Aquí presentamos un método para recolectar un gran volumen de sangre de cerdos utilizando canulación intracardíaca percutánea conectada a una bomba de vacío, como procedimiento terminal.
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Artículo de método
Extracción de sangre de gran volumen de cerdos para aplicaciones in vitro : uso de canulación intracardíaca y una bomba de vacío como procedimiento terminal
En este artículo
Resumen
Resumen
La recolección de sangre de rutina es necesaria en muchos estudios de investigación básica y aplicada. Se describen bien múltiples métodos para la recolección de sangre porcina. Estos incluyen el uso de las venas auriculares para la recolección de pequeños volúmenes de sangre y las venas yugulares o la vena cava craneal para la recolección de volúmenes de sangre más grandes. Algunos experimentos requieren grandes volúmenes de sangre de un animal individual a la vez para su análisis o uso en cultivos celulares primarios, lo que se puede lograr mejor mediante la desangración. La sangre recolectada para cultivo celular primario debe procesarse fresca y cuidadosamente para mantener la integridad celular. Describimos un método de recolección aséptica de sangre de cerdos bajo un plano quirúrgico de anestesia, utilizando un estilete de catéter intravascular de gran calibre insertado percutáneamente en el corazón y una bomba de vacío, que es eficiente, proporciona un gran rendimiento y minimiza la lisis celular. Esta técnica se realiza una vez en un animal, en un plano quirúrgico de anestesia, como un procedimiento terminal, proporcionando un riesgo mínimo de dolor o angustia.
Introducción
Los cerdos se han utilizado en la investigación en estudios que van desde estudios cardiovasculares hasta curación de heridas y toxicología, así como investigación agrícola, inmunología y estudios de enfermedades1. La sangre recolectada en la investigación se puede utilizar para estudiar enfermedades, farmacología, genética, investigación del sistema inmunológico y descubrimiento de biomarcadores. El cultivo celular es uno de los procedimientos más básicos que se realizan en la investigación y permite a los investigadores estudiar el comportamiento y la función celular, así como los modelos de enfermedades y el desarrollo de vacunas2. El cultivo de patógenos causantes de enfermedades, como el virus de la peste porcina africana, se realiza con frecuencia en un medio de cultivo predeterminado bajo estrictas condiciones de laboratorio asépticas. La propagación de enfermedades puede ocurrir a través de invasión, propagación o unión, lo que requiere células sanas y estables3. Los patógenos estudiados pueden tener un tropismo celular específico en el que se pueden propagar, y al tener un gran volumen de sangre se producen mayores cantidades de células para usar.
Para lograr un alto rendimiento de células de un animal individual, para la diferenciación celular, se debe recolectar suavemente un gran volumen de sangre para mantener la integridad celular antes de la separación celular. En cerdos, el volumen sanguíneo total puede calcularse en 65 ml/kg 4,5. En nuestra experiencia con la recolección de grandes volúmenes, se puede recuperar aproximadamente la mitad del volumen total de sangre de un animal. Por lo tanto, en cerdos adultos grandes, que pesan hasta 600 libras (273 kg), es posible un rendimiento de 6-8 L. En los cerdos, se pueden recolectar grandes volúmenes de sangre por vía percutánea de la vena cava craneal, la vena yugular externa, la vena safena mediante canulación o el corazón 4,5,6. Sin embargo, la extracción de sangre intracardíaca con una cánula de gran calibre permite recolectar el mayor volumen de sangre de manera eficiente con un riesgo mínimo de lisis celular. Como procedimiento terminal, este debe realizarse bajo un plano quirúrgico de anestesia5. Este artículo describe un método de uso de una bomba de vacío para recolectar múltiples litros de sangre de cerdos utilizando un enfoque percutáneo del corazón con un estilete de catéter intravenoso de gran calibre conectado a una bomba de vacío 7,8.
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Protocolo
Este estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Midwest Veterinary Services Inc. Como el método principal de eutanasia aprobado por IACUC durante este procedimiento es la desangración, se espera que algunos cerdos sufran un paro cardíaco debido a la pérdida de sangre. Cuando esto ocurre, se realiza un método de eutanasia secundaria, como la toracotomía bilateral. Después de recolectar el volumen de sangre requerido, si hay un latido cardíaco palpable, se coloca una jeringa con solución de eutanasia en el estilete y se administra intracardíaca como método de eutanasia primario, seguido de un método físico secundario. Los cerdos se mantienen de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales agrícolas en investigación y enseñanza, la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y la Ley de bienestar animal, según corresponda.
1. Preparación de materiales y animales (Tabla de materiales y Figura 1A-C)
- Ensamble el tubo a pajitas de acero inoxidable y conecte el extremo de la manguera al tubo de burbujas.
- Fije el tubo a la botella con rodillo con un tapón de goma con dos pajitas de metal desiguales y una botella de vidrio.
NOTA: El vidrio inhibe el colapso del recipiente creado por la bomba de vacío, pero se puede utilizar cualquier material que no se colapse bajo presión. - Instilar asépticamente 10 ml de heparina sódica (1,000 USP/ml) a través del tubo de succión y el estilete del catéter para evitar la coagulación. Agregue asépticamente 50 ml de heparina de sodio (1,000 USP / ml) en cada botella enrollable para lograr una concentración final de 50 UI / ml en cada litro de sangre y evitar la coagulación de la sangre durante la recolección. Asegúrese de que la bomba de vacío esté configurada en no más de 7 libras de extracción para evitar daños a las celdas.
2. Anestesia y posicionamiento de los animales
- Pese al animal no más de 24 h antes del procedimiento para calcular la dosis requerida de los medicamentos combinados de anestesia.
- Inyecte Telazol (3.0-5.0 mg / kg), ketamina (8-12 mg / kg) y xilacina (4.0-6.0 mg / kg) por vía intramuscular en el cuello u otro abdomen muscular grande (por ejemplo, músculos epaxiales), usando un juego de extensión de 30 pulgadas y una aguja de 18 G x 1.5 "para inducir anestesia profunda.
NOTA: En cerdos grandes, el volumen máximo recomendado de inyección IM es de 10 ml, por lo que puede ser necesario cambiar de ubicación después de cada 10 ml de administración9. Si bien elegimos este cóctel, este procedimiento se puede realizar bajo cualquier protocolo de anestesia aprobado por IACUC que produzca un plano quirúrgico de anestesia. - Una vez que se confirme que el animal está en un plano quirúrgico de anestesia (~ 5-8 min), sin mostrar reflejo palpebral, tono de mandíbula suelto y sin respuesta a estímulos de dolor, coloque al cerdo en una mesa elevadora, piso u otra superficie plana, en decúbito lateral derecho.
- Corta el vello del tórax ubicado sobre el corazón, si es necesario, cerca del cuarto y quinto espacio intercostal, justo caudal hasta la punta del codo.
- Si está disponible, use una ecografía (Figura 2A) para identificar el ventrículo izquierdo. Si no está disponible, el ventrículo izquierdo se encuentra más cerca del cuarto o quinto espacio intercostal medial al punto de impulso máximo8.
- Frote asépticamente el área con esponjas de gasa de 4 pulgadas x 4 pulgadas empapadas en exfoliante de clorhexidina al 2% y esponjas de gasa de 4 pulgadas x 4 pulgadas empapadas en alcohol isopropílico al 70%. Prepare la piel frotando de manera circular, comenzando en el punto de inyección y girando hacia afuera, durante un mínimo de 3x, alternando entre los dos desinfectantes.
3. Extracción de sangre intracardíaca
- Verifique que el animal haya permanecido en un plano quirúrgico de anestesia verificando el reflejo palpebral, el tono de la mandíbula y el reflejo pedal.
NOTA: Verifique la profundidad de la anestesia, así como la frecuencia cardíaca y respiratoria, durante todo el procedimiento para asegurarse de que el animal permanezca en un plano quirúrgico de anestesia. - Retire el estilete del catéter intravenoso. Coloque el estilete sobre el ventrículo izquierdo y avancelo perpendicular a la piel para insertar el estilete en el ventrículo izquierdo (Figura 2B). Cuando la sangre comience a salir del estilete, conéctelo al conector del extremo de la manguera del tubo de burbujas que está conectado a la botella de rodillo y luego, encienda la bomba de vacío (Figura 1A y Figura 2C).
- Confirme que la sangre fluye en un flujo constante. A medida que la sangre se introduce en el frasco con rodillo, gírelo suavemente para permitir que la sangre se mezcle con el anticoagulante para evitar la formación de coágulos.
- Una vez que se recolecta 1 L de sangre, use hemostáticos para sujetar el tubo de burbujas cerca de la botella con rodillo. Desconecte el tapón de goma y aplíquelo a la siguiente botella con rodillo. Retire el hemostático y deje que la sangre fluya libremente mientras gira suavemente el frasco con rodillo.
- Continúe este proceso hasta que se haya recolectado la sangre requerida. Una vez completado, sujete el tubo para evitar el derrame excesivo de sangre y apague la bomba.
- Retire el conector del tubo del estilete del catéter y conecte la jeringa de pentobarbital sódico al estilete. Retire la jeringa para asegurarse de que haya un destello de sangre y luego inyecte la solución de eutanasia. Confirmar la muerte por la ausencia de latidos cardíacos, respiración, tono muscular y reflejos. Una vez confirmada la muerte, retire la aguja del corazón y colóquela en un recipiente para objetos punzantes.
- Deseche el tubo de burbujas en un contenedor de desechos biológicos. Elimine la sangre gruesa de los artículos de acero inoxidable restantes (por ejemplo, pajitas de acero inoxidable, conectores de extremo de manguera) con un cepillo de tubo y luego autoclave para uso futuro.
- Coloque los tapones de goma, las pajitas, los conectores de los extremos de la manguera y los hemostáticos limpios en una nueva bolsa de autoclave y esterilice antes del próximo uso.
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Resultados
Antes de la extracción de sangre, las cerdas fueron preseleccionadas para Mycoplasma hyopneumoniae, adenovirus porcino, parvovirus porcino, coronavirus porcinos (gastroenteritis transmisible, diarrea epidémica porcina), encefalomielitis hemoaglutinante porcina, síndrome reproductivo y respiratorio porcino, grupo de influenza A, circovirus 1 y 2 y virus Séneca A. Hemos repetido este procedimiento varias veces en cerdas cruzadas de Yorkshire hembras que pesan entre 300 y 600 libra...
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Discusión
El procedimiento aquí describe un conjunto de catéter-estilete a bomba de vacío para recolectar un gran volumen de sangre del corazón de las cerdas. Debido al potencial de dolor y angustia, este procedimiento solo debe realizarse en animales que se encuentran en un plano quirúrgico de anestesia. La inmovilidad de la anestesia permite que los principiantes aprendan este procedimiento y lo dominen rápidamente. Se pueden usar múltiples venas para recolectar sangre de animales. Las vías más ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.
Agradecimientos
Deseamos agradecer especialmente a la Subdivisión de Recursos Animales del Centro de Enfermedades Animales de Plum Island, tanto a los técnicos de salud animal como a Animal Care por su excelente asistencia técnica. El financiamiento para el proyecto en la organización de investigación por contrato fue proporcionado por el USDA, ARS, Unidad de Recursos Animales en NBAF.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Bomba de diafragma modelo de laboratorio de 1/8 HP y guiño; 115 vacío vacío, 60 psi máximo y nbsp; | Centro de Suministros de la Base | 80058845 | |
| 10 g x 6 pulgadas con catéter sobre aguja. | Covetrus North American Veterinary Supplies & nbsp; | 024616 | |
| Jeringuilla de 50 mL, luer lock y nbsp; | Fisher Scientific & nbsp; | 13-689-8 | |
| Aquasonic 100 ecografía gel azul & nbsp; | Suministro Veterinario del Medio Oeste | 001.02109.2 | |
| Tubería de burbujas argyl, no conductora (¼ ") | Fisher Scientific & nbsp; | NC2282605 (Catálogo de proveedores # 8888280412) | |
| Clorhexidina Q Scrub 2% | Suministro Veterinario del Medio Oeste | 562.30804.3 | |
| Botellas desechables Corning. | Fisher Scientific & nbsp; | 06-413 | |
| Corning PYREX de boca estrecha, botella de vidrio resistente Erlenmeyer o similar creando succión | Fisher Scientific & nbsp; | 10-040F | |
| Cepillo de tubos de ensayo de nylon Eisco | Fisher Scientific & nbsp; | S13962 | |
| Tapones de goma de dos agujeros Fisherbrand | Fisher Scientific & nbsp; | Dependiendo del tamaño y la séptima; | |
| Ketamina (10 mg/mL) y nbsp; | Suministro Veterinario del Medio Oeste | 275.22100.3 | |
| MLL a extremo de manguera de 6 mm (acero inoxidable) y nbsp; | Cadence Science | 6547IND | |
| MLL a extremo de manguera de 8mm (acero inoxidable) y nbsp; | Cadence Science | 6549IND | |
| Esponja de gasa MVet no tejida 4 x 4 contrachapados | Suministro Veterinario del Medio Oeste | 000.30156.2 | |
| MVet alcohol isopropílico 70% | Suministro Veterinario del Medio Oeste | 000.50054.3 | |
| Pinzas hemostáticas MVet Kelly rectas 5,5" | Suministro Veterinario del Medio Oeste | 000.36800.2 | |
| Heparina sódica (1000 U/mL) y nbsp; | Suministro Veterinario del Medio Oeste | 191.46701.3 | |
| Pentobarbital sódico (390 mg/mL) y nbsp; | Suministro Veterinario del Medio Oeste | 749.20000.3 | |
| Pajitas de acero inoxidable y pajitas de acero inoxidable; | Hobby Lobby | 1893635 | |
| Telazol (100 mg/mL) y nbsp; | Suministro Veterinario del Medio Oeste | 275.40000.3 | |
| Xilazina (100 mg/mL) y nbsp; | Suministro Veterinario del Medio Oeste | 310.01150.3 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
