Determinación estructural de hemaglutinina con resolución subnanométrica a partir de tomografía crioelectrónica de virus de influenza

Resumen

Este artículo presenta un protocolo para el procesamiento de datos de virus de influenza obtenidos mediante tomografía crioelectrónica y posterior subtomograma de promedio de la glicoproteína hemaglutinina. Este protocolo cubre el procesamiento de datos paso a paso, desde el preprocesamiento de imágenes hasta el refinamiento del modelo final.

Resumen

La tomografía crioelectrónica es una herramienta poderosa para visualizar muestras heterogéneas, con una aplicación importante que es la caracterización estructural de virus pleomórficos. En los últimos años, el promedio de subtomogramas de glicoproteínas virales ha surgido como un método para visualizar directamente estas proteínas cruciales en la superficie de viriones intactos. Un objetivo importante es la glicoproteína hemaglutinina (HA) del virus de la influenza, que cubre densamente la envoltura viral y es responsable de la unión al receptor de la influenza y la fusión de la membrana. Si bien se han informado promedios de subtomogramas de HA de influenza, sus resoluciones han sido limitadas debido a la baja relación señal-ruido inherente a la crioET, así como al esfuerzo manual requerido para analizar viriones heterogéneos de influenza. Aquí se presenta una línea de análisis crioET que integra varios paquetes de software para analizar datos tomográficos de viriones de influenza de manera eficiente y robusta. Este protocolo describe la determinación estructural de HA a partir de viriones de influenza, a través de pasos desde la corrección de movimiento inicial hasta la construcción del modelo final. Después de esta tubería, se obtuvo una reconstrucción de HA con una resolución de 6.0 Å a partir de dos conjuntos de datos de crioET recopilados de la cepa de influenza A/Puerto Rico/8/34 (PR8).

Introducción

La criotomografía electrónica (crioET) se ha aplicado en las últimas décadas para capturar instantáneas de complejos de proteínas, virus, células y organismos. Una modalidad de criomicroscopía electrónica (cryoEM), cryoET es un método de biología estructural en el que una muestra biológica se congela rápidamente y luego se obtienen imágenes a través de una variedad de orientaciones a través de la inclinación ^1,2,3. Las imágenes tomadas en cada orientación se alinean computacionalmente con su eje de inclinación común y se reconstruyen en un to....

Protocolo

NOTA: Se puede acceder a los conjuntos de datos de muestra utilizados para este protocolo en EMPIAR-12864, que incluye los dos conjuntos de series de inclinación utilizados para este protocolo. Las series de inclinación se recogen de rejillas sumergidas manualmente del virus de la gripe A purificado con un tamaño de píxel físico de 2,09 Å/píxel para garantizar un campo de visión lo suficientemente grande como para que cada serie de inclinación contenga varios viriones, y también para ofrecer las reconstrucciones de mayor resolución posibles. Para los conjuntos de datos propios de los usuarios, se recomienda iniciar el flujo de trabajo....

Resultados

Para demostrar la utilización de este protocolo de procesamiento (Figura 1), el flujo de trabajo descrito anteriormente se aplicó a dos conjuntos de datos de 25 tomogramas combinados, obtenidos de una cepa del virus de la influenza A H1N1 (A/Puerto Rico/8/1934). Los parámetros de recopilación de datos se describen en la Tabla 1. La Figura 2 ilustra un tomograma representativo y vistas ampliadas de los viriones d.......

Discusión

Una mejor comprensión estructural de las proteínas virales críticas puede acelerar el descubrimiento de nuevos tratamientos contra estos virus. En la última década, la revolución de la resolución ha acelerado la determinación de estructuras virales de alta resolución utilizando crioEM de una sola partícula, pero este método se limita a proteínas purificadas o virus sin envoltura con simetría icosaédrica. Por el contrario, la crioET es capaz de visualizar viriones membranosos morfológicam.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
AMD Ryzen Threadripper PRO 5965WX	AMD	https://www.amd.com/en/support/downloads/drivers.html/processors/ryzen-threadripper-pro/ryzen-threadripper-pro-5000wx-series/amd-ryzen-threadripper-pro-5965wx.html
AreTomo 1.3.4	UC San Francisco	https://drive.google.com/drive/folders/1Z7pKVEdgMoNaUmd_cOFhlt-QCcfcwF3_
EMAN2 2.99.52	Facultad de Medicina Baylor	https://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
IMOD 4.12.27	Universidad de Colorado en Boulder	https://bio3d.colorado.edu/imod/
Guiones de análisis de gripe	Escuela de Medicina UMass Chan	https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis
IsoNet 0.3	UCLA	https://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNet
M 2.0.0	Genentech	https://warpem.github.io/warp/home/m/
NVIDIA A4000	NVIDIA	https://www.nvidia.com/en-us/products/workstations/rtx-a4000/
Open3D	Intel Labs	https://www.open3d.org/
PHENIX 1.21-5207	Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley	phenix-online.org
RELION 4.0	Laboratorio de Biología Molecular del MRC	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/
Ubuntu 20.04	Ubuntu	https://releases.ubuntu.com/focal/
UCSF ChimeraX 1.6.1	UC San Francisco	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/
Warp 2.0.0	Genentech	http://warpem.github.io/warp/