Artículo de método

Un método mínimamente invasivo para generar un modelo de ratón ortotópico singénico de cáncer de pulmón

DOI:

10.3791/68676

⸱

19 de agosto de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa Health Care, 2Department of Neuroscience and Pharmacology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Department of Radiation Oncology, Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 4Free Radical Radiation Biology Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Geminii, Inc., 6Interdisciplinary Graduate Program in Molecular Medicine, Carver College of Medicine, University of Iowa, 7Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa Health Care

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un desafío importante del desarrollo de nuevas terapias para el cáncer de pulmón incluye el modelado del microambiente tumoral a medida que la enfermedad regional progresa a la enfermedad metastásica. Aquí, describimos un método simple para establecer un modelo singénico ortotópico de cáncer de pulmón que permite el seguimiento in vivo de la enfermedad a lo largo del tiempo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) sigue siendo la causa número uno de muerte relacionada con el cáncer tanto para mujeres como para hombres en todo el mundo. Es necesario recopilar más información para comprender las interacciones entre las células cancerosas, el sistema inmunitario, el microambiente dentro de cada tumor y el tejido huésped para desarrollar modalidades de tratamiento más efectivas. Aquí se informa un método simple y repetible para inducir cáncer dentro del pulmón del ratón, lo que permite monitorear el crecimiento tumoral desde la enfermedad en etapa temprana hasta la tardía. El procedimiento quirúrgico implica una pequeña incisión superficial en la piel y una inyección de células cancerosas a través de los músculos intercostales en el pulmón. Los sistemas de imágenes in vivo (IVIS) en combinación con células diseñadas para expresar luciferasa proporcionan una forma conveniente de evaluar el crecimiento tumoral y la progresión de la enfermedad en el transcurso de un estudio. Esta técnica es fácilmente transferible a través de varios modelos de cáncer de pulmón y se puede utilizar para probar la viabilidad y eficacia de nuevas terapias en un modelo preclínico de cáncer de pulmón que imita el microambiente tumoral natural. Esto amplía la relevancia de los estudios de eficacia y seguridad/toxicidad que utilizan tratamientos estándar, incluida la resección quirúrgica, la radiación y las inmunoterapias junto con terapias experimentales.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El cáncer de pulmón sigue siendo uno de los cánceres más diagnosticados y la principal causa de muerte relacionada con el cáncer entre hombres y mujeres en todo el mundo 1,2,3. El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPNM) representa casi el 90% de todos los casos de cáncer de pulmón en los Estados Unidos, y aunque el panorama del tratamiento ha mejorado mucho en los últimos años, sigue habiendo mucho interés en desarrollar nuevas terapias que mejoren los resultados4. Si bien ha habido muchos avances en el desarrollo de terapias dirigidas para mutaciones impulsoras específicas e inmunoterapias para subtipos de NSCLC sensibles, la tasa de supervivencia general a cinco años sigue siendo baja, ubicándose alrededor del 20% para todas las etapas del cáncer de pulmón 2,5,6,7. Además, aunque la inmunoterapia ha logrado grandes avances en la mejora de la supervivencia en la enfermedad avanzada, estas mejoras solo han movido la aguja de una supervivencia general a cinco años del 6,8% al 10,7% y han aumentado el tiempo de supervivencia de 7 meses a 8 meses8. Todavía existe una gran necesidad de comprender los mecanismos de acción de la enfermedad y desarrollar nuevas terapias que sinergicen con las terapias estándar actuales. Comprender los mecanismos en juego de la progresión natural del NSCLC y la respuesta a las nuevas terapias requiere modelos preclínicos que sean reproducibles de manera confiable, fáciles de inducir y encapsulen el microambiente tumoral dentro del cual se desarrolla el cáncer.

En las últimas décadas, se han desarrollado muchos procedimientos diferentes para evaluar modelos ortotópicos de cáncer de pulmón en roedores. Los procedimientos van desde muy invasivos, que requieren un alto nivel de experiencia, como la implantación intrapulmonar o los procedimientos de trasplante que abren la cavidad torácica 9,10,11,12,13; moderadamente invasivos como los procedimientos intratraqueales y orotraqueales 14,15,16,17; hasta procedimientos mínimamente invasivos, como inyecciones percutáneas, vena de la cola o inducción intranasal 18,19,20,21. Todos los procedimientos ofrecen diferentes riesgos y beneficios, con técnicas más invasivas que permiten una mayor precisión pero tasas de deserción potencialmente más altas, y técnicas menos invasivas que brindan una mejor supervivencia pero más variabilidad de los sitios de implantación del tumor. De estos diversos protocolos, algunos optan por no rastrear el crecimiento tumoral in vivo y solo completar las evaluaciones de tumores ex vivo 9,11,12,16. De los protocolos que rastrean el crecimiento tumoral a lo largo del tiempo, los protocolos anteriores se basan más en sistemas como la tomografía computarizada (TC)14,19, la tomografía por emisión de posición (PET)18 y la resonancia magnética (RM)17, mientras que los protocolos posteriores, después de que los sistemas de imágenes de bioluminiscencia (BLI) y las células modificadas genéticamente estuvieran más disponibles, optan por rastrear el crecimiento tumoral a lo largo del tiempo con BLI20, Artículo 21.

El propósito de desarrollar este protocolo fue tomar los aprendizajes de estos otros procedimientos y crear un método simple pero confiable para inducir un tumor de pulmón solitario para estudiar la progresión del NSCLC a partir de la enfermedad temprana, donde el tumor se limita al pulmón. El objetivo general de este artículo es describir los métodos para generar un modelo de ratón ortotópico singénico de cáncer de pulmón confiable y mínimamente invasivo que se pueda monitorear mediante imágenes in vivo y que pueda permitir a los investigadores estudiar el cáncer de pulmón en el órgano del que surge la enfermedad. Este método es eficaz para generar modelos de ratón ortotópico de xenoinjerto utilizando líneas celulares de cáncer de pulmón humano y modelos de ratón ortotópicos singénicos utilizando líneas celulares de cáncer de pulmón de ratón en ratones con sistemas inmunitarios intactos, lo que da versatilidad al método para estudiar tanto los tipos de cáncer humano como la compleja interacción del sistema inmunitario y el CPNM.

Nos enfocamos en optimizar este protocolo en el modelo de ratón NSCLC inmunocompetente, Lewis Lung Carcinoma (LLC), ya que este modelo permite a los investigadores comprender mejor la respuesta del sistema inmunológico con y sin terapias actuales como quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia y otras terapias dirigidas 22,23,24,25. El protocolo genera un modelo que es representativo de la enfermedad en etapa temprana en la inoculación (tumor en el parénquima pulmonar) y la metástasis hacia el final de los estudios, ya que el tumor a menudo superará el parénquima pulmonar y sembrará otros tejidos.

Un aspecto importante del estudio de modelos ortotópicos es la capacidad de rastrear el crecimiento tumoral repetidamente, con un estrés mínimo para el animal, y rápidamente para que cada animal en un estudio pueda evaluarse en un solo punto de tiempo. Si bien las técnicas de imagen como la resonancia magnética o la tomografía computarizada permiten una mejor resolución del tumor, estas modalidades de imágenes son costosas, requieren mucho tiempo y tienen dificultades para rastrear el crecimiento temprano del tumor en modelos animales pequeños como ratones 26,27,28,29,30,31. Por lo tanto, optamos por monitorear el crecimiento tumoral a través de la bioluminiscencia utilizando células cancerosas diseñadas con luciferasa. En este protocolo, inyectamos entre 25.000 y 50.000 células LLC modificadas con luciferasa de luciérnaga (LLC-luc) y detectamos tumores tan pronto como al día siguiente mediante BLI. La reacción luciferina-luciferasa es una herramienta útil para rastrear el crecimiento tumoral in vivo utilizando instrumentos de imágenes espectrales. Debido a la sensibilidad de estos sistemas de imágenes para rastrear fotones de luz, las células cancerosas que expresan luciferasa se pueden rastrear in vivo temprano, a menudo antes de que se puedan detectar tumores en un modelo de ratón mediante resonancia magnética o tomografía computarizada, y con frecuencia 26,32,33,34.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los procedimientos que involucran animales son revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Iowa. Los ratones C57BL6/N (de 4 a 6 semanas de edad) se compran y se aclimatan durante al menos 1 semana antes de las cirugías. Todos los animales están en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Los animales se alojan 4 por jaula y tienen acceso completo a comida y agua hasta el momento de la anestesia.

1. Selección y crecimiento de células para inyección

  1. Realice un ensayo de luciferasa para seleccionar una línea celular como se describe en35.
    1. Cultive células LLC-luc en el medio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, L-glutamina y penicilina/estreptomicina en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C con alta humedad. Realice el ensayo cuando las células sean 50%-100% confluentes.
    2. Antes de realizar el ensayo, lave las células con 1x PBS.
    3. Agregue 200 μL de tampón de lisis/pocillo (25 mM de Tris/fosfato, 4 mM de EGTA, 1% de Triton X-100, 10% de glicerol) en una placa de 6 pocillos. Raspe las células del pocillo y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar las células a 16.000 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Confirme que se forma un gránulo de celda compacta en la parte inferior del tubo y recoja el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga.
    4. Transfiera la mitad del extracto celular a un nuevo tubo de microcentrífuga y guárdelo para la cuantificación de proteínas. Agregue 2 mM de ditiotreitol a la mitad restante y mezcle bien.
    5. Combinar 8 μL de extracto celular que contenga 2 mM de ditiothreitol con 42 μL de tampón de ensayo (25 mM de Tris/fosfato, 20 mM de MgSO4, 4 mM de EGTA, 2 mM de ATP, 1 mM de ditiothreitol). Agregue 50 μL de luciferina 0.5-1 mM.
    6. Mida la luminiscencia máxima informada como unidades de luz relativa (RLU) y evalúe el contenido de proteína mediante un método de cuantificación de proteínas preferido para informar la luminiscencia como RLU por mg de proteína (RLU/mg).
  2. Seleccione una línea celular con luminiscencia entre 8,000-15,000 RLU/mg.
    NOTA: Evite la selección de una expresión de luciferasa más alta (>15,000 RLU/mg) ya que esto puede saturar el instrumento BLI.

2. Preparación celular

  1. Cultive células LLC-luc en DMEM suplementadas con FBS al 10%, L-glutamina y penicilina/estreptomicina en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C con alta humedad durante al menos 1 semana antes de su uso.
    NOTA: Controlar el crecimiento para limitar la confluencia al 70%-80% y dividir con tripsina-EDTA al 0,25% según sea necesario para alcanzar la cantidad deseada para las inyecciones como se describió anteriormente36.

3. Preparación prequirúrgica

  1. Para ratones con pelaje, aféitese 1 día antes de la cirugía.
  2. Coloque el ratón en una cámara de inducción para anestesiarlo con isoflurano. Ajuste el caudal de oxígeno a 2,0 L/min y el vaporizador al 2% de isoflurano; Ajuste esto según el tamaño del mouse que se induce.
  3. Supervise la respiración de los ratones y emplee un reflejo de retirada del pedal para confirmar la anestesia adecuada.
  4. Coloque el mouse en un cono nasal en posición prona en un dispositivo de calentamiento aprobado por IACUC. Verifique que el mouse esté correctamente anestesiado con el reflejo de retiro del pedal antes de continuar.
  5. Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos.
  6. Cuando el ratón esté anestesiado adecuadamente, use maquinillas eléctricas para eliminar un área rectangular grande (2 cm x 3 cm) en la porción dorsal izquierda del ratón. Afeitar la columna medialmente, la mesa lateralmente hasta que no se vea el pelo, la última costilla (13) inferiormente y el borde superior de la escápula hacia la cabeza.
  7. Coloque el ratón en una jaula vacía en un dispositivo de calentamiento aprobado por IACUC y observe la respiración del ratón hasta que esté despierto y alerta. En este momento, devuelva al ratón a su jaula de origen hasta la cirugía.

4. Preparación de la suspensión celular para inyección

  1. El día de la recolección celular (paso 2.2), agregue medios nuevos con 50 mg / ml de gentamicina 3-4 h antes de la recolección para eliminar las células muertas y desprendidas.
  2. Aspire el medio y lave las células con 1x PBS. Añadir tripsina-EDTA e incubar durante 1-2 min a 37 °C.
  3. Disperse las células y agregue medios para neutralizar la tripsina. Recolecte las células en un tubo cónico de 50 ml.
  4. Centrifugar a 1.200 × g durante 3 min a temperatura ambiente. Confirme que se forma un gránulo de celda compacta en la parte inferior del tubo, aspire el sobrenadante y lave el gránulo con 1x PBS. Repita este paso 3 veces.
  5. Vuelva a suspender el sedimento celular en 1x PBS a aproximadamente 1-2 millones de células / ml para el recuento. Filtre a través de un filtro celular de 40 μm antes del recuento.
  6. Combine 10 μL de suspensión celular con 10 μL de Trypan Blue y cuente con un hemocitómetro. Haga una suspensión celular 2x y cuente ambos para verificar los recuentos de células. Calcule el recuento total de células y la viabilidad.
  7. Centrifugar las células a 1.200 × g durante 3 min a temperatura ambiente para su resuspensión en el volumen final de inyección. Aspirar el PBS.
  8. Vuelva a suspender las células en 0,5 mg/ml de Matrigel en 1x PBS hasta el número de células deseado por inyección en un volumen de 50 μl. Mantenga la suspensión celular final en hielo durante todo el procedimiento para evitar la solidificación.
    NOTA: Este protocolo utiliza celdas LLC-luc. Inyectar a 25.000-50.000 células en 50 μL de volumen por ratón.

5. Preparación quirúrgica

  1. Realice el procedimiento en una sala quirúrgica aprobada por IACUC para procedimientos asépticos. Limpie la mesa quirúrgica con un desinfectante aprobado por veterinarios.
  2. Coloque una almohadilla térmica desinfectada aprobada por IACUC en el área quirúrgica. Coloque un paño quirúrgico estéril sobre la almohadilla térmica.

6. Anestesia quirúrgica

  1. Coloque el ratón en una cámara de inducción para anestesiarlo con isoflurano. Ajuste el caudal de oxígeno a 2,0 L/min y el vaporizador al 2% de isoflurano.
    NOTA: La concentración de isoflurano se puede ajustar según el tamaño del ratón.
  2. Controle la respiración del ratón y emplee un reflejo de retirada del pedal para confirmar la anestesia adecuada.
  3. Coloque el ratón en un cono nasal en posición recostada lateral derecha sobre el paño quirúrgico estéril. Verifique que el mouse esté correctamente anestesiado con el reflejo de retiro del pedal antes de continuar.
  4. Administre analgésico preoperatorio, meloxicam (2 mg / kg de peso) por vía subcutánea y ungüento oftálmico en ambos ojos.

7. Inyección pulmonar ortotópica

  1. Limpie el sitio quirúrgico 3 veces alternando entre etanol al 70% y betadine con una gasa estéril. Coloque un paño quirúrgico fenestrado esterilizado con una abertura de 3 cm x 4 cm en el ratón. Coloque los instrumentos esterilizados esterilizados en autoclave sobre el paño quirúrgico.
  2. Determine dónde hacer la incisión ubicando el borde craneal de la escápula y el borde caudal de la caja torácica torácica con fórceps. Asegúrese de que la piel esté tensa con el pulgar y el índice del cirujano y haga una incisión superficial de 5 mm solo a través de la piel directamente debajo de la escápula con una cuchilla de tamaño 10.
    NOTA: El cirujano debe usar guantes estériles.
  3. Use tijeras rectas de 115 mm para diseccionar la grasa subcutánea de las costillas y los músculos intercostales. No corte los músculos intercostales.
    NOTA: Tenga cuidado de no dañar la arteria toracodorsal y la rama profunda de la arteria cervical transversa, que se encuentran cerca de la escápula. Puede ocurrir un sangrado leve debido al corte de capilares dentro de la piel y la grasa subcutánea. Detenga el sangrado aplicando una ligera presión con un aplicador esterilizado con punta de algodón.
  4. Use fórceps Micro-Adson para mantener abierta la incisión. Comenzando desde la séptima costilla verdadera, use pinzas curvas de punta media para contar hacia arriba e identificar las costillas cuatro y cinco. Tenga en cuenta esta área para la inyección.
  5. Mezcle la suspensión celular invirtiendo suavemente 3-4x. Inmediatamente antes de la inyección, use una jeringa de insulina estéril de 300 μL 31 G 8 mm para extraer 50 μL de la suspensión celular y asegurarse de que no haya burbujas.
  6. Agregue una tira de cinta metálica esterilizada de 4 mm de espesor a la aguja, al ras de la jeringa, para que actúe como tapón. Esto asegura que la aguja solo penetre 4 mm de profundidad en el pulmón.
  7. Inyecte la suspensión celular de 50 μL directamente debajo de la cuarta costilla en el espacio intercostal entre la costilla cuatro y cinco en un ángulo de 90° perpendicular al pulmón. Después de inyectar la suspensión celular, sostenga la aguja en su lugar durante 2-3 s para permitir que el Matrigel se endurezca y evitar que las células salgan del lugar de la inyección.
  8. Retire lentamente la aguja en el mismo ángulo y deséchela en un recipiente para objetos punzantes.
  9. Sutura la piel con 2-3 puntos, cerrando con nudos cuadrados, y agrega adhesivo quirúrgico veterinario para asegurarte de que la herida esté lo suficientemente cerrada.

8. Procedimientos postquirúrgicos

  1. Coloque el ratón en una jaula vacía en un dispositivo de calefacción aprobado por IACUC. Controle al ratón hasta que se recupere por completo de la anestesia, lo que debería tomar de 1 a 2 minutos.
  2. Una vez que el ratón esté alerta y en movimiento, colóquelo en una jaula con ropa de cama fresca. Observe al ratón con frecuencia dentro de las primeras 24 h para detectar cualquier signo de dolor o infección.
  3. Administrar analgésico AINE, meloxicam (2 mg/kg de peso), mediante inyección subcutánea durante 2 días después de la cirugía.

9. Monitoreo del crecimiento tumoral mediante BLI in vivo

  1. Controle el crecimiento tumoral en el pulmón usando BLI tan pronto como el día después de la cirugía y con una frecuencia de una vez al día.
  2. Realice imágenes in vivo utilizando un sistema de imágenes in vivo (IVIS).
    1. Recupere luciferina a 15 mg / ml en 1x PBS sin magnesio ni calcio. Para un ratón de 20 g, esto equivale a inyectar 200 μL de la solución de luciferina de 15 mg/mL.
      NOTA: Proteja la solución de luciferina preparada de la luz cubriéndolo con papel de aluminio cuando no esté en uso, ya que es sensible a la luz.
    2. Software abierto y parámetros establecidos para imágenes bioluminiscentes. Establezca el tiempo de exposición en Automático. Establezca Factor de discretización en 4.
    3. Inyecte a los ratones por vía intraperitoneal 150 mg de luciferina por kg de peso.
    4. Al obtener imágenes de un nuevo modelo de células cancerosas por primera vez, realice una curva cinética para identificar el tiempo óptimo de absorción de luciferina, que se indica cuando la luminiscencia alcanza su punto máximo antes de que comience a estabilizarse.
      1. Inyecte luciferina a los ratones. Espere 3 minutos para que la luciferina absorba.
      2. Imagen ratones cada 5-10 min durante 60 min.
        NOTA: El tiempo de absorción óptimo para diferentes líneas celulares suele variar de 5 a 15 min.
    5. Para todas las sesiones de imágenes posteriores, utilice el tiempo óptimo de absorción de luciferina. Anestesiar a los ratones en preparación para las imágenes durante este tiempo. Coloque los ratones en una cámara de inducción al 2% de isoflurano con un caudal de 2,0 L / min.
    6. Una vez completada la captación, tome dos imágenes seleccionando Adquirir.
      1. Primera imagen del ratón acostado en la posición recostada lateral derecha. Esto permite que la cámara capture el lugar de la inyección, que se encuentra en la parte lateral izquierda del mouse. Utilice esta vista para cuantificar el crecimiento tumoral. Las imágenes capturadas en esta posición se indicarán de aquí en adelante como vista lateral izquierda.
      2. Inmediatamente después de completar la primera imagen, tome una segunda imagen del ratón en posición supina. Esto permite que la cámara capture los fotones emitidos por el tumor en la cavidad torácica desde la vista ventral. Utilice esta vista (aquí denominada vista ventral) para estimar la ubicación del cáncer dentro de la cavidad torácica.
  3. Para analizar las imágenes, cambie las unidades de Conteos a Radiancia.
  4. Abra la paleta de herramientas. Ve a Ajuste de imagen, selecciona Manual. Elija un mínimo y un máximo para la barra de color que mejor se adapte a las imágenes tomadas.
  5. Abra ROI Tools. Seleccione el menú desplegable del círculo para agregar un círculo de región de interés (ROI) a la imagen. Mueva el círculo sobre la incisión para la vista lateral izquierda y sobre el centro del tórax para la vista ventral.
  6. Seleccione Medir ROI.

10. Evaluación de los criterios de inclusión y exclusión

  1. Primero, confirme la presencia de luminiscencia tumoral en el pulmón observando la imagen de la vista lateral izquierda.
  2. A continuación, confirme la presencia de luminiscencia tumoral en la cavidad torácica izquierda en la imagen de vista ventral. Luego, confirme que solo hay un sitio de luminiscencia de la imagen de vista ventral.
  3. Si se cumplen estos dos criterios (pasos 10.1, 10.2), evalúe los criterios de exclusión asegurándose de que la luminiscencia no cruce la línea media en la cavidad torácica en la imagen de vista ventral. Si no se detecta luminiscencia en la imagen de la vista lateral izquierda después de dos imágenes IVIS consecutivas en el transcurso de 4 días después de la cirugía, excluya este ratón de estudios adicionales, ya que es probable que las células cancerosas no lo hayan tomado.

11. Evaluación de tumores al final de los estudios

  1. Cuando el flujo total de la luminiscencia tumoral alcance 1 × 108 fotones / s (p / s) o más, coseche los ratones para evaluaciones de punto final.
  2. Recolectar el tumor para análisis anatómico macroscópico o histología realizando los siguientes pasos para anestesia y perfusión del pulmón como se describió anteriormente37.
    1. Coloque el ratón en una cámara de inducción para anestesiarlo con isoflurano. Ajuste el caudal de oxígeno a 2,0 L/min y el vaporizador al 2% de isoflurano. Controle la respiración del ratón y emplee un reflejo de retirada del pedal para confirmar la anestesia adecuada.
      NOTA: La concentración de isoflurano se puede ajustar según el tamaño del ratón.
    2. Coloque el ratón en un cono nasal en posición supina. Verifique que el mouse esté correctamente anestesiado con el reflejo de retiro del pedal antes de continuar.
    3. Abra la cavidad torácica del ratón para visualizar los pulmones y el corazón detrás del diafragma.
    4. Haga un corte vertical largo hacia abajo a lo largo de la línea media del ratón. Mueva los intestinos para visualizar la arteria renal izquierda.
    5. Corta el diafragma para visualizar el corazón.
    6. Corte la arteria renal izquierda.
    7. Inyecte aproximadamente 5-10 ml de 1x PBS a través del ventrículo derecho del corazón a una velocidad de aproximadamente 5 ml / min.
    8. Haga una incisión a lo largo del cuello. Elimine cualquier grasa subcutánea ubicada por encima de la tráquea. Tenga cuidado de no cortar la tráquea.
    9. Perfore la tráquea paralela con una aguja para inyectar formalina al 10% directamente en la tráquea para inflar y fijar los pulmones.
    10. Obtener los pulmones de la cavidad torácica cortando la tráquea por encima del vértice del pulmón y cortar la pleura y los ligamentos que unen el pulmón a la cavidad torácica.
    11. Coloque en formalina al 10% para fijar.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este estudio, se inyectaron ratones C57BL6 / N según el protocolo presentado (Figura 1). Se utilizaron células LLC modificadas genéticamente para expresar luciferasa (LLC-luc). Además, se inyectó Matrigel a un ratón simulado sin células cancerosas. BLI en IVIS se puede iniciar tan pronto como 1 día después de la cirugía. Este estudio LLC-luc se optimizó en BLI para evaluar el cáncer de pulmón en etapa temprana. El sistema BLI utilizado en este documento t...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un procedimiento optimizado y mínimamente invasivo que permite tiempos de recuperación rápidos y un monitoreo casi inmediato del tumor, que difiere de los métodos más quirúrgicos intensos descritos anteriormente 10,11,20,38,39,40,41,42,43,44,45

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.C.H. y C.S.C. son fundadores de Geminii, Inc. Los términos de este acuerdo han sido revisados y aprobados por la Oficina de Conflicto de Intereses en Investigación de la Universidad de Iowa. Todos los demás autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría agradecer a los miembros de los laboratorios Carter y Sheffield, Susan Walsh, Bryan Allen y Kranti Mapuskar por sus valiosas discusiones. También nos gustaría agradecer a Samantha Eckley, veterinaria clínica sénior de la Oficina de Recursos Animales, por su orientación y consejo. Nos gustaría reconocer el uso del sistema de imágenes IVIS Lumina S5 en la instalación central de imágenes de animales pequeños, un recurso central respaldado por el Departamento de Radiología de la Universidad de Iowa. Ilustraciones gráficas de figuras generadas con Biorender (https://biorender.com). Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud NCI R21CA256301 (C.S.C., V.C.S.), el Programa de Biología de la Radiación de Radicales Libres NCI T32CA078586 (S.C.H.), el Sistema de Imágenes IVIS Lumina S5 comprado en 1S10OD026835.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,25% Tripsina-EDTA (1x)Gibco25200-056
Formalina amortiguada al 10% de neutroVWR16004-112
Platos tratados con cultivo de tejidos de 100 mm x 20 mmDot Scientific Inc.667621
Etanol puro de 190 gradosLaboratorios de Descontaminación2801
Jeringa de insulina 3/10 ml con aguja BD Ultra-Fine, 31 g x 5/16 in.Beckton Dickinson328438
Vetbond de 3 años3M1469SB
ATPSigmaA5394
Solución de betadina 10% antiséptico de povidona-yodoArvio Health L.P.67618-150-04
Ratones C57BL6/NLaboratorios Charles River
Cell Strainer 40um Nylon  Halcón352340
Máquina anestésica compactaAnestesia Vetamac  
Almohadilla de calentamiento infrarrojo lejano con controladorKent Scientific Corporation  
Mango de cuchilla quirúrgico convencional, tamaño 3Brad-Parker371030
Pinzas de uso general de punta media curvadasFisherbrand16-100-110
DitiotreitolProductos de Investigación InternacionalD11000
D-Luciferina (sal sódica)Cayman Chemical14682
Drape, quirúrgico 18" x 26" No con fenestras, estérilDealmed783410
Dulbecco' s Eagle Medio Modificado (1x)Gibco11965-092
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1xGibco14190-144
EGTASigmaE3389
Suero fetal bovinoGibcoA5670402
Fuente de luz del microscopio de fibra óptica FL150Meiji 
Solución de sulfato de gentamicinaIBI ScientificIB02030
GlicerolProductos de Investigación InternacionalG22025
IsofluranoPrimal Pharma Limited66794-013-25
IVIS Lumina S5PerkinElmer 
Software de Imagen VivaPerkinElmer 
LL/2 (LLC1)ATCCCRL-1642Utiliza la línea celular cancerosa que mejor se adapte a las necesidades del estudio y la nbsp;
Sulfato de magnesioFisher ScientificM63
Matriz de membrana basal MatrigelCorning354234
Portaagujas de Mayo-Hegar, 6", mandíbulas dentadasMiltex8-44TC
Pinzas Micro-AdsonHerramientas Científicas Fines10018-12
Recortadoras de patas N5 con doble hojaOneisall 
Esponjas de gasa no estériles de 12 capasNDCP157112
Lubricante para ojos OptixcareAventix5914304
Penicilina estreptomicinaGibco15140-122
Sutura de seda permanente a mano 6-0 1 x 18"Ethicon K802H
Ácido fosfórico 85%Fisher ScientificA242
Bisturí tamaño 10, acero inoxidable, estérilCincinnati Surgical110
Tubo de tapa de rosca cónico 50 mLSarstedt62.547.100
Tijeras de tejido 4,5" Staight PremiumOnsungSCT115
Triton X-100SigmaT6878
Trizma BaseSigmaT1503
Tinte azul de tripán (0,4%)Gibco15250-061
Cinta de aluminio utilitaria con forroIPGALF150L
Aplicadores de madera con punta de algodónNDC76200

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  2. Luo, G., et al. Estimated worldwide variation and trends in incidence of lung cancer by histological subtype in 2022 and over time: a population-based study. Lancet Respir Med. 13 (4), 348-363 (2025).
  3. Zhou, J., et al. Global burden of lung cancer in 2022 and projections to 2050: incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Cancer Epidemiol. 93, 102693(2024).
  4. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. ACancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
  5. Friedlaender, A., et al. Oncogenic alterations in advanced NSCLC: a molecular super-highway. Biomark Res. 12 (1), 24(2024).
  6. Li, S., et al. Emerging targeted therapies in advanced non-small-cell lung cancer. Cancers Basel. 15 (11), 2899(2023).
  7. Chavan, P. R., et al. Unravelling key signaling pathways for the therapeutic targeting of non-small cell lung cancer. Eur J Pharmacol. 998, 177494(2025).
  8. Wang, Y., et al. Survival trends among patients with metastatic non-small cell lung cancer before and after the approval of immunotherapy in the United States: a SEER database-based study. Cancer. 131 (1), e35476(2025).
  9. Doki, Y., et al. Mediastinal lymph node metastasis model by orthotopic intrapulmonary implantation of Lewis lung carcinoma cells in mice. Br J Cancer. 79 (7-8), 1121-1126 (1999).
  10. Wilson, A. N., et al. A method for orthotopic transplantation of lung cancer in mice. Methods Mol Biol. 2374, 231-242 (2022).
  11. Poczobutt, J. M., et al. Eicosanoid profiling in an orthotopic model of lung cancer progression by mass spectrometry demonstrates selective production of leukotrienes by inflammatory cells of the microenvironment. PLoS One. 8 (11), e79633(2013).
  12. Giannou, A. D., et al. Protocol for orthotopic single-lung transplantation in mice as a tool for lung metastasis studies. STAR Protoc. 4 (4), 102701(2023).
  13. Gan, W., et al. Establishment of an orthotopic model of lung cancer by transthoracic lung puncture using tumor fragments. J Thorac Dis. 15 (4), 2012-2021 (2023).
  14. Nakajima, T., et al. Orthotopic lung cancer murine model by nonoperative transbronchial approach. Ann Thorac Surg. 97 (5), 1771-1775 (2014).
  15. Moll, H. P., et al. Orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study PD-L1 expression. J Vis Exp. (143), e58101(2019).
  16. Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Sci. 97 (10), 996-1001 (2006).
  17. Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Lab Anim. 48 (2), 124-131 (2014).
  18. McDonald, J. A., et al. On target: an intrapulmonary transplantation method for modelling lung tumor development in its native microenvironment. Methods Mol Biol. 2691, 31-41 (2023).
  19. Liu, X., et al. Establishment of an orthotopic lung cancer model in nude mice and its evaluation by spiral CT. J Thorac Dis. 4 (2), 141-145 (2012).
  20. Liu, P., et al. In vivo imaging of orthotopic lung cancer models in mice. Methods Mol Biol. 2279, 199-212 (2021).
  21. Yamada-Hara, M., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor progression in the Lewis lung carcinoma orthotopic mouse model: a comparison between the tail vein injection and intranasal instillation methods. Curr Protoc. 4 (12), e70071(2024).
  22. Xu, H., et al. Unraveling the immune mechanisms and therapeutic targets in lung adenosquamous transformation. Front Immunol. 16, 1542526(2025).
  23. Ghasemi, K. Tiragolumab and TIGIT: pioneering the next era of cancer immunotherapy. Front Pharmacol. 16, 1568664(2025).
  24. Fortich, S., et al. Surgical management of oligometastatic non-small cell lung cancer. Cancers Basel. 17 (12), 2040(2025).
  25. Al-Showbaki, L., et al. Anti-programmed cell death-1 versus anti-programmed death-ligand 1 in PD-L1-negative advanced non-small cell lung cancer: a systematic review and meta-analysis. World J Oncol. 16 (3), 299-310 (2025).
  26. Close, D. M., et al. In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals. Sensors Basel. 11 (1), 180-206 (2011).
  27. Driehuys, B., et al. Small animal imaging with magnetic resonance microscopy. ILAR J. 49 (1), 35-53 (2008).
  28. Jelicks, L. A., et al. Imaging of small-animal models of infectious diseases. Am J Pathol. 182 (2), 296-304 (2013).
  29. Klaunberg, B. A., Lizak, M. J. Considerations for setting up a small-animal imaging facility. Lab Anim. 33 (3), 28-34 (2004).
  30. Puaux, A. L., et al. A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals. Int J Mol Imaging. 2011, 321538(2011).
  31. Yitbarek, D., Dagnaw, G. G. Application of advanced imaging modalities in veterinary medicine: a review. Vet Med Auckl. 13, 117-130 (2022).
  32. Saito-Moriya, R., et al. How to select firefly luciferin analogues for in vivo imaging. Int J Mol Sci. 22 (4), 1848(2021).
  33. Ramos-Gonzalez, M. R., et al. Establishment of translational luciferase-based cancer models to evaluate antitumoral therapies. Int J Mol Sci. 25 (19), 10418(2024).
  34. Young, M. R., et al. Monitoring tumor promotion and progression in a mouse model of inflammation-induced colon cancer with magnetic resonance colonography. Neoplasia. 11 (3), 237-246 (2009).
  35. Takeuchi, K., et al. Molecular structure and transcriptional function of the rat vascular AT1a angiotensin receptor gene. Circ Res. 73 (4), 612-621 (1993).
  36. Christian, S. L. Overview of the maintenance of authentic cancer cell lines. Methods Mol Biol. 2508, 1-7 (2022).
  37. Davenport, M. L., et al. Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology. J Vis Exp. (162), e2020(2020).
  38. Helms, M. N., et al. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. (42), e2010(2010).
  39. Kee, J. Y., et al. Antitumor immune activity by chemokine CX3CL1 in an orthotopic implantation of lung cancer model. Mol Clin Oncol. 1 (1), 35-40 (2013).
  40. Li, H. Y., et al. The tumor microenvironment regulates sensitivity of murine lung tumors to PD-1/PD-L1 antibody blockade. Cancer Immunol Res. 5 (9), 767-777 (2017).
  41. Morgan, K. M., et al. Patient-derived xenograft models of non-small cell lung cancer and their potential utility in personalized medicine. Front Oncol. 7, 2(2017).
  42. Oser, M. G., et al. Genetically-engineered mouse models of small cell lung cancer: the next generation. Oncogene. 43 (7), 457-469 (2024).
  43. Spiro, J. E., et al. Monitoring treatment effects in lung cancer-bearing mice: clinical CT and clinical MRI compared to micro-CT. Eur Radiol Exp. 4 (1), 31(2020).
  44. Weiss, I. D., et al. In the hunt for therapeutic targets: mimicking the growth, metastasis, and stromal associations of early-stage lung cancer using a novel orthotopic animal model. J Thorac Oncol. 10 (1), 46-58 (2015).
  45. Zhu, S., et al. Metabolomics study of ribavirin in the treatment of orthotopic lung cancer based on UPLC-Q-TOF/MS. Chem Biol Interact. 370, 110305(2023).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Modelo de c ncer de pulm nmodelo de rat n sing nicocirug a m nimamente invasivamicroambiente tumoralimagen por bioluminiscenciaimplantaci n de tumoresinyecci n de suspensi n celularmodelo de c ncer precl nicoc ncer de pulm n en estadio temprano

Artículos relacionados