Artículo de método

Linfodenectomía renal bilateral murina

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DOI:

10.3791/68695

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30 de diciembre de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Yale University School of Medicine, 2Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Section of Rheumatology, Yale University, 4Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un procedimiento de supervivencia para una linfadenectomía renal bilateral murina segura y bien tolerada.

Resumen

Las enfermedades autoinmunes son el resultado de que las células inmunitarias atacan inadecuadamente el tejido propio, lo que provoca patologías y daños en órganos vitales. Los órganos linfoides secundarios sirven como sitio para la activación de las células B y T y la tolerancia inmunitaria periférica, como consecuencia del drenaje de antígenos y el tráfico de células presentadoras de antígenos (CPA) a través de linfáticos locales. El papel de los ganglios linfáticos locales drenantes como el sitio inicial de activación de los linfocitos se ha descrito en contextos de tumores, infecciones y enfermedades autoinmunes específicas de órganos, pero no en la autoinmunidad sistémica. El lupus eritematoso sistémico, una de estas enfermedades, es una enfermedad autoinmune extendida con afectación renal común que puede provocar lesión renal y, eventualmente, fallo. El mayor conocimiento del papel de los ganglios linfáticos renales, que son el principal lugar de drenaje de antígenos y tráfico de CPA desde los riñones, está limitado por la incapacidad de perturbar selectivamente este tejido. Aquí se describe un procedimiento de supervivencia para una linfadenectomía renal bilateral murina segura y bien tolerada. Se incluyen instrucciones detalladas, ayudas visuales, consejos útiles para mejorar el éxito y solución de problemas procediales. La supervivencia a largo plazo es excelente y se ha observado durante al menos 4 meses tras la operación. Los ganglios linfáticos renales resecados están intactos y listos inmediatamente para el procesamiento posterior. Este procedimiento es más adecuado para estudios del efecto local de los ganglios linfáticos renales.

Introducción

Las enfermedades autoinmunes abarcan todos los órganos del cuerpo humano, desde enfermedades relativamente restringidas como la hepatitis autoinmune, la uveítis y la diabetes tipo 1, hasta enfermedades generalizadas como la esclerosis sistémica y la síndrome deSjögrens 1,2,3,4,5. La tolerancia inmunológica es una etapa crítica en el desarrollo de células B y T para prevenir laautorreactividad 6. Aunque la tolerancia central mediante deleción clonal en el timo es necesaria y eficaz, esto por sí solo deja lagunas en la defensa contra laautoinmunidad 7,8. La tolerancia periférica es una barrera secundaria a la autorreactividad mediante anergia, deleción o agotamiento de células B y T, que ocurre en órganos linfoides secundarios, incluidos los ganglios linfáticos regionales que drenan tejido tras el drenaje deantígenos 9,10. Sin embargo, también está cada vez más claro que las células autorreactivas pueden residir y migrar desde estos ganglios linfáticos en individuos genéticamente y/o ambientalmente susceptibles tras una activacióninadecuada 11,12.

El lupus eritematoso sistémico es una de estas enfermedades autoinmunes, con una clara implicación de células B y T en múltiples sistemasde órganos 13. Una manifestación especialmente común y morbosa es la nefritis lupus y la progresión hacia enfermedad renalterminal 14. La capacidad para comprender el efecto directo de las células B y T que residen localmente en la enfermedad renal autoinmune, en contraste con la fisiopatología sistémica circulante, está actualmente limitada por la incapacidad de perturbar selectivamente estos ganglios. Teniendo en cuenta esta carencia, se desarrolló un procedimiento de supervivencia para la linfadenectomía renal bilateral murina, que se describe aquí.

El objetivo general de este protocolo es lograr la excisión segura y fiable de los ganglios linfáticos renales bilaterales en ratones con alta supervivencia y tolerancia postoperatoria. Este procedimiento sería más adecuado para estudios sobre el efecto local de los ganglios linfáticos renales en el cebado, activación y tolerancia de células inmunitarias asociadas a la enfermedad renal. Este procedimiento es ideal cuando se combina con modelos autoinmunes o oncológicos que afectan al riñón.

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Protocolo

Todos los procedimientos se realizan en cumplimiento con los protocolos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Yale. Para desarrollar este procedimiento, se utilizaron 15 de cepas Balb/c de 8-12 semanas, ratones propensos al lupus (MRL/MpJ-Faslpr/J/J) y controles simulados emparejados por edad/sexo/genotipoen 15. Además, se analizaron ratones salvajes tipo C57BL/6 de 8 a 12 semanas de edad y se resecaron los ganglios de forma segura. Se incluyeron tanto ratones machos como hembras. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de instrumentos, animales y el quirófano

  1. Esteriliza todos los instrumentos quirúrgicos. Asegúrese de que la superficie de operación y el cono nasal anestésico estén limpios con etanol al 70%.
  2. Coloca el microscopio quirúrgico, asegurando una ergonomía cómoda para el cirujano quirúrgico.
  3. Instala una máquina de vaporizador de anestésico inhalado con cono nasal y succión para eliminar el exceso de anestésico. Instala una superficie de funcionamiento con una almohadilla de circulación de agua tibia para mantener la temperatura corporal y los suministros del animal en un lugar cómodo y estéril.
  4. Inducir anestesia administrando isoflurano inhalado al 2%-3% con un caudal de oxígeno de 2 L/min a través del cono nasal desde una máquina de vaporizador anestésico inhalado (siguiendo protocolos institucionalmente aprobados).
    1. Asegura el plano adecuado de anestesia confirmando una frecuencia respiratoria de aproximadamente 30-40 respiraciones/minuto y la falta de respuesta ante el pinchazo en la pata trasera. Revisa periódicamente el plano de anestesia adecuado y ajusta el caudal de isoflurano en consecuencia.
      NOTA: Alternativamente, un anestésico inyectable también es apropiado.
  5. Sigue las directrices del instituto para analgesia adecuada y anestesia local. Por ejemplo, se puede administrar subcutáneamente un analgésico de acción prolongada como 3,25 mg/kg de buprenorfina XR y administrar hasta 0,04 mL/5 g de peso corporal de solución de lidocaína de 1 mg/mL en los puntos de incisión planificados.
  6. Prepara al animal para el procedimiento aplicando lubricante ocular, arrancando o cortando el pelaje bilateralmente, esterilizando la espalda con solución de povodina/yodo, seguida de un 70% de etanol, y posicionando el decúbito lateral derecho (con el lado derecho hacia abajo).
    1. Utiliza cinta para asegurar el brazo izquierdo del animal por encima y la cola por abajo para crear una postura relajada pero alargada (Figura 1A). Esto desplazará el riñón más hacia abajo, lo que resultará en una mejor visualización y exposición.
  7. Lleva guantes estériles y coloca cortinas estériles sobre el animal con una ventana al campo operatorio. Mantén la esterilidad durante todo el procedimiento.
    1. OPCIONAL: Inyectar 10-20 μL de Evans Blue estéril filtrado al 5% en solución fisiológica tamponada con fosfato en almohadillas bilaterales de la parte trasera del pie antes de la posición del animal para mejorar la identificación de ganglios linfáticos renales mediante drenaje a lo largo del tracto linfáticoilíaco 16 (Figura 1D-G).
      NOTA: Ten en cuenta que este tinte puede interferir con las tinciones y los análisis citométricos de flujo. Además, con el tiempo, Evans Blue también infiltrará la cisterna chyli; véase "solución de problemas" para consejos (Tabla 1).

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Figura 1: Posicionamiento anatómico del ratón y órganos y inyección opcional de Evans Blue. (A) Posicionamiento y aseguramiento de animales para exposición renal izquierda. (B) Orientación anatómica dentro de las ventanas operativas. La cadena del ganglio linfático renal izquierdo se encuentra junto a los vasos suprarrenales y la aorta, superior a los vasos renales. El ganglio linfático renal derecho se encuentra justo por encima de los vasos renales. (C) Colocación y aseguramiento del animal para exposición renal derecha. (D-G) Implementación de inyección de Evans Blue al 5% de 20 μL. (D) Parte trasera izquierda y cadena del ganglio linfático renal izquierdo (flecha blanca) antes del colorante. Observa la ubicación general de la cisterna quyli (caja discontinuada), que a menudo es transparente y/o difícil de identificar a menos que esté llena de linfa. (E) Parte trasera izquierda y cadena del ganglio linfático renal izquierdo (flecha blanca) 5 minutos después de la inyección del colorante. Nótese vasos linfáticos aferentes (flecha negra). (F) Parte trasera del pie derecho y ganglio linfático renal derecho (flecha blanca) antes del colorante. G) Parte trasera derecha y ganglio linfático renal derecho (flecha blanca) 5 minutos después de la inyección del colorante. Observa los vasos linfáticos aferentes (flechas negras). Barras de escala: A,C = 1,0 cm; D-G (vistas de la parte trasera) = 0,5 cm; D-G (vistas internas) = 0,1 cm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Linfodenectomía renal izquierda

  1. Haz una incisión oblicua de 1 cm a través de la piel, justo por debajo del bazo (aproximadamente 1 cm por debajo de la costilla final). Disecciona la piel de forma directa alejándola de la pared abdominal/torácica e identifica el bazo dentro del abdomen.
    1. Realizar una incisión de 1 cm a través de la musculatura de la pared abdominal justo por debajo del bazo para acceder a la cavidad peritoneal (Figura 2A,B).
      NOTA: En ratones con piel no pigmentada, el bazo es fácilmente visible a través de la piel preparada como un órgano oscuro y móvil que reside lateralmente en el abdomen y está justo por debajo de la costilla final.
  2. Identifica el riñón izquierdo como un órgano liso a lo largo de la pared posterior del abdomen y justo por debajo del bazo. Los riñones y los ganglios linfáticos renales asociados residen en el retroperitoneo. Utilizando dos pinzas angulares, disecciona de forma directa la parte posterior del riñón izquierdo para acceder al retroperitoneo (Figura 2C).
    NOTA: La técnica adecuada y segura de disección roma consiste en aplicar una pequeña presión con pinzas cerradas en el plano de tejido deseado y permitir que el instrumento se abra suavemente, separando los planos del tejido.
  3. Refleja el riñón izquierdo anteromedialmente.
  4. Utilizando el microscopio disecador, identifica la almohadilla adiposa que envuelve el ganglio linfático renal izquierdo, que estará detrás del riñón izquierdo y superior a los vasos renales izquierdos. Identificar y evitar la glándula suprarrenal superior, la aorta posterior y el quilo cisternal anteromedialmente (Figura 1B,D).
  5. Utilizando una pinza de punta fina, disecciona de forma directa alrededor de la cápsula ganglio linfático (separándola de los vasos circundantes), mientras aplicas una contratensión suave con una pinza inclinada (Figura 2E). También se pueden usar tijeras de punta fina para diseccionar este plano de forma roma.
  6. Utilizando pinzas rectas de punta fina, retrae el ganglio linfático renal izquierdo cefálade mientras se utilizan tijeras de punta fina para incisar bruscamente las inserciones posteromediales del ganglio. Ten cuidado de no alterar los vasos sanguíneos cercanos ni la cisterna quili/conducto torácico (Figura 2F).
  7. Observa la zona de hemostasia (Figura 2G).
  8. Devuelve el riñón a su ubicación anatómica y cierra el abdomen en dos capas (pared abdominal y piel) con una sutura de polipropileno monofilamento 6-0 de forma continua. Aplica pegamento quirúrgico estéril sobre la herida.

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Figura 2: Linfodenectomía renal izquierda. (A) Incisión oblicua izquierda justo por debajo y posterior a la sombra esplénica. (B) Identificación del bazo superior (línea blanca), adrenal izquierda posterior (flecha negra) y riñón izquierdo inferior (línea negra). (C) Se crea un plano hacia el retroperitoneo diseccionando de forma directa inmediatamente posterior al riñón (flecha negra). (D) El ganglio linfático renal izquierdo (flechas blancas) es visible inmediatamente dentro de una vaina de adiposo. (E) Se crea un plano entre los recipientes cercanos y el nodo (flechas blancas). (F) El nodo se retrae suavemente y se extirpa bruscamente a lo largo del plano creado. (G) Se confirma la hemostasia y se observa que el espacio vacío (flechas desvaídas de (D)) donde antes vivía el ganglio linfático (flecha blanca) está libre de cualquier ganglio residual. (H) El ganglio linfático izquierdo suele ser una cadena de múltiples ganglios (flechas blancas). El inserto es una cadena linfática linfática izquierda ex vivo (1 mm x 3,5 mm). Barras de escala: 0,2 cm. Tick = 1 mm. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Linfodenectomía renal derecha

  1. Reposicionar al animal en decúbito lateral izquierdo (lado izquierdo hacia abajo). De nuevo, usa cinta para asegurar el brazo derecho del animal por encima y la cola por debajo para crear una postura relajada pero alargada. Esto es especialmente importante en la parte derecha, donde el hígado puede interrumpir la exposición (Figura 1C).
  2. Haz una incisión oblicua de 1 cm a través de la piel, justo por debajo de la costilla final (algo más superior que el lado izquierdo). Disecciona la piel de forma directa alejándose de la pared abdominal/torácica y realiza una incisión de 1 cm a través de la musculatura de la pared abdominal para acceder a la cavidad peritoneal (Figura 3A).
  3. Identifica el riñón derecho como un órgano liso a lo largo de la pared posterior abdominal y justo por debajo del hígado. Puede ser necesario usar un hisopo con punta de algodón para retraer la cefalada hepática. Utilizando dos pinzas angulares, disecciona de forma directa la parte posterior del riñón derecho para acceder al retroperitoneo (Figura 3B,C).
  4. Refleja el riñón derecho anteromedialmente.
  5. Utilizando el microscopio diseccionador, identifica la almohadilla adiposa que envuelve el ganglio linfático renal derecho, que estará detrás del riñón derecho y superior a los vasos renales derechos. Identificar y evitar la glándula suprarrenal superior (Figura 1B,D).
  6. Utilizando una pinza de punta fina o tijeras de punta fina, disecciona de forma directa alrededor de la cápsula ganglio linfático (separándola de los vasos circundantes), mientras aplicas una contratracción suave con una pinza inclinada (Figura 3E).
  7. Utilizando pinzas rectas de punta fina, retrae el ganglio linfático renal derecho cefálade mientras se utilizan tijeras de punta fina para incisar bruscamente las inserciones posteromediales del ganglio linfático (Figura 3F). Ten cuidado de no alterar los vasos sanguíneos renales, que están justo por debajo del ganglio linfático.
  8. Observa la zona de hemostasia (Figura 3G).
    NOTA: En general, se encuentra que el ganglio linfático renal derecho tiene un vaso sanguíneo más grande y de drenaje posterior, que es más probable que sangre si se extrae con éxito el ganglio linfático. El sangrado de este vaso puede controlarse con una presión suave con un hisopo con punta de algodón hasta lograr la hemostasis.
  9. Devuelve el riñón a su ubicación anatómica y cierra el abdomen en dos capas (pared abdominal y piel) con una sutura de polipropileno monofilamento 6-0 de forma continua. Aplica pegamento quirúrgico estéril sobre la herida.

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Figura 3: Linfodenectomía renal derecha. (A) Incisión oblicua derecha justo por debajo y posterior a la costilla final. (b) El borde hepático se identifica superiormente (línea blanca) y el riñón izquierdo inferior (línea negra). La suprarrenal derecha está oculta por el borde del hígado. (C) Se crea un plano hacia el retroperitoneo diseccionando de forma directa inmediatamente posterior al riñón (flecha negra). (D) El ganglio linfático renal derecho (flechas blancas) es inmediatamente visible dentro de una vaina de adiposo. (E) Luego se crea un plano alrededor del nodo (flecha blanca). (F) El nodo se retrae suavemente y se extirpa bruscamente a lo largo del plano creado. (G) Se confirma la hemostasia y se observa que el espacio vacío (flechas desvaídas de (D)) donde antes vivía el ganglio linfático (flecha blanca) está libre de cualquier ganglio residual. (H) El ganglio linfático derecho es un único ganglio esférico (flecha blanca). En la inserción es un ganglio linfático ex vivo (2 mm x 1,5 mm). Barras de escala: 0,2 cm. Tick = 1 mm. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Cuidados postoperatorios

  1. Reubica al animal en una jaula limpia, que está mitad sobre y mitad desconectada de una almohadilla de agua tibia con acceso a comida y agua de forma espontánea.
  2. Permite que el animal se recupere de la anestesia (~10-15 minutos) y vigila de cerca los signos de malestar. Si los animales no se recuperan rápidamente de la anestesia con comportamientos adecuados (es decir, aumento de la frecuencia respiratoria, autoenderezamiento, caminar, acicalamiento), eutanasien humanamente al animal (siguiendo los protocolos institucionalmente aprobados).
  3. Cuando todos los animales se hayan recuperado de la anestesia, devuelva las jaulas al centro de cuidado animal con acceso a agua, comida, cama y materiales de enriquecimiento ad libitum.
  4. Evalúa los ratones postoperatoriamente cada 12 horas durante 3 días para detectar signos de dolor o malestar (es decir, postura encorvada, disminución de actividad, menor implicación, mal cuidado). Eutanasiar humanamente a ratones que demuestren signos de malestar.
  5. Si se utiliza sutura permanente (como polipropileno monofilamento 6-0), examina las incisiones en el día 10 postoperatorio y retira cualquier material restante para la sutura.

5. Manejo de ganglios linfáticos

NOTA: El ganglio linfático extirpado está inmediatamente listo para entrar en las tuberías para aplicaciones posteriores.

  1. Al aprender por primera vez este procedimiento y anatomía, confirma la extirpación de ganglios linfáticos mediante histología o citometría de flujo utilizando tinciones de anticuerpos de tu elección.
  2. Colocar el tejido en medios de cultivo celular (por ejemplo, DMEM, RPMI) o suero salino tamponado con fosfato (PBS) sobre hielo para técnicas de células vivas o en fijador (por ejemplo, formalina neutral tamponada al 10%, 4% paraformaldehído) para la histología planificada.
    NOTA: Una forma rápida, pero menos precisa, de confirmar ganglios linfáticos es colocar la muestra resecada en PBS. En general, una muestra de ganglios linfáticos predominantemente hundirá, mientras que una muestra de tejido adiposo flotará; sin embargo, se recomiendan pruebas confirmatorias adicionales al optimizar este procedimiento.

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Resultados

Este procedimiento puede realizarse en 15-20 minutos por ratón. Para confirmar la precisión de este procedimiento, se realizaron linfadenectomias renales bilaterales en cinco hermanos de camada de 8 a 12 semanas, de edad, sexo y genotipo. Todos los ratones toleraron bien el procedimiento con un 100% de supervivencia perioperatoria. Las muestras extirpadas se colocaron en PBS sobre hielo. Todas las muestras se hundieron inmediatamente, confirmando un bajo contenido de adiposo. Las muestra...

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Discusión

Aquí se describe un procedimiento de supervivencia para una linfadenectomía renal bilateral murina segura y bien tolerada. La principal limitación de este procedimiento es el tamaño relativamente pequeño de los ganglios linfáticos renales, lo que requiere un microscopio quirúrgico. Sin un microscopio quirúrgico, la resección segura puede ser difícil de lograr. Algunos modelos genéticos de ratón tienen ganglios linfáticos agrandados, lo que facilita la identificación y el aprendizaje de t...

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Divulgaciones

R.A.F. es asesor de Glaxo Smith Kline, Plythera Inc. y Ventus Therapeutics. Todos los demás autores declaran no tener intereses en competencia.

Agradecimientos

Agradecemos a J. Alderman, B. Cadugan, E. Hughes-Picard y J. Horrocks por la asistencia administrativa, y a C. Hughes por la gestión de colonias de ratones. H.N.B. es miembro del Programa de Formación de Científicos Cirujanos de Yale, que financió y apoyó parcialmente este proyecto. Este trabajo también fue financiado por el Howard Hughes Medical Institute (para R.A.F.) y por el Premio de Investigación al Residente del American College of Surgeons (para H.N.B.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Circuito anestésicoCualquieraO anestésico inyectable
Citómetro de flujo BD LSRII (o equivalente)BD BiocienciasEquipado con el software FACS Diva
Buprenorfina XRCualquieraPara la analgesia
Medios de cultivo celular  Cualquiera(para técnicas de células vivas; es decir, DMEM o RPMI)
DAPIBioleyenda422801Concentración de trabajo: 15 ug/mL
Luces LED de microscopio de cuello de oca dobles/doblesCualquiera
Etanol (70% en agua)CualquieraPara limpiar
CD45.2 (104) anti-ratón conjugado con FITC (104)Bioleyenda109806Concentración de trabajo: 5 ug/mL
Pinzas: Pinzas de punta fina en ángulo (x2)RobozRS-5058Material: Dumoxel; Patrón #5, ángulo de 45 grados; Tamaño de punta 0,1 x 0,06mm
Pinzas: Pinzas de punta finaRobozRS-4960Material: Dumostar; Patrón #1; Tamaño de la punta: 0,20 x 0,12mm
Pinzas: Pinzas de punta finaRobozRS-4966Material: Dumostar, Punta de Biologie; Patrón #3; Tamaño de la punta: 0,08 x 0,04mm
LidocaínaCualquieraPara la analgesia
RatonesJaxPara la cepa C57BL/6, ratones salvajes: The Jackson Laboratories #000664
Clavadores de agujaRobozRS-6410Portaagujas Castroviejo; Recto
Microscopio operadorLeicaMZ9.5Microscopio de cabezal estéreo Leica Mz9.5
OPCIONAL: tinte azul EvansSigmaE2129-10GPara trazar la linfática.
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Cualquiera
Solución de povidona/yodoCualquieraPara la preparación/esterilización de la piel
Tijeras: tijeras de punta extra finaRobozRS-5605McPherson-Vannas; Filo de corte de 3mm; curva
Tijeras: Tijeras medianasRobozRS-5676Noyes; filo cortante de 13 mm; recto
Pegamento quirúrgicoCualquierapor ejemplo, adhesivo de tejido 3M Vetbond
Sutura: monofilamento azul 6-0 polipropilenoCualquiera
Fijador tisularCualquiera(para histología planificada; es decir, 10% formalina neutral amortiguada o 4% paraformaldehído)
Almohadilla térmica de circulación de agua calienteCualquiera
Ratones   Los laboratorios JacksonPara la cepa Balb/c, ratones propensos al lupus (MRL/MpJ-Fas-lpr/J): #000485

Referencias

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