on bioactive constituents with neuroprotective effects on nervous system. Food Med Homol. 2 (2), 9420033(2025).
  5. Mubeen, M., Sakarwala, A. S., Bijarani, A. I., Kamal, M. T. Enhancing heart health: expanding the use of SGLT2 inhibitors in cardiovascular disease. Med Adv. 3 (2), 122-126 (2025).
  6. Zhang, Y. C., et al. Comprehensive analyses of nuclear mitochondria-related genes in the molecular features, immune infiltration, and drug sensitivity of clear cell renal cell carcinoma. Med Adv. 2 (3), 238-253 (2024).
  7. Broughton, B. R., Reutens, D. C., Sobey, C. G. Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia. Stroke. 40 (5), e331-e339 (2009).
  8. Guo, M. J., Lu, B., Gan, J. L., Wang, S. C., Jiang, X. J., Li, H. H. Apoptosis detection: a purpose-dependent approach selection. Cell cycle. 20 (11), 1033-1040 (2021).
  9. Squarzoni, S. Immunoelectron Microscopy Methods. Methods Mol Biol. 2655, 201-210 (2023).
  10. Liu, Y., Ohgaki, R., Okanishi, H., Xu, M., Kanai, Y. Amino acid transporter LAT1 is expressed on cancer cell-derived exosomes with potential as a diagnostic and prognostic biomarker. Sci Rep. 14 (1), 28458(2024).
  11. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  12. Sanderson, T. H., Reynolds, C. A., Kumar, R., Przyklenk, K., Hüttemann, M. Molecular mechanisms of ischemia-reperfusion injury in brain: pivotal role of the mitochondrial membrane potential in reactive oxygen species generation. Mol Neurobiol. 47 (1), 9-23 (2013).
  13. Lesnefsky, E. J., Chen, Q., Tandler, B., Hoppel, C. L. Mitochondrial Dysfunction and Myocardial Ischemia-Reperfusion: Implications for Novel Therapies. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 57, 535-565 (2017).
  14. Hetz, C., et al. channel inhibitors prevent mitochondrion-mediated apoptosis and protect neurons in a model of global brain ischemia. J Biol Chem. 280 (52), 42960-42970 (2005).
  15. Sanderson, T. H., Kumar, R., Sullivan, J. M., Krause, G. S. Insulin blocks cytochrome c release in the reperfused brain through PI3-K signaling and by promoting Bax/Bcl-XL binding. J Neurochem. 106 (3), 1248-1258 (2008).
  16. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labelling for scanning electron microscopy. Methods Mol Biol. 657, 297-313 (2010).
  17. Sachse, M., de Castro, I. F., Fournier, G., Naffakh, N., Risco, C. Metal-Tagging Transmission Electron Microscopy and Immunogold Labeling on Tokuyasu Cryosections to Image Influenza A Virus Ribonucleoprotein Transport and Packaging. Methods Mol Biol. 1836, 281-301 (2018).
  18. Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. Immunogold cytochemistry in neuroscience. Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).
  19. Veeramachaneni, R., Gu, X., Herrera, G. A. Atypical amyloidosis: diagnostic challenges and the role of immunoelectron microscopy in diagnosis. Ultrastruct Pathol. 28 (2), 75-82 (2004).
  20. Fossmark, R., et al. Ultrastructure and chromogranin A immunogold labelling of ECL cell carcinoids. APMIS. 113 (7-8), 506-512 (2005).
  21. Page, L. J., et al. Secretion of amyloidogenic gelsolin progressively compromises protein homeostasis leading to the intracellular aggregation of proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (27), 11125-11130 (2009).
  22. Vainer, B., Sørensen, S., Nielsen, O. H., Horn, T. Subcellular localization of intercellular adhesion molecule-1 in colonic mucosa in ulcerative colitis. Ultrastruct Pathol. 26 (2), 113-121 (2002).
  23. Cheng, X. T., et al. Revisiting LAMP1 as a marker for degradative autophagy-lysosomal organelles in the nervous system. Autophagy. 14 (8), 1472-1474 (2018).
  24. Karreman, M. A., van Donselaar, E. G., Gerritsen, H. C., Verrips, C. T., Verkleij, A. J. VIS2FIX: a high-speed fixation method for immuno-electron microscopy. Traffic. 12 (7), 806-814 (2011).
  25. Wang, X. B., et al. Mechanistic Insights into salidroside's mitochondrial protection via AMPK/Sirt1/HIF-1α pathway in hypoxic HT22 Cells. J Vis Exp. (218), e66923(2025).
  26. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  27. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Liberaci n de citocromo Clocalizaci n proteicaisquemia cerebralv a de la apoptosismarcaje con inmunoroapoptosis neuronalpermeabilidad mitocondrialmodelo de rata
Video próximamente

Artículos relacionados