Creación de oscilaciones rápidas de oxígeno en el análisis de crecimiento microbiano de una sola célula utilizando un dispositivo microfluídico de doble capa

Resumen

Este protocolo presenta un método para fabricar un chip microfluídico de doble capa y analizar el crecimiento microbiano bajo rápidas oscilaciones de oxígeno. El rendimiento del dispositivo se validó mediante la detección de oxígeno en canales de fluidos y el cultivo microbiano.

Resumen

El análisis microbiano de una sola célula mediante microfluídica junto con microscopía de lapso de tiempo es prometedor para investigar el comportamiento del crecimiento microbiano en entornos confinados con resolución espacio-temporal, lo que ofrece información que no se puede obtener de las plataformas analíticas y de cultivo convencionales. El oxígeno desempeña un papel crucial en la determinación del crecimiento microbiano. Sin embargo, el control temporal en el rango de segundos no se ha implementado en el análisis microbiano utilizando microfluídica. Recientemente hemos desarrollado un chip microfluídico PDMS de doble capa que permite el control temporal del oxígeno en el rango de decenas de segundos. El chip consta de una capa superior para la gasificación y una capa inferior para el cultivo y la perfusión de fluidos. Las dos capas están separadas por una delgada membrana intermedia de PDMS, lo que permite un rápido intercambio de gases entre las dos capas. En este artículo metodológico, explicamos el procedimiento para la fabricación de chips, la caracterización y el cultivo microbiano utilizando el chip. Como resultados representativos, demostramos la capacidad de cambio rápido de oxígeno en decenas de segundos, el cultivo microbiano y el análisis de crecimiento resuelto en el tiempo en condiciones de oxígeno constante y oscilante. Este protocolo tiene como objetivo ayudar a los investigadores interesados en implementar el control temporal del oxígeno en su configuración microfluídica.

Introducción

El oxígeno está estrechamente relacionado con el crecimiento microbiano y la fisiología entre varios factores ambientales, afectando particularmente los procesos celulares como la respuesta al estrés oxidativo, la homeostasis del hierro y las infecciones patógenas ^1,2,3. Convencionalmente, el cultivo microbiano se ha llevado a cabo en condiciones ambientales o con un control mínimo a niveles específicos de oxígeno. En escenarios realistas, por otro lado, los entornos de oxígeno a menudo no son constantes en muchos casos, sino que fluctúan con el tiempo. Por ejemplo, los microbios pueden estar expuestos a cambios en los niveles de oxígeno en cuestión de segundos a minutos en los sistemas acuáticos a medida que se desplazan por el medio ambiente debido al movimiento de los fluidos y la motilidad microbiana ^4,5,6. De manera similar, los biorreactores industriales también crean ambientes de oxígeno no homogéneos debido a una mezcla inadecuada, lo que afecta el crecimiento microbiano y el rendimiento final ^7,8. El estudio de las respuestas microbianas a estas condiciones dinámicas es vital para comprender los procesos ecológicos y mejorar las aplicaciones biotecnológicas.

Los anaerobios facultativos como Escherichia coli (E. coli) pueden cambiar entre vías aeróbicas y anaeróbicas dependiendo de la disponibilidad de oxígeno ^9,10. Aunque investigaciones previas han explorado esta adaptabilidad metabólica, la mayoría de los estudios se centran en cambios únicos de oxígeno utilizando sistemas de cultivo convencionales, que no logran replicar los cambios rápidos que los microbios a menudo enfrentan 9,11,12,13,14. Como resultado, existe una comprensión limitada de cómo los microbios responden fisiológicamente a los niveles de oxígeno que cambian con frecuencia.

Como se mencionó, las configuraciones de laboratorio tradicionales carecen de la precisión y la velocidad necesarias para imitar las fluctuaciones rápidas de oxígeno y no admiten el monitoreo continuo de alta resolución. Para abordar esto, hemos desarrollado recientemente una plataforma microfluídica especializada con un chip de polidimetilsiloxano (PDMS) de doble capa, que permite un rápido control del oxígeno y la obtención de imágenes de una sola célula¹⁵. Aquí, proporcionamos protocolos para fabricar un chip microfluídico de doble capa que crea oscilaciones rápidas de oxígeno y permite el análisis del crecimiento microbiano de una sola célula en condiciones controladas de oxígeno. El chip se compone de dos capas: una capa superior para la perfusión de gases y una capa inferior para la perfusión de fluidos y el cultivo microbiano. La membrana delgada intermedia entre las dos capas permite un rápido intercambio de gases. Como demostración, se cultivó E. coli MG1655 en el chip desarrollado. Se analizó el crecimiento en condiciones de oxígeno constante y oscilante.

Protocolo

1. Preparación del molde

1. Prepara un molde para la capa superior mediante impresión 3D. Fabrica el molde de la capa superior con una superficie lisa para garantizar una superficie lisa de la capa superior del PDMS resultante. Recomendamos el uso de la impresión 3D por estereolitografía (SLA).
   1. Diseñe el molde con software CAD 3D (Figura 1A). Asegúrese de que el diseño incluya canales de gas que se superpongan con los canales de fluido inferiores. Realice este proceso de diseño en paralelo al diseño de la capa inferior (paso 1.2.1).
   2. Imprime el molde mediante impresión 3D SLA. Retire la resina restante del molde impreso y lávelo en un baño de alcohol isopropílico (IPA) durante 30 minutos (Figura 1B).
   3. Realice el post-curado exponiendo el molde a una luz de 405 nm con la duración y temperatura adecuadas según el tipo de resina y la geometría.
   4. Deje que el molde se remoje en IPA en un baño de ultrasonido durante 15 minutos para eliminar la resina sin curar que queda en el molde, que de otro modo podría inhibir el curado de PDMS.
2. Prepara un molde de oblea de silicona para la capa inferior.
   1. Diseñe el chip microfluídico con el editor de diseño CAD (Figura 1C). Asegúrese de que el diseño incluya entradas, canales de fluido y salidas.
   2. Cree un molde de oblea de silicio utilizando fotolitografía de dos capas, como se describe en el documento anterior (Figura 1D)¹⁶.
      NOTA: Los canales de la capa inferior tienen el tamaño de μm y requieren una fabricación precisa, mientras que los canales de la capa superior tienen el tamaño de mm. Dado que la impresión 3D SLA ofrece un tiempo de fabricación más corto y, por lo tanto, una creación de prototipos más rápida, la impresión SLA se utilizó para fabricar estructuras bastante grandes para el molde de la capa superior. La capa inferior se fabricó mediante fotolitografía para garantizar una fabricación precisa. En caso de que los canales de la capa superior también estén en el rango de μm y requieran precisión, considere fabricar un molde utilizando fotolitografía también.

2. Fabricación de chips microfluídicos de doble capa PDMS

1. Prepare la solución de precurado PDMS mezclando bien la base y el agente de curado en una proporción de 10:1. Desgasificar la mezcla en un desecador durante 1 h.
2. Limpie el molde de la capa superior con IPA y seque con aire comprimido.
3. Vierta el PDMS en el molde de la capa superior, seguido de un curado térmico a 80 °C durante 20 min (^1er paso de curado, Figura 1E). El^1er paso de curado permite pelar, cortar y perforar el PDMS mientras no está completamente curado.
4. Compruebe la adherencia del PDMS a mano o con pinzas después de 20 minutos de calentamiento. Si el PDMS aún está pegajoso, ajuste el tiempo de calentamiento.
5. Retire el PDMS del molde de la capa superior y córtelo en piezas individuales (aquí 20 mm x 18 mm). Orificios perforados (diámetro = 0,75 mm) para entradas de gas (Figura 1F). Limpie la superficie inferior de la capa superior enjuagando con IPA, secando con aire comprimido y colocando cinta adhesiva.
6. Limpie el molde de la capa inferior con IPA y séquelo con aire comprimido. Fije el molde de la capa inferior en un recubridor giratorio y vierta PDMS en el centro del molde. Vierta PDMS cerca de la oblea para reducir las burbujas de aire. Si se encuentran burbujas de aire después de verter PDMS, muévalas hacia el lado exterior con pinzas o agujas limpias.
7. Aplicar una capa giratoria del PDMS en el molde de la capa inferior a 1000 rpm durante 60 s, seguido de un curado térmico a 80 °C durante 10 min (^1er paso de curado, Figura 1G). Compruebe la pegajosidad del PDMS a mano o con pinzas después de 10 minutos y ajuste el tiempo de calentamiento si es necesario.
8. Coloque las piezas de PDMS de la capa superior sobre la capa inferior de PDMS en el molde y presione firmemente desde la parte superior para asegurar la fijación de la superficie de las capas superior e inferior (Figura 1H).
9. Curar térmicamente el PDMS completamente a 80 °C durante al menos 1 h (^2º paso de curado). El^2º paso de curado permite el curado final del PDMS, donde las capas superior e inferior se unen irreversiblemente (Figura 1H).
10. Corta suavemente la capa inferior del PDMS en trozos. Despegue con cuidado todo el chip PDMS del molde (Figura 1H).
    NOTA: Si las virutas de PDMS son difíciles de despegar del molde, considere un tratamiento adicional de la superficie del molde de la capa inferior, como la silanización y el recubrimiento químico de la superficie, para facilitar el procedimiento de pelado. Si las capas superior e inferior se desprenden mientras se despegan, considere acortar el tiempo para el 1er paso^{de curado} .
11. Orificios de perforación (diámetro = 0,5 mm) para entradas y salidas de fluido en ambos extremos de los canales de fluido (Figura 1H). Limpie cuidadosamente la superficie inferior del chip enjuagando con IPA, secando con aire comprimido y colocando cinta adhesiva.
12. Pegar el chip con un cubreobjetos de 0,175 mm de espesor después de activar la superficie por oxidación por plasma (25 s, Figura 1H).
13. Después de colocar el chip en el sustrato de vidrio, enjuague la capa superior con aire presurizado para asegurarse de que la capa inferior de la membrana PDMS esté correctamente unida al vidrio.
14. Caliente la viruta adherida a 80 °C durante 10 s a 1 min para aumentar la estabilidad de la unión.
    NOTA: El paso de curado PDMS mencionado anteriormente y el tiempo de curado requerido pueden verse afectados por varios parámetros, como el grosor del molde, el equipo y las condiciones ambientales. Por lo tanto, ajuste el tiempo de curado en consecuencia en caso de que el protocolo sugerido no se adapte a la aplicación.

3. Configuración experimental

NOTA: Se utiliza un microscopio invertido equipado con una cámara complementaria de semiconductor de óxido metálico (CMOS), una cámara de microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida (FLIM) (dominio de frecuencia) y una incubadora de temperatura como configuración experimental estándar. Una fuente láser de excitación modulada (445 nm, 100 mW) está conectada a la cámara FLIM. Se utilizan tres controladores de flujo másico (nitrógeno, oxígeno y dióxido de carbono) para el control de gases. Las bombas de jeringa se utilizan para la perfusión media.

1. Prepare los tubos para la perfusión de gas (entrada) y fluido (entrada y salida). Encienda la incubadora para alcanzar la temperatura deseada antes del experimento (en este caso, 37 °C).
2. Seleccione la lente del objetivo que desee (en este caso, 20x para la detección de oxígeno y 100x para la observación microbiana) y añada aceite de inmersión si es necesario. Fije el chip de doble capa en un soporte de chips con adhesivos.

4. Control y detección de oxígeno en chip

1. Prepare una solución de colorante sensible al oxígeno con la concentración adecuada (en este caso, 3 mM de tris(2,2'-bipiridil)diclororutenio(II)hexahidratado, RTDP).
2. Calibre la cámara FLIM utilizando una corredera de referencia con una vida útil conocida (en este caso, 3,75 ns). Mida la intensidad de la señal con la cámara FLIM y ajuste el tiempo de exposición o la apertura del microscopio para lograr una intensidad de señal de 0,68 a 0,72 para una mejor calibración.
3. Fije el soporte de chip en la platina del microscopio. Conecte los tubos apropiados a la entrada y salida de fluido. Comience a perfundir la solución de colorante sensible al oxígeno a un caudal constante utilizando una bomba de jeringa (en este caso, 100 nL/min).
4. Conecte la entrada de gas y los controladores de flujo másico con la tubería adecuada. Comience a lavar el gas con una concentración de oxígeno controlada (aquí 0% o 21% de oxígeno, caudal másico total de 600 mL/min).
5. Mida el tiempo de vida de la fase en ausencia de oxígeno (τ₀) y con otra concentración de oxígeno conocida (aquí al 21%). Calcule la constante de enfriamiento (K_q) utilizando la ecuación de Stern-Volmer de la siguiente manera, que describe el enfriamiento por fluorescencia en presencia de oxígeno. Alternativamente, se puede utilizar la intensidad de fluorescencia (I); Sin embargo, la medición basada en la intensidad puede verse afectada por las variaciones en la intensidad de la fuente de luz, el fotoblanqueo, etc.
   
   NOTA: Se recomienda esperar unos minutos después de iniciar el lavado con gas para garantizar una calibración precisa, especialmente cuando se apuntan a niveles de agotamiento de oxígeno tan bajos como 0%. Para mejorar la precisión, considere complementar el proceso con métodos adicionales de agotamiento de oxígeno, como el uso de eliminadores de oxígeno o una configuración de cámara sellada adicional.
6. Mida la vida útil de la fase y calcule la concentración de oxígeno correspondiente utilizando la ecuación de Stern-Volmer. Para crear condiciones de oxígeno oscilantes, utilice cualquier sistema de control de instrumentos para automatizar el ajuste de los caudales volumétricos de nitrógeno y oxígeno.

5. Preparación del cultivo bacteriano

1. . Comience un precultivo inoculando un organismo deseado (en este caso, E. coli MG1655, una sola perla lista para usar de un vial criogénico por matraz) en el medio deseado (en este caso, medio LB compuesto por 10 g/L de peptona, 5 g/L de extracto de levadura y 10 g/L de NaCl) e incube durante la noche (aquí, 37 °C a 150 rpm).
2. Mida la densidad óptica resultante con un fotómetro a 600 nm (OD₆₀₀).
3. Iniciar el siguiente cultivo en medio LB inoculando el precultivo (en este caso, DO inicial₆₀₀ = 0,3 o 0,0001). Incubar el cultivo hasta que alcance la fase de crecimiento exponencial.
   NOTA: Si el medio para el cultivo en chip difiere del primer medio de precultivo, es deseable realizar un segundo precultivo con el medio para el cultivo en chip para permitir que los organismos se familiaricen con un nuevo medio¹⁶.
4. Prepare una solución de siembra diluyendo el cultivo a una densidad óptica adecuada. Transfiera la solución de siembra a una jeringa de 1 ml para el siguiente paso. En el caso de E. coli, la densidad óptica (OD₆₀₀) de la solución de siembra fue de alrededor de 0,5.

6. Cultivo microbiano en chip e imágenes de lapso de tiempo en condiciones controladas de oxígeno

1. Fije el soporte de chip en la platina del microscopio. Deje que el soporte de la viruta y el chip PDMS se calienten en la incubadora (en este caso, a 37 °C) durante varias horas, ya que esto disminuirá el riesgo de desenfoque durante la adquisición de imágenes de lapso de tiempo debido al desplazamiento asociado a la temperatura.
2. Antes de comenzar el cultivo, comience a gasificar con la concentración inicial de oxígeno deseada ajustando el porcentaje volumétrico del flujo másico de oxígeno y nitrógeno mientras mantiene constantes el caudal total y el caudal de dióxido de carbono.
3. Conecte la entrada de gas del chip y los controladores de flujo másico.
4. Siembre el organismo en el chip conectando la jeringa con la solución de siembra a la salida del líquido y empujando manualmente la jeringa. Compruebe a través del microscopio si las células están atrapadas con éxito en las cámaras de cultivo.
5. Después de la inoculación celular, retire la jeringa y conecte otra jeringa con el medio fresco a la entrada de líquido. Empuje manualmente la jeringa para enjuagar las células restantes en el canal de suministro de medio.
6. Comience a perfundir el medio a un caudal constante (en este caso, 100 nL/min) con la bomba de jeringa. Asegúrese de que el caudal sea suficiente, ya que un caudal inadecuado puede provocar la desecación de la cámara. El caudal suficiente puede variar en función de varios factores, como la geometría del canal de fluido y el caudal de gas en el canal de la capa superior.
7. Inicie la adquisición de imágenes de lapso de tiempo. Para el cultivo en condiciones oscilantes de oxígeno, inicie el control automático de los controladores de flujo másico al mismo tiempo que comienza la adquisición de imágenes. En caso de que haya algún retraso en el inicio del control de gas y la adquisición de imágenes, tenga en cuenta el retraso para el análisis posterior de los datos de la imagen.

7. Análisis de datos de imágenes

1. Guarde la imagen de lapso de tiempo como una pila de imágenes por posición.
2. Preprocese la imagen para rotar, alinear y recortar la colonia cultivada utilizando programas de análisis de imágenes. Ejemplos de archivos . Las imágenes TIF están disponibles aquí:^{https://doi.org/10.5281/zenodo.13982747 15}
3. Segmente las celdas y extraiga los valores relevantes, como el número de celdas, la longitud, el área, la intensidad de fluorescencia, etc. Analice más a fondo los comportamientos de crecimiento. Ejemplos de scripts de Python están disponibles aquí: https://github.com/JuBiotech/Supplement-to-Kasahara-et-al.-2025¹⁵

Resultados

Fabricación de chips de doble capa PDMS
El chip de doble capa fabricado se muestra en la Figura 2A, con canales de gas (rojo) y canales de fluido (azul) de colores para su visualización. El chip tiene tres canales de fluido idénticos y canales de gas superpuestos para permitir experimentos paralelos. El canal de fluido tiene un área de cultivo con una serie de cámaras de cultivo (Figura 2A (i)). Las células quedan atrapadas dentro de las cámaras de cultivo y se les permite crecer en un formato monocapa, lo que permite obtener imágenes de lapso de tiempo de alta resolución con una alta tasa de adquisición de imágenes. La sección transversal del chip ilustra una capa superior de 3 mm de espesor y capas inferiores de 65 μm de espesor, lo que permite una rápida difusión del gas desde el canal de gas al canal de fluido a través de la membrana intermedia de PDMS (Figura 2A (ii-ii')).

Control de oxígeno en chip
La capacidad de intercambio de gases del chip desarrollado se probó utilizando FLIM y tinte sensible al oxígeno¹⁵. Como se muestra en la Figura 2B, la concentración de oxígeno en el canal de fluido mostró una disminución o un aumento correspondiente en decenas de segundos cuando la concentración de oxígeno se cambió entre 21% y 0%. Estos resultados de la medición de oxígeno demuestran que la rápida oscilación del oxígeno en decenas de segundos se puede replicar en el chip microfluídico de doble capa desarrollado.

Cultivo microbiano en condiciones de oxígeno constante
El chip se empleó por primera vez para caracterizar el crecimiento de E. coli anaerobio facultativo en condiciones gaseosas constantes con varias concentraciones de oxígeno. Siempre se agregó dióxido de carbono al gas de suministro, ya que observamos un crecimiento restringido de E. coli bajo el agotamiento del dióxido de carbono en experimentos preliminares (datos no mostrados). Las figuras 3A y 3B muestran imágenes representativas de contraste de fase de E. coli en condiciones aeróbicas (21% de suministro de oxígeno) y anaeróbicas (0% de suministro de oxígeno), respectivamente. Después de 3 h de cultivo, E. coli cultivada en condiciones aeróbicas resultó en colonias más grandes en comparación con las condiciones anaeróbicas. El análisis cuantitativo también muestra diferentes tasas de aumento en el tamaño de la colonia (_colonia A) dependiendo de la disponibilidad de oxígeno, como se muestra en las curvas de crecimiento de la Figura 3C. Tenga en cuenta que una_colonia se normaliza por área inicial para permitir la comparación entre diferentes colonias y condiciones. La tasa de crecimiento exponencial μ se puede determinar a partir de la curva de crecimiento de la siguiente manera y se resume en la Figura 3D.

Los resultados validan la capacidad del dispositivo para controlar el oxígeno a concentraciones específicas y analizar de manera efectiva el crecimiento microbiano correspondiente a partir de imágenes de lapso de tiempo adquiridas.

Cultivo microbiano en condiciones oscilantes de oxígeno
Finalmente, E. coli se cultivó en condiciones oscilantes de oxígeno, alternando entre fases de gasificación aeróbica y anaeróbica con un intervalo de conmutación T'. Se examinaron varios T' entre 60 min y 1 min para probar la capacidad de análisis de crecimiento resuelto en el tiempo en correlación con condiciones oscilantes de oxígeno. La Figura 4 muestra el crecimiento cuantificado de E. coli en condiciones oscilantes de oxígeno con T' = 60, 30, 10, 5, 2 y 1 min. Además de la curva de crecimiento basada en la _colonia A, la tasa de crecimiento instantáneo μ_Δt también se determina para adquirir información resuelta en el tiempo de la siguiente manera.

Las tasas de crecimiento en condiciones aeróbicas y anaeróbicas constantes también se muestran con líneas punteadas (μ_21%, μ_0%) en la Figura 4 como referencias de crecimiento. El crecimiento de E. coli presentó una dinámica distinta en respuesta a condiciones gaseosas oscilantes. Por ejemplo, después de que la fase de gasificación se cambió de condiciones aeróbicas a anaeróbicas (T' = 60 min), el crecimiento mostró (i) fase de respuesta: disminución repentina en la tasa de crecimiento, seguida de (ii) fase de recuperación: aumento gradual en la tasa de crecimiento, y (iii) fase de estabilización: estabilización del crecimiento alrededor del _{μ 0%.} La dinámica de crecimiento de E. coli se resolvió temporalmente con éxito bajo varias T' tan cortas como 1 min, donde E. coli mostró una tasa de crecimiento monótona hacia arriba y hacia abajo debido al tiempo limitado para adaptar el crecimiento a las condiciones gaseosas cambiantes. Además, el comportamiento del crecimiento se puede analizar no solo a nivel de colonia, sino también a nivel de una sola célula. La Figura 5 ilustra el desarrollo del área de una sola célula bajo oscilaciones de oxígeno a varios intervalos de conmutación T'. El crecimiento de una sola célula se puede inferir siguiendo las parcelas vecinas, sin análisis de seguimiento. El comportamiento del crecimiento a nivel de una sola célula se asemeja a lo observado a nivel de colonia en la Figura 4; un aumento de área más rápido durante la fase de gasificación aeróbica y un claro cambio en la velocidad de crecimiento en el evento de cambio de gas. Los resultados aquí demuestran la capacidad de cultivar microbios en condiciones gaseosas oscilantes y de analizar el crecimiento microbiano en correlación con la disponibilidad de oxígeno de una manera resuelta en el tiempo.

Figura 1: Procedimiento de fabricación de chips de doble capa. El procedimiento comienza con el diseño de moldes (A, C), la fabricación de moldes (B, D), el moldeo PDMS (E-G) y el ensamblaje de chips (H). Esta cifra ha sido modificada de¹⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Chip de doble capa fabricado y su capacidad de control de oxígeno. (A) Se presenta la imagen representativa del chip fabricado, con canales de gas (rojo) y canales de fluido (azul) de colores para su visualización. La imagen SEM se muestra en (i), mostrando una serie de cámaras de cultivo conectadas a canales de fluido en ambos lados (barra de escala de 100 μm). La sección transversal del chip se muestra en (ii-ii'), que representa la capa superior de 3 mm de espesor y la capa inferior de 65 μm de grosor. (B) La concentración de oxígeno medida en el canal de fluido después del cambio entre condiciones aeróbicas (21% de oxígeno) y anaeróbicas (0% de oxígeno). Esta cifra ha sido modificada de¹⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Cultivo de E. coli en condiciones de oxígeno constante. (A) Las células se cultivan aeróbicamente (21% de suministro de oxígeno) durante 3 h, y se adquieren imágenes de lapso de tiempo mediante microscopía de contraste de fase. (B) Las células se cultivan anaeróbicamente (0% de suministro de oxígeno) y se adquieren imágenes de lapso de tiempo durante 3 h. (C) El crecimiento celular bajo varias condiciones de oxígeno constante se traza en función de la_colonia A. (D) Se calcula y resume la tasa de crecimiento exponencial. Todas las barras de escala = 5 μm. Los datos se expresan como media ± S.D. n = 35 colonias (0%), 27 (0,1%), 21 (0,5%), 16 (1%), 13 (5%), 13 (10%), 29 (21%). Esta cifra ha sido modificada de¹⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Cultivo de E. coli en condiciones oscilantes de oxígeno. Se examina el crecimiento celular en diversas condiciones oscilantes de oxígeno (T', intervalo de conmutación entre condiciones aeróbicas y anaeróbicas). El crecimiento celular basado en una_colonia A se traza a lo largo del tiempo (arriba) y μ_Δt se traza a lo largo del tiempo para permitir la interpretación de datos resueltos en el tiempo (abajo). Los datos se expresan como media ± D.E. n = 5 colonias (60 min), 3 (30 min), 4 (10 min), 4 (5 min), 4 (2 min), 5 (1 min). Esta cifra ha sido modificada de¹⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Área unicelular (Una _{sola célula} ) de E. coli cultivada en condiciones oscilantes de oxígeno. Los datos proceden de una colonia representativa de cada intervalo de conmutación T'. Esta cifra ha sido modificada de¹⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Se proporcionó el protocolo para fabricar y operar un sistema microfluídico de doble capa para observar el crecimiento microbiano en condiciones de oxígeno rápidamente oscilantes con alta resolución espacio-temporal. Junto con las imágenes de lapso de tiempo, esta plataforma permite el cultivo en chip y el monitoreo en tiempo real de microorganismos en condiciones controladas de oxígeno, lo que permite el análisis del crecimiento microbiano en correlación con la disponibilidad de oxígeno.

En este protocolo, las capas superior e inferior se preparan por separado y luego se ensamblan en un solo chip. Este concepto modular permite varios diseños de chips simplemente reemplazando las configuraciones de dos capas. Se utilizaron diferentes métodos de fabricación para los moldes de la capa superior e inferior (impresión 3D SLA para la parte superior y fotolitografía para la inferior) en función de sus respectivos requisitos de tamaño y precisión. Este enfoque mejora la eficiencia general del proceso de fabricación. El ensamblaje de las dos capas se realiza a través de un proceso de curado PDMS de dos pasos. Es esencial optimizar el tiempo de calentamiento para el primer paso de curado de acuerdo con el diseño, ya que el grosor del molde y las condiciones de calentamiento locales pueden afectar los resultados de curado del PDMS.

Aprovechamos la naturaleza del PDMS que es altamente permeable al aire para lograr un cambio rápido de oxígeno. Por otro lado, la precisión del control del oxígeno también puede verse afectada por la difusión pasiva de oxígeno a través de PDMS, particularmente a niveles más bajos de oxígeno. Para compensar esta limitación, se pueden añadir más mejoras al protocolo. Por ejemplo, el método de calibración del sensor de oxígeno tiene posibilidades de mejora. En el protocolo demostrado, el sensor se calibra en dos puntos de referencia, niveles de oxígeno de 0% y 21%, utilizando el chip de doble capa PDMS. En consecuencia, la precisión de la detección de oxígeno se basa en la capacidad de crear condiciones precisas de agotamiento de oxígeno para la calibración. Como se menciona en el protocolo, se recomienda esperar unos minutos después de iniciar el lavado con gas para garantizar una calibración precisa, especialmente cuando se trata de niveles de agotamiento de oxígeno tan bajos como 0%. Sin embargo, esta tarea es un desafío debido a las posibles fugas o retención de aire en el chip PDMS permeable al aire. La precisión de la calibración puede mejorarse aún más utilizando productos químicos que eliminan el oxígeno o encerrando el chip en una cámara herméticamente sellada y sin gas^17,18. Estos suplementos podrían permitir un análisis más robusto y preciso del comportamiento microbiano en condiciones estrictamente anaeróbicas y de bajo oxígeno.

El dispositivo demostrado sería de interés para diversos campos de investigación. Por ejemplo, sería útil para replicar las condiciones de oxígeno en biorreactores industriales, donde se supone que la disponibilidad de oxígeno es espacio-temporalmente no homogénea 7,8,19,20. El uso del chip de doble capa permite a los investigadores caracterizar y comprender el comportamiento microbiano en entornos de oxígeno que fluctúan rápidamente, lo que no era posible en las configuraciones de cultivo convencionales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Clewin 5	Software WieWeb, Países Bajos	N/A	Editor de maquetación
Cámara CMOS	Nikon, Japón	DS-Qi2
Cubierta de vidrio	Schott AG, Alemania	D263 Biografía	39,5 mm x 34,5 mm x 0,175 mm
Limpiador de plasma femto	Diener Electronics, Alemania	-	enlace de plasma de chip
Formulario 3B	Formlabs, EE. UU.	-	Impresora 3D
Referencia de por vida	Starna Scientific, Reino Unido	UMM-SFG
Controlador de flujo másico	Vö gtlin Instruments GmbH, Suiza	GSC-A9SA-BB22	de nitrógeno, de oxígeno
Controlador de flujo másico	Vö gtlin Instruments GmbH, Suiza	GSC-A9SA-BB21	dióxido de carbono
Resina modelo v3	Formlabs, EE. UU.	RS-F2-DMBE-03	Resina de impresión 3D
NaCl	Carl Roth, Alemania	3957.1	Componente medio LB
Nikon Eclipse Ti-E 2	Nikon, Japón	-	Microscopio invertido
cámara pco.flim	PCO AG, Alemania	-
Láser pco.flim	Omicron-Laserprodukte GmbH, Alemania	-
Peptona	Carl Roth, Alemania	8986.1	Componente medio LB
Plan Apo λ	Nikon, Japón	-	100x aceite, 20x
Polidimetilsiloxano (PDMS)	Dow Chemical Company, EE. UU.	Kit de elastómero de silicona Sylgard 184
Herramienta de perforación, Φ 0,50 milímetros	Instrumentos de precisión mundial, EE. UU.	504528
Herramienta de perforación, Φ 0,75 milímetros	Instrumentos de precisión mundial, EE. UU.	504529
Vial criogénico ROTI Store	Carl Roth, Alemania	-
Solidworks 2016 x64 Edition	Dassault Systems, Francia	N/A	CAD 3D
Recubridor de sustrato	APT Automation, Alemania	SPIN150i	Recubrimiento giratorio PDMS
Bomba de jeringa	CETONI, Alemania	neMESYS
Incubadora de temperatura	Okolab, Italia	-	Equipos de microscopio
tris(2,2'-bipiridil)diclororutenio(II)hexahidratado, (RTDP)	Acros Organics, Bélgica	208750010
Tubería	Saint-Gobain, Francia	Tygon F-4040-A	Tubería de entrada de gas
Tubería	Saint-Gobain, Francia	Tygon AAD04103	Tubería de fluido
Extracto de levadura	Carl Roth, Alemania	2363.3	Componente medio LB