Determinación estructural de hemaglutinina con resolución subnanométrica a partir de tomografía crioelectrónica de virus de influenza

La criotomografía electrónica (crioET) se ha aplicado en las últimas décadas para capturar instantáneas de complejos de proteínas, virus, células y organismos. Una modalidad de criomicroscopía electrónica (cryoEM), cryoET es un método de biología estructural en el que una muestra biológica se congela rápidamente y luego se obtienen imágenes a través de una variedad de orientaciones a través de la inclinación ^1,2,3. Las imágenes tomadas en cada orientación se alinean computacionalmente con su eje de inclinación común y se reconstruyen en un tomograma para proporcionar una vista tridimensional⁴.

Mientras que la cristalografía de rayos X y la crioEM de una sola partícula exigen moléculas purificadas y estructuralmente homogéneas, la crioET puede obtener imágenes de una molécula directamente dentro de su contexto nativo⁴. Por lo tanto, una de las principales ventajas de la crioET es su capacidad para visualizar muestras pleomórficas, como los virus membranosos, incluida la gripe ^5,6,7. Otra promesa de la crioET es su capacidad para obtener imágenes a través de escalas. Si bien los tomogramas no se resuelven típicamente más allá de 5-10 nm⁸, la integración del promedio del subtomograma, donde se identifican, alinean y promedian las copias de la misma partícula, puede dar como resultado una resolución casi atómica en algunas moléculas biológicas como los ribosomas ^9,10. Sin embargo, solo tipos limitados de moléculas pueden alcanzar esta resolución; los promedios de subtomograma no suelen superar los 10-15 Å de resolución. Por el contrario, la crioEM de una sola partícula alcanza rutinariamente resoluciones de 3-4 Å después de la revolución de la resolución¹¹. Los avances recientes tanto en el mayor rendimiento del software de adquisición y análisis de datos crioET han permitido la determinación de la estructura de resolución subnanométrica de moléculas biológicas adicionales dentro de su contexto nativo 12,13,14,15,16,17,18.

Un uso común de la crioET es visualizar la morfología, organización y estructura del virus. A pesar de la menor resolución que ofrece esta técnica en comparación con la crioEM de una sola partícula o la cristalografía de rayos X, la crioET combinada con el promedio del subtomograma puede proporcionar información sobre cómo se comportan las proteínas virales en su entorno nativo y proporcionar detalles cruciales sobre su organización en el contexto del virión. Un objetivo común para la crioET de virus son las glicoproteínas de superficie que se usan comúnmente para la unión y fusión de la célula huésped, ya que a menudo son los principales antígenos y objetivos para terapias o vacunas. Con los avances recientes en los paquetes de procesamiento de crioET, se ha vuelto cada vez más factible lograr promedios de resolución subnanométrica de estas glicoproteínas 19,20,21,22. Un ejemplo de ello es la hemaglutinina (HA), la principal proteína en la superficie de los viriones de la influenza. Esta proteína no solo realiza tanto la unión al receptor como la fusión de la membrana, sino que también cubre el virión de una manera increíblemente densa, con cientos o miles de HA en un virión⁵ singular. El protocolo presentado aquí (Figura 1) integra varios paquetes de uso común con scripts internos para delinear etapas desde el preprocesamiento hasta el refinamiento del modelo para un promedio de subtomograma de HA de influenza.

NOTA: Se puede acceder a los conjuntos de datos de muestra utilizados para este protocolo en EMPIAR-12864, que incluye los dos conjuntos de series de inclinación utilizados para este protocolo. Las series de inclinación se recogen de rejillas sumergidas manualmente del virus de la gripe A purificado con un tamaño de píxel físico de 2,09 Å/píxel para garantizar un campo de visión lo suficientemente grande como para que cada serie de inclinación contenga varios viriones, y también para ofrecer las reconstrucciones de mayor resolución posibles. Para los conjuntos de datos propios de los usuarios, se recomienda iniciar el flujo de trabajo con películas de inclinación sin procesar. Estos conjuntos de datos se procesaron y visualizaron utilizando estaciones de trabajo de alto rendimiento. La tabla de materiales enumera el hardware y el software utilizados para este protocolo. Todos los paquetes de software utilizados en este protocolo son de código abierto y están disponibles para su descarga; los enlaces de instalación y las instrucciones se enumeran en la Tabla de materiales. La estación de trabajo recomendada para procesar conjuntos de datos crioET debe estar equipada con al menos un procesador de 8 núcleos, una tarjeta GPU dedicada con 6 GB de VRAM, 64 GB de RAM y 2 TB de almacenamiento local.

1. Preprocesamiento de datos de películas de inclinación y reconstrucción de tomogramas crioelectrónicos en Warp ²³ e IMOD ²⁴

1. En un terminal, active un entorno de Conda que tenga Warp instalado mediante el siguiente comando:
   conda activate warp_environment
2. Cree un archivo de configuración de serie de fotogramas para procesar series de fotogramas. Este es un archivo de configuración que contiene metadatos sobre el microscopio, la ubicación de los datos a procesar y dónde almacenar los archivos de salida.
   WarpTools create_settings --folder_data path/to/.tif --folder_processing warp_frameseries --output warp_frameseries.settings --extension “*.tif” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07
   NOTA: Estos datos se recopilaron en modo de superresolución.
3. Realice la estimación de la función de transferencia de contraste (CTF) y la corrección de movimiento.
   WarpTools fs_motion_and_ctf --settings warp_frameseries.settings --m_grid 1x1x5 --c_grid 2x2x1 --c_range_max 7 --c_defocus_max 10 --c_defocus_min 4 --c_use_sum --out_averages
   NOTA: m_grid parámetro debe corresponder al número de subfotogramas dentro de una película de inclinación: nuestros conjuntos de datos constaban de 5 subfotogramas por película de inclinación.
4. Importe metadatos de series de inclinación para que WarpTools pueda identificar qué películas pertenecen a qué serie de inclinación.
   WarpTools ts_import --mdocs path/to/.mdoc --frameseries /path/to/frameseries --tilt_exposure 3.07 --min_intensity 0.3 --output tomostar
5. Una vez rellenada la carpeta tomostar, cree un archivo de configuración de la serie de inclinación para el procesamiento de la serie de inclinación
   WarpTools create_settings --folder_data tomostar --folder_processing warp_tiltseries --output warp_tiltseries.settings --extension “*.tomostar” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07 --tomo_dimensions NxNxN
6. Escriba pilas de inclinación y realice una alineación automatizada de series de inclinación basadas en fiduciales utilizando el programa batchruntomo de IMOD utilizando la GUI²⁴ de Etomo.
   1. Ejecute el siguiente comando en la terminal:
      Warptools ts_stack --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35
      NOTA: Las series de inclinación se exportaron a 4 veces el tamaño de píxel físico para reducir el tiempo de alineación y los recursos computacionales.
   2. Elija un conjunto de datos de ejemplo para establecer primero los parámetros de alineación antes de aplicarlos como plantilla para batchruntomo.
   3. Importe los parámetros de alineación de IMOD si usa batchruntomo.
      WarpTools ts_import_alignments --settings warp_tiltseries.settings --alignments warp_tiltseries/tiltstack/ --alignment_angpix 8.35
      NOTA: Para este conjunto de datos, el uso de la GUI de Etomo produjo mejores resultados que los envoltorios dentro de WarpTools.
   4. Alternativamente, realice una alineación automatizada de series de inclinación sin fiduciales utilizando la envoltura AreTomo²⁵ dentro de WarpTools.
      WarpTools ts_aretomo --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35 --alignz 1000 --axis_iter 3 --exe AreTomo_executive
      NOTA: La envoltura AreTomo se probó con AreTomo1.3.4.
7. Ejecute el siguiente comando en el terminal para estimar los parámetros CTF para la serie de inclinación:
   WarpTools ts_ctf --settings warp_tiltseries.settings --range_high 7 --defocus_min 2 --defocus_max 10 --auto_hand 4
8. Reconstruya tomogramas usando WarpTools.
   1. Establecer variable de entorno:
      export WARP_FORCE_MRC_FLOAT32=1
      NOTA: Este paso garantiza que los tomogramas sean compatibles con las etapas posteriores de procesamiento y visualización de imágenes en otros softwares utilizados en este protocolo.
   2. Para reconstruir tomogramas, ejecute en un terminal: WarpTools ts_reconstruct --settings  warp_tiltseries.settings --input_data input file names --angpix 8.35 --dont_invert
9. Repita los pasos 1.2 a 1.8.2 para todos los conjuntos de datos.

2. Preprocesamiento de tomogramas y selección de partículas

1. En un terminal, active un entorno de conda con IsoNet²⁶ instalado.
   conda activate isonet_env
2. Prepárese para el procesamiento de tomogramas creando primero una subcarpeta y moviendo todos los tomogramas a esa carpeta.
   mkdir tomo_folder
mv tomograms*.mrc tomo_folder/
3. Genere un archivo de estrella en la carpeta del proyecto.
   isonet.py prepare_star tomo_folder --output_star tomograms.star --pixel_size 8.35
4. Con un editor de texto, abra el archivo de estrella generado e introduzca el valor aproximado de desenfoque para las imágenes de inclinación de 0 grados en la cuarta columna (_rlnDefocus) para cada tomograma, que se puede encontrar en el archivo processed_items.json de la carpeta warp_tiltseries.
   NOTA: El valor de desenfoque debe estar en angstroms para IsoNet. Warp escribe los valores de desenfoque en μm, lo que requiere un factor de multiplicación de 10.000.
5. Ejecute el comando CTF deconvolve en el terminal.
   isonet.py deconv tomograms.star --snrfalloff 0.7 --deconv_folder deconvolve
6. Después de la desconvolucionación, inicie EMAN2 GUI²⁷ para comenzar a preprocesar tomogramas para la selección de partículas.
   conda activate eman_env
e2projectmanager.py
7. En Tomografía, haga clic con el botón izquierdo en la flecha junto a Datos sin procesar y seleccione Importar tomogramas en el menú desplegable.
8. Haga clic con el botón izquierdo en la flecha adyacente a Segmentación y seleccione Preprocesar tomogramas.
   NOTA: Es probable que los parámetros predeterminados sean adecuados para muchos conjuntos de datos. Para estos tomogramas, se aplicó un filtro de paso bajo a 4 Å y se normalizaron las imágenes de inclinación. Después del preprocesamiento, EMAN2 generará automáticamente un directorio de información con archivos .json en blanco (con nombres base similares a los archivos preprocesados). El angpix debe agregarse a los archivos json antes de la selección de partículas.
9. Entrene la red neuronal convolucional (CNN) para reconocer la glicoproteína HA.
   1. Cambie el directorio de trabajo a la ubicación de los tomogramas que se utilizarán para el entrenamiento de CNN y la selección de partículas:
      cd path/to/tomograms
   2. Utilice el terminal para abrir la ventana de entrenamiento de CNN.
      e2spt_boxer_convnet.py --label label_name
   3. Confirme que hay cuatro ventanas abiertas: una que contiene la información sobre los parámetros y tomogramas de CNN en el directorio, y las otras tres ventanas que contienen imágenes de buenas referencias (Positivas), malas referencias (Negativas) y partículas seleccionadas por la CNN (Partículas).
   4. Haga clic con el botón izquierdo en el botón Nuevo en la GUI de CNN para inicializar una nueva CNN. Establezca la tasa de aprendizaje predeterminada en 0.0001 y el tamaño del cuadro en 8.
   5. En la columna FileName , haga clic con el botón izquierdo en un tomograma representativo para abrirlo en una nueva ventana.
      NOTA: Solo se puede abrir una tomografía a la vez.
      1. Para desplazarse por el eje z de un tomograma, coloque el cursor sobre el tomograma abierto y pulse la rueda de desplazamiento del ratón del ordenador para abrir una nueva ventana. El control deslizante etiquetado como N# cambiará el eje z.
   6. En el tomograma abierto, seleccione 10-20 características correspondientes a HA usando el botón izquierdo del mouse en el panel Positivo.
      NOTA: Seleccione las vistas superior y lateral de HA, que aparecen como cilindros o triángulos sobre la membrana, como buenas referencias para una red más robusta.
      1. Las imágenes de referencias positivas aparecerán en la ventana Positivo . Para eliminar una referencia, mantenga presionada la tecla Mayús y haga clic con el botón izquierdo en una imagen de referencia.
   7. Cambie al panel Negativo y seleccione de 10 a 20 referencias correspondientes a características como parches de membrana vacíos, densidad de vRNP, marcadores fiduciales y desechos.
      NOTA: Las referencias aparecerán en la ventana Negativo .
   8. Inicie el entrenamiento de CNN haciendo clic con el botón izquierdo en el botón Entrenar en la ventana principal.
      NOTA: El número de iteraciones (Niter) en la ventana principal cambia la cantidad de iteraciones de entrenamiento que experimenta la CNN. Se recomienda establecer el parámetro en 50.
   9. Una vez que la CNN se haya entrenado en las referencias seleccionadas, haga clic con el botón izquierdo en Aplicar para usar la CNN para seleccionar partículas en el tomograma abierto.
      NOTA: Las imágenes de las partículas seleccionadas se pueden ver en la ventana Partículas. Las partículas seleccionadas también se mostrarán en el tomograma en círculos azules.
   10. Continúe seleccionando referencias positivas y negativas en función de la red aplicada, guardando periódicamente el progreso a través del botón Guardar .
   11. Una vez satisfactorio, seleccione Aplicar todo para que la CNN seleccione partículas en todos los tomogramas del directorio y evalúe los resultados en varios tomogramas; Realice capacitación adicional según sea necesario.
10. Guarde las coordenadas en un archivo de texto para cada tomograma.
    1. Abra la GUI de EMAN2 usando el e2projectmanager.py comando.
    2. Haga clic en la flecha junto a Promedio de subtomograma y haga clic en Boxing manual.
    3. Introduzca el nombre de un tomograma y haga clic en Iniciar.
    4. Guarde las coordenadas en el archivo de texto seleccionando Archivo > Guardar > tomogram_ha.txt Coord de caja.
    5. Vaya a la subcarpeta neuralnets y a la subcarpeta info para realizar una copia de seguridad de nnet_save.hdf, trainouts.hdf, segouts.hdf y boxes3dref.hdf.
11. Para garantizar que el análisis solo se realice en viriones completamente ensamblados donde la presencia de la capa de proteína de la matriz (M1) y el complejo de ribonucleoproteína viral (vRNP) es evidente, entrene una segunda red neuronal convolucional para reconocer la proteína M1.
    1. Siga el mismo protocolo que se describe en el paso 2.9, cambiando el tamaño del cuadro de entrenamiento de 8 a 14.

3. Curación de partículas

1. Descargue cuadernos de https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis.
2. Abra el cuaderno CNN_Particle_Cleaning.ipynb y cargue los módulos necesarios.
   NOTA: El script utiliza Open3D²⁸ como un paquete para visualizar las coordenadas de partículas como nubes de puntos 3D.
3. Cargue archivos de texto correspondientes a coordenadas HA y M1 y visualícelos como nubes de puntos 3D utilizando el paquete Open3D.
4. Filtre los valores atípicos de coordenadas de alta disponibilidad mediante la eliminación estadística de valores atípicos tal como se implementa en Open3D.
   NOTA: Los valores iniciales sugeridos para HA son nb_neighbors = 50 (número de coordenadas vecinas alrededor de una coordenada) y std_ratio = 0,5.
5. Calcule la distancia entre las nubes de puntos HA y M1. Todas las coordenadas de alta disponibilidad a más de 20 píxeles de distancia de la nube de puntos M1 se identificarán como un valor atípico. Todas las coordenadas de partículas no identificadas como valores atípicos se guardarán en un archivo de .txt de salida.
   NOTA: 20 píxeles corresponden a una distancia aproximada de 16 nm con un tamaño de píxel de 8,35 Å/píxel. El centro de un trímero de HA a la capa M1 es de aproximadamente 15 nm en nuestros tomogramas.
6. Concatene todas las partículas y guárdelas como archivos estrella usando pts2starfile.ipynb.

4. Promedio y clasificación del subtomograma iterativo

1. Usando WarpTools, extraiga partículas con un factor de agrupación de 4 y realice rondas iniciales de subtomograma promediando en RELION4²⁹.
   WarpTools ts_export_particles --settings warp_tiltseries.setting --input_star pts2star.star --coords_angpix 8.35 --output_star bin4_export.star --output_angpix 8.35 --box 48 --diameter 140 --3d
   NOTA: El tamaño de caja sugerido de 48 x 48 x 48 píxeles, correspondiente a una caja de ~360 ųque sería lo suficientemente grande como para contener una matriz de 7-8 HA.
   1. Convertir warp starfile a un archivo compatible con RELION 4
      relion_convert_star --i bin4_export.star --o bin4_conv.star
   2. Genere una referencia inicial utilizando relion_refine_mpi en un subconjunto de partículas.
      head -n 30 bin4_conv.star >> subset.star & tail -n +31 bin4_conv.star | shuf -n 2000 >> subset.star
mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o init_ref/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i subset.star --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 300 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 14 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control init_ref/job001
   3. Utilice relion_refine_mpi para realizar el refinamiento automático 3D en los subtomogramas.
      1. Comando de ejemplo: mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o Refine3D/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i bin4_conv.star --ref init_ref/job001/run_class001.mrc --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 400 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 16 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control Refine3D/job001
         NOTA: El muestreo global y local inicial se estableció en 7.5 y 1.8 grados, lo que corresponde a un orden healpix de 4 y healpix local de 2. Los refinamientos iniciales aprovechan principalmente la fuerte densidad de la membrana, la proteína M1 y la matriz de HA. Se permite que el rango de desplazamiento de traslación sea mayor para abarcar cualquier cambio que pueda ocurrir al alinear la matriz.
   4. Repita el refinamiento después de que converja la primera ejecución de refinamiento, cambiando la traslación a 8 y el paso a 2.
2. Aproveche la clasificación 2D para descartar partículas basura utilizando relion_refine.
   1. Comando de ejemplo: relion_refine --o Class2D/job003/run --grad --class_inactivity_threshold 0.1 --grad_write_iter 200 --iter 200 --i Refine3D/job002/run_data.star --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --tau2_fudge 2 --particle_diameter 300 --K 20 --flatten_solvent --zero_mask -- strict_highres_exp 14 --center_classes --oversampling 1 --norm --scale --j 24 --skip_align --pipeline_control Class2D/job002.
      NOTA: Se utilizó la clasificación 2D en lugar de la clasificación 3D, ya que es más eficiente desde el punto de vista computacional. Los subtomogramas se pueden utilizar directamente como entrada para el trabajo de clasificación 2D sin procesamiento de imágenes adicional.
   2. Combine clases que contengan una matriz de alta disponibilidad identificable que contenga alta disponibilidad cilíndrica, membrana y densidad M1 mediante relion_star_handler.
   3. Primero, cree archivos de estrella que contengan buenas clases.
      relion_star_handler --i input_file2.star --o output_good_class.star --select rlnClassNumber --minval goodclassnumber -maxval goodclassnumber
   4. A continuación, utilice el siguiente comando relion_star_handler para combinar los archivos de estrella individuales.
      relion_star_handler --i "output_good_class1.star output_good_class2.star … output_good_classn.star" --o bin4_keep.star --combine
3. Vuelva a extraer en bin2 y partículas no agrupadas para un refinamiento local iterativo.
   1. Para el refinamiento bin2, extraiga partículas utilizando un tamaño de caja más pequeño de 80 y realice una búsqueda local con healpix y healpix local establecidos en 4 (muestreo angular local de 1,8 grados).
   2. En esta etapa, combine conjuntos de partículas de diferentes conjuntos de datos utilizando relion_star_handler.
      relion_star_handler --i input_file.star --o output_file.star --combine
   3. Después de la primera ronda de refinamiento, cree una máscara cilíndrica utilizando e2filtertool.py dentro del entorno EMAN2 que abarque el HA central más la membrana y la densidad M1.
      NOTA: Parámetros utilizados para la máscara cilíndrica: cx=24, cy=24, outer_radius=8, zmax=40, zmin=12; todos los demás parámetros están desmarcados.
   4. Realice una ronda adicional de refinamiento con la máscara aplicada.
   5. Realice otra ronda de clasificación 2D para eliminar los valores atípicos que no se alinean con el HA central y los desechos adicionales.
   6. Repita el proceso con partículas no agrupadas con un tamaño de caja de 120 y cree una máscara suave que cubra el AH central, alinee la referencia a la simetría C3 y aplique simetría en esta etapa de refinamiento.
      relion_image_handler --i bin1_ref.mrc --o bin1_c3.mrc --sym c3
      NOTA: La resolución final lograda con RELION fue de 6,1 Å.
4. Refinamiento final en MTools⁹
   1. Crear un polígono de refinamiento (después de la activación del entorno de conda de deformación).
      MTools create_population --directory refine_m --name ha_final
   2. Agregue fuentes de datos para cada conjunto de datos.
      MTools create_source --name source_1 --population refine_m/ha_final.population --processing_settings warp_tiltseries.settings
      1. Repita el paso anterior con conjuntos de datos adicionales.
   3. Crea las especies de refinamiento.
      MTools create_species --population refine_m/ha_final.population --name ha_todaysdate --diameter 160 --sym c3 --temporal_samples 1 --half1 last_relion_refine/run_half1_class001_unfil.mrc --half2 last_relion_refine/run_half2_class001_unfil.mrc --particles_relion last_relion_refine/run_data.star --mask mask.mrc
   4. Refinamiento de múltiples partículas.
      1. Primero refine las poses de partículas con el comando: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles
      2. Posteriormente, refine tanto las poses de partículas como la aberración esférica con el comando: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles --ctf_cs
         NOTA: El refinamiento se detuvo aquí ya que las iteraciones posteriores no mejoraron la resolución. Sin embargo, las diferentes combinaciones de parámetros que no se probaron exhaustivamente pueden continuar mejorando los resultados.

5. Refinamiento del modelo

1. Usando ChimeraX³⁰, cargue el mapa final y un modelo atómico de HA.
2. Asigne segmentos y combine todos los segmentos que correspondan al ectodominio de alta disponibilidad, y utilice la herramienta Ajustar a segmentos para acoplar en el modelo de alta disponibilidad.
   1. Guarde las coordenadas transformadas del modelo.
3. Abra la GUI³¹ de Phenix y use la herramienta Refinamiento de espacio real .
   1. Cuando se le pida que agregue archivos, agregue el modelo de alta disponibilidad transformado y el mapa, y rellene la resolución de la reconstrucción final.
   2. Realice cinco rondas de minimización global, ajuste de rotámeros locales, refinamiento de ocupación y refinamiento de ADP grupal.
4. Visualice la reconstrucción final y el modelo con ChimeraX.

Para demostrar la utilización de este protocolo de procesamiento (Figura 1), el flujo de trabajo descrito anteriormente se aplicó a dos conjuntos de datos de 25 tomogramas combinados, obtenidos de una cepa del virus de la influenza A H1N1 (A/Puerto Rico/8/1934). Los parámetros de recopilación de datos se describen en la Tabla 1. La Figura 2 ilustra un tomograma representativo y vistas ampliadas de los viriones de la influenza pleomórfica. En este tomograma se capturan morfologías variadas, ya que los viriones varían de forma esférica a ovalada/alargada. Si bien la mayoría de las partículas de influenza contienen ensamblajes M1 y vRNP bien organizados, algunos viriones parecen estar más desorganizados y carecen de componentes estructurales cruciales.

A partir de este conjunto de datos, se utilizó un conjunto inicial de 40.995 subtomogramas para la reconstrucción bin4 (8,35 Å/pix) después de la selección y curación de partículas. Los dos conjuntos de datos se procesaron inicialmente de forma independiente en RELION4 con simetría C1 y una amplia máscara esférica que abarcaba la matriz general de alta disponibilidad. Se realizaron tres ciclos de refinamiento para estos subtomogramas, seguidos de una clasificación 2D. Después de la clasificación, se descartaron subtomogramas mal resueltos y partículas basura; los subtomogramas restantes se extrajeron en bin2 (4,17 Å/pix) y se combinaron los dos conjuntos de datos. Los subtomogramas Bin2 se alinearon primero en una ronda de promedio de subtomograma, luego se aplicó una máscara cilíndrica alrededor del HA central para enfocar la alineación. En esta etapa, la simetría trimérica se puede visualizar claramente para la reconstrucción de HA. Se llevaron a cabo rondas adicionales de refinamiento en bin2 y a 2,8 Å/pix. Se realizó una última ronda de clasificación 2D con una pequeña máscara que cubría solo el trímero central de HA con subtomogramas alineados. La clase principal, que consta de ~ 94% de los subtomogramas restantes, se extrajo a partículas no agrupadas y se sometió a refinamiento 3D con simetría C3 aplicada. Por último, estos subtomogramas se exportaron a M, donde se llevaron a cabo las poses de las partículas y los ciclos de refinamiento de la aberración esférica (Figura complementaria 1).

El promedio final del subtomograma (Figura 3A), que consta de 15.970 partículas de HA, alcanzó una resolución global de 6,0 Å y un rango de resolución local de 5-7 Å (Figura 4). Un modelo de PR8 HA se refinó de manera flexible en la densidad; en FSC=0.5 y FSC=0.143, la resolución del mapa al modelo fue de 8.1 Å y 6.6 Å, respectivamente. La arquitectura de la reconstrucción de HA se parecía mucho a los mapas crioEM y crioET anteriores. A esta resolución, se pueden distinguir las hélices alfa y las láminas beta (Figura 3B); además, los glicanos pueden comenzar a identificarse en cuatro sitios de glicosilación en la cabeza y el tallo del HA (Figura 3C).

Nuestros resultados muestran la idoneidad de la crioET en la reconstrucción de HA a partir de viriones de influenza nativa. A través del protocolo, se observó una densidad clara para la glicoproteína cilíndrica perpendicular a la membrana viral y la resolución mejoró en cada paso. Para los propios datos, se sugiere que el promedio del subtomograma comience desde una pila de partículas agrupadas, y los resultados deben monitorearse de cerca en cada ciclo de refinamiento. Si la densidad de la glicoproteína no es evidente desde las etapas iniciales, se recomienda mapear las ubicaciones del subtomograma en el tomograma para verificar el posicionamiento preciso. De lo contrario, se pueden ajustar los parámetros de alineación o implementar etapas de clasificación adicionales para lograr resultados óptimos.

Figura 1: Pipeline general para el promedio de subtomograma de HA de crioET del virus de la influenza. El panel superior representa un flujo de trabajo de resumen para los dos conjuntos de datos utilizados para demostrar el protocolo. El segundo panel corresponde a la Sección 1 del protocolo, el tercer panel corresponde a las Secciones 2 y 3 y el cuarto panel corresponde a las Secciones 4 y 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Tomografía representativa del virus de la influenza PR8. (A) Corte a través del tomograma reconstruido. La barra de escala es de 100 nm. (D-C) Vista ampliada del virión PR8 (B) esférico, (C) cilíndrico, (D) sin M1. Todas las barras de escala en B-D corresponden a 50 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Promedio del subtomograma de PR8 HA. (A) Vista superior y lateral de la reconstrucción de HA en dos niveles de contorno ajustados de manera flexible con una estructura crioEM de una sola partícula PR8 HA. (B) Vistas recortadas a través de la reconstrucción de HA. Las flechas de colores corresponden a cuadros de colores. (C) Reconstrucción de HA mostrada en el contorno inferior para revelar la densidad de glicanos. También se muestran vistas de cerca de los glicanos en la representación de la barra en el mapa crioET. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Estimación de la resolución del promedio del subtomograma de HA. (A) Estimación de la resolución local del promedio del subtomograma de HA mapeado en la reconstrucción. La barra de color representa 5-7 Å en la paleta azul-blanco-rojo. (B) Curvas FSC de semimapas y de resolución de mapa a modelo. La curva azul es de la reconstrucción desenmascarada, y la roja es de la enmascarada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Parámetros de recopilación de datos para conjuntos de datos crioET del virus de la influenza PR8.

Figura complementaria 1: Flujo de trabajo de promedio de subtomograma para HA. La alineación, el promedio y la clasificación iterativos se llevan a cabo para los subtomogramas de HA a través de la eliminación gradual de binning. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen nada que revelar.