Method Article

Tecnología de clasificación de células tumorales circulantes de alto rendimiento basada en microfluidos y secuenciación de células individuales

DOI:

10.3791/68708

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November 14th, 2025

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1Department of Urology, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Institute of Molecular Medicine, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células tumorales circulantes (CTC) son fundamentales para el estudio de la progresión y la metástasis del cáncer. Este artículo presenta un protocolo integrado de alto rendimiento para el enriquecimiento de CTC y la secuenciación de CTC única, mejorando la eficiencia de captura y la pureza de CTC al tiempo que reduce la contaminación y los costos de secuenciación, avanzando así en la investigación oncológica de precisión y las aplicaciones clínicas.

Abstract

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Las células tumorales circulantes (CTC) sirven como un biomarcador prometedor para rastrear la metástasis, la progresión y la recurrencia del cáncer. Las técnicas de biopsia líquida centradas en la detección de CTC han demostrado un potencial considerable debido a su naturaleza no invasiva y su capacidad para proporcionar un seguimiento en tiempo real de la dinámica tumoral. Sin embargo, los análisis convencionales de CTC a granel no logran capturar la heterogeneidad intrínseca entre las poblaciones de CTC, lo que oscurece información crucial sobre la biología tumoral. La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) permite la caracterización de alta resolución de la heterogeneidad de CTC, ofreciendo nuevas oportunidades para la oncología de precisión y los estudios mecanicistas de la progresión tumoral. A pesar de estas ventajas, las metodologías existentes para la secuenciación de un solo CTC tienden a sufrir ineficiencias, incluidas bajas tasas de recuperación, flujos de trabajo intensivos en mano de obra y riesgos de contaminación asociados con múltiples pasos de manipulación manual. Para abordar estas limitaciones, presentamos un protocolo microfluídico integrado que consolida el enriquecimiento de CTC, la purificación y la secuenciación de una sola célula en un flujo de trabajo unificado. El método emplea la captura magnética controlada dinámicamente dentro de un chip con estructura de espiga, donde la mezcla de vórtices y la unión de perlas inmunomagnéticas acumulativas permiten un aislamiento de CTC robusto y de alto rendimiento con un daño celular mínimo. La purificación posterior mediante un chip microfluídico recubierto de anticuerpos leucocitarios elimina eficazmente las células no diana, mejorando aún más la pureza de CTC a través de la selección negativa. Finalmente, un chip de secuenciación unicelular de alta precisión, diseñado en base a los principios de resistencia al flujo diferencial, facilita la captura y el emparejamiento eficientes de una sola célula con microperlas con códigos de barras únicos. Esta novedosa plataforma supera las limitaciones de los métodos basados en la distribución de Poisson, mejorando la utilización de CTC y minimizando el consumo de microperlas y los costos de secuenciación. Nuestro protocolo integrado mejora significativamente la eficiencia de captura de CTC, la pureza y el rendimiento de secuenciación de una sola célula, lo que lo hace muy adecuado para aplicaciones clínicas e investigación del cáncer a gran escala. Al permitir un análisis más preciso y escalable de la heterogeneidad de la CTC, este método tiene el potencial de refinar el diagnóstico temprano del cáncer, el seguimiento del tratamiento y los estudios mecanicistas de metástasis, lo que en última instancia avanza en el campo de la oncología de precisión.

Introduction

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La metástasis tumoral es un proceso complejo y de múltiples fases que comienza con la diseminación y luego sufre latencia y colonización por células tumorales dentro del tumor primario. Estas células invaden progresivamente a través de la membrana basal hacia tejidos más profundos y, posteriormente, se intravasan en vasos sanguíneos o linfáticos. Una vez en la circulación, estas células se convierten en células tumorales circulantes (CTC), que pueden viajar a órganos distantes1. La aparición de CTC es un paso crítico en la cascada metastásica, ya que sirven como semillas para la metástasis a distancia1. En los últimos años, la tecnología de biopsia líquida basada en CTC ha atraído una atención considerable debido a sus méritos, incluida la naturaleza no invasiva y conveniente del procedimiento, así como la capacidad de monitoreo dinámico en tiempo real. Esta tecnología facilita una evaluación precisa, en tiempo real e integral de la biología tumoral, ofreciendo ventajas únicas en el monitoreo de la eficacia del tratamiento, la predicción de la recurrencia y la orientación de la terapia 2,3,4. Además, los estudios han demostrado que las CTC están presentes en la sangre periférica incluso durante etapas de baja carga tumoral, como cáncer temprano, metástasis temprana o recurrencia 5,6. En consecuencia, la biopsia líquida por CTC supera las limitaciones de las biopsias de tejido tradicionales, que se limitan a tumores sólidos detectables por imágenes7. Proporciona una perspectiva novedosa y apoyo tecnológico para el diagnóstico precoz del cáncer, la monitorización de la recurrencia y la metástasis, la orientación del tratamiento, así como la dilucidación de los mecanismos de iniciación, progresión y metástasis del tumor. Por ejemplo, se ha demostrado que el número de CTC en sangre periférica sirve como un predictor independiente tanto de la supervivencia libre de progresión como de la supervivencia general en pacientes con cáncer, con recuentos más altos de CTC que indican un peor pronóstico8. Los cambios dinámicos en el número de CTC también están estrechamente asociados con la progresión de la enfermedad y la carga tumoral después del tratamiento 9,10.

Estudios recientes han destacado las tecnologías basadas en microfluidos como herramientas transformadoras para el aislamiento de CTC. Estas tecnologías se pueden clasificar ampliamente en enfoques basados en la física y en la biología, cada uno de los cuales ofrece ventajas distintas mientras enfrenta desafíos específicos. Los métodos basados en la física se basan en las diferencias de tamaño y deformabilidad para separar los CTC, lo que permite una clasificación sin etiquetas con un alto rendimiento. Sin embargo, esta estrategia de separación no específica puede comprometer tanto la eficiencia de captura como la pureza debido a la heterogeneidad inherente de las CTC. Por ejemplo, Lu et al. informaron de un chip microfluídico que integraba un diseño de separación de focos y reducción de velocidad con matrices de trampas, que superó a la mayoría de las técnicas convencionales basadas en la física en términos de enriquecimiento y purificación de CTC11. Sin embargo, el chip logró solo un agotamiento de 3-4 log de glóbulos blancos (WBC), que sigue siendo insuficiente para aplicaciones clínicas. Por otro lado, las estrategias de aislamiento de CTC basadas en la inmunoafinidad suelen ofrecer una mayor tasa de recuperación y pureza de las células diana. Sin embargo, la interacción de unión entre las moléculas de captura y las CTC a menudo limita el rendimiento de tales enfoques12,13. En consecuencia, un método de aislamiento que equilibre tanto la alta eficiencia de enriquecimiento como el rendimiento es esencial para procesar eficazmente muestras clínicas con poblaciones raras de CTC.

Además, la heterogeneidad sustancial entre las CTC plantea un desafío significativo para los análisis posteriores 10,14,15, ya que los análisis convencionales de CTC a granel con frecuencia oscurecen las distinciones celulares individuales. La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) facilita la caracterización integral a nivel molecular de la heterogeneidad de la expresión génica de CTC, proporcionando información sobre la clasificación, el estado y la función de las CTC. Esta tecnología ofrece enfoques novedosos para la oncología de precisión y facilita la investigación de los mecanismos de iniciación, progresión y metástasis de tumores16. Por ejemplo, Fan et al. construyeron un atlas transcriptómico de una sola CTC a partir de varios sitios vasculares en pacientes con carcinoma hepatocelular, revelando la heterogeneidad espacial entre las CTC e identificando mediadores clave de la evasión inmune17. Al mismo tiempo, Miyamoto et al. identificaron mutaciones en el gen del receptor de andrógenos y variantes de empalme en CTC de pacientes con cáncer de próstata, dilucidando así los mecanismos subyacentes a la resistencia a los medicamentos18.

Sin embargo, el desarrollo de la secuenciación transcriptómica de CTC única ha progresado lentamente. Las metodologías existentes adolecen de deficiencias en la automatización e integración, lo que resulta en una baja eficiencia de recuperación de CTC, procedimientos complejos y bajas tasas de éxito experimental19. Por ejemplo, los protocolos actuales requieren un proceso secuencial que involucra el enriquecimiento de CTC, la purificación, el aislamiento de una sola célula y la amplificación de ácidos nucleicos. Estos pasos se realizan en tubos de centrífuga separados, lo que requiere múltiples pasos de pipeteo y transferencia. Los procedimientos intensivos en mano de obra no solo reducen la eficiencia, sino que también aumentan el riesgo de pérdida y contaminación de CTC20. Los enfoques convencionales, como la selección de células por capilaridad, limitan aún más el rendimiento y la eficiencia analítica durante el aislamiento de una sola célula21. Además, los métodos tradicionales también están limitados por la distribución de Poisson, que es un fenómeno estadístico que describe la encapsulación aleatoria de células. Esto da como resultado una alta proporción de gotas vacías o múltiples células por gota, lo que limita la eficiencia de captura. Para abordar estos desafíos, los investigadores han desarrollado chips microfluídicos integrados para el análisis transcriptómico de CTC unicelular. Estas plataformas consolidan múltiples pasos en un flujo de trabajo de un solo chip, lo que reduce los riesgos de contaminación y mejora la eficiencia analítica. Por ejemplo, Euisik Yoon et al. desarrollaron el método Hydro-Seq, que emplea la selección de tamaño basada en la dinámica de fluidos para aislar CTC en microcámaras y emparejar de manera eficiente CTC individuales con microperlas con códigos de barrasúnicos 22. Sin embargo, este método se basa en la separación de CTC basada en el tamaño, lo que a menudo da como resultado una baja pureza de CTC y un rendimiento limitado (10 μl/min), lo que lo hace inadecuado para procesar muestras clínicas de gran volumen. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar un sistema de análisis de CTC unicelular integrado, de alto rendimiento, bajo volumen y resistente a la contaminación.

Aquí, describimos un protocolo eficiente y de alto rendimiento para el enriquecimiento de CTC y la secuenciación de una sola célula, que comprende tres componentes principales: clasificación de CTC, purificación y un chip de secuenciación de una sola célula (Figura 1). El chip microfluídico de clasificación CTC está diseñado en base al principio de fuerzas de captura magnética reguladas dinámicamente (Figura 2A). Permite el enriquecimiento de CTC de alto rendimiento a través de la mezcla de vórtices dentro de la estructura de espiga, así como la captura acumulativa por perlas inmunomagnéticas. La liberación no destructiva de CTC se logra posteriormente mediante una modulación precisa del campo magnético. Luego se emplea un chip de purificación, donde se utilizan microcanales recubiertos de anticuerpos leucocitarios para la selección negativa, lo que produce CTC altamente purificados (Figura 2B). Finalmente, se empleó una plataforma de manipulación unicelular de alta eficiencia basada en la resistencia de flujo diferencial, superando con éxito las limitaciones de la distribución de Poisson y permitiendo un emparejamiento y captura eficientes de microesferas codificadas / unicelulares (Figura 3A). Mejora significativamente la utilización de CTC al tiempo que reduce el consumo de microperlas y los costos de secuenciación.

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Figura 1: Esquema de la tecnología de clasificación CTC basada en microfluidos y secuenciación unicelular. Este flujo de trabajo ilustra el proceso por el cual las células tumorales se desprenden de las lesiones tumorales, ingresan al torrente sanguíneo y forman CTC. Las muestras de sangre periférica o leucopak que contienen CTC se procesan secuencialmente a través de los chips de captura, purificación y secuenciación de ARNc de CTC, lo que finalmente permite la secuenciación transcriptómica y el análisis bioinformático de las CTC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

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1. Método 1: Aislamiento de CTC basado en microfluidos

  1. Fabricación de astillas en espiga (HB-chip)
    1. Preparación de moldes maestros
      1. Prepare una oblea de silicona limpia y hornee a 135 °C durante la noche para eliminar la humedad. Después de enfriar a temperatura ambiente, trate la oblea con un limpiador de plasma de oxígeno a 150 W durante 1 minuto para activar la superficie.
      2. Modele la primera capa del chip para formar una matriz de pilares de soporte (28 columnas × 7 filas, numeradas de #1 a #28 a lo largo de la dirección del flujo) utilizando fotorresistencia SU-8. Configure el recubridor giratorio para que funcione secuencialmente a 500 rpm durante 10 s, 2350 rpm durante 55 s y 500 rpm durante 10 s. Asegúrese de que la altura de esta capa sea de 50 μm.
      3. Hornee suavemente la primera capa a 65 ° C durante 1 min, seguida de 95 ° C durante 20 min para evaporar el solvente. Deje enfriar a temperatura ambiente.
      4. Exponga la primera capa usando una fotomáscara con el diseño de pilar de soporte correspondiente. Ajuste la dosis de exposición a 130 mJ/cm2.
      5. Realice el horneado posterior a la exposición a 65 °C durante 1 min, seguido de 95 °C durante 6 min.
      6. Después de enfriar, dispense revelador SU-8 sobre la superficie de la oblea para eliminar la fotorresistencia no reticulada y obtener la capa inferior. Deje que se acumule durante 30 segundos, luego enjuague con agua desionizada.
      7. Aplique una capa de centrifugado de la segunda capa SU-8 sobre la primera capa utilizando los mismos parámetros de centrifugado que en el paso 1.1.1.2. Modele la segunda capa para formar estructuras en espiga en un ángulo de 45 ° con respecto a la pared del canal, con un ancho de ranura de 100 μm, un paso de 200 μm y seis crestas por ciclo. Asegúrese de que la altura de esta capa también sea de 50 μm.
        NOTA: En la Figura complementaria 1 se ha proporcionado un diagrama esquemático que ilustra todas las dimensiones relevantes de las características de la microestructura (incluida la matriz de pilares de soporte y las ranuras en espiga).
      8. Hornee suavemente la primera capa a 65 ° C durante 1 min, seguida de 95 ° C durante 20 min para evaporar el solvente. Deje enfriar a temperatura ambiente.
      9. Expone la segunda capa usando una fotomáscara con el diseño de espiga. Ajuste la dosis de exposición a 130 mJ/cm2.
      10. Realice el horneado posterior a la exposición a 65 °C durante 1 min, seguido de 95 °C durante 6 min.
      11. Después de enfriar, use el revelador SU-8 para eliminar las regiones no reticuladas y revelar la microestructura completa de dos capas.
    2. Preparación de réplicas de PDMS
      1. Formule la mezcla de PDMS combinando el prepolímero y el reticulante en una proporción de peso de 10:1. Prepare 10-15 ml de la mezcla para un solo chip.
      2. Vierta la mezcla en el molde maestro y elimine el aire atrapado mediante la desgasificación. Curar el PDMS colocando el molde en un horno a 95 °C durante 30 min.
      3. Retire la réplica de PDMS curada del molde. Cree una entrada y una salida con un perforador PDMS de 1 mm de diámetro.
    3. Ensamblaje de chip HB
      1. Ajuste el limpiador de plasma de oxígeno a una potencia de 150 W durante 3 min. Active las superficies tratando tanto la réplica de PDMS como la capa de PDMS preadherida en un portaobjetos de vidrio limpio.
        NOTA: Debido a la abundancia de enlaces Si-O en las cadenas de polímeros PDMS, la activación por plasma permite la unión covalente entre PDMS y sustratos como vidrio y silicio, lo que facilita el sellado de virutas.
      2. Alinee las estructuras PDMS tratadas y únalas firmemente. Confirme que la matriz de pilares de soporte y las características de espiga estén completamente integradas con el sustrato de vidrio para finalizar el chip HB.
  2. Preparación de perlas inmunomagnéticas (IMB)
    1. Incubar 25 μL de perlas magnéticas modificadas con estreptavidina (SA-MB) lavadas y resuspendidas (1 μm) (≈4 × 108 perlas por ml) con 1 μg de anticuerpo EpCAM (molécula de adhesión de células epiteliales) biotinilado a temperatura ambiente con rotación a 20 rpm durante 40 min para preparar los IMB.
    2. Después de la separación magnética en una gradilla magnética, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en 25 μL de tampón de aislamiento (1% BSA, 2 mM EDTA, D-PBS).
  3. Operación del chip de aislamiento
    1. Pipetee 20 μL de la suspensión de perlas magnéticas en 1-2 s, asegurándose de que no se introduzcan burbujas de aire.
    2. Coloque inmediatamente el chip verticalmente sobre un imán y deje que las perlas se asienten durante 5 minutos sin molestias.
    3. Recoja la muestra de sangre (sangre periférica o muestras experimentales de leucopak) e inmediatamente extraiga 4 ml en una jeringa, asegurándose de que se eliminen las burbujas de aire. Selle la entrada y salida del chip con líquido para eliminar las burbujas de aire. Inserte los tubos de entrada y salida de muestras en el chip.
      NOTA: Asegúrese de que se implementen medidas básicas de protección personal al manipular muestras biológicas.
    4. Inyecte la muestra mediante una bomba de jeringa con un caudal de 1,5 ml/h.
    5. Después de la carga de la muestra, inyecte 60 μL de D-PBS en el chip HB a un caudal de 0,2 ml/h para eliminar las células no unidas.
    6. Retire el imán e inyecte manualmente 1,5 ml de BSA (5% p/v en D-PBS) para lavar el chip y liberar las células tumorales capturadas del chip HB.

2. Método 2: purificación de CTC basada en microfluidos

  1. Modificación del chip HB
    1. Preparar una solución de trimetoxisilano (3-mercaptopropilo) (MPTS) en etanol con una fracción de volumen (v/v) del 10%. Introduzca inmediatamente 20 μL de solución MPTS en el chip HB e incube a temperatura ambiente durante 1 h.
    2. Enjuagar una vez con etanol anhidro y secar a 100 °C durante 1 h.
    3. Preparar una solución de éster de N-γ-maleimidobutiril-oxisuccinimida (GMBS) en etanol a una concentración de 0,5 mg/ml. Enfríe el chip a 37 °C, introduzca la solución GMBS e incube a temperatura ambiente durante 30 min.
      NOTA: Cuando use MPTS y GMBS, siempre use guantes, una bata de laboratorio y una máscara. Estos reactivos poseen propiedades tóxicas e irritantes de las mucosas y deben manipularse con cuidado en un área bien ventilada.
    4. Enjuague dos veces con ddH2O, seguido de dos enjuagues con D-PBS.
    5. Añadir inmediatamente 15 μg/ml de estreptavidina (SA), incubar a temperatura ambiente durante 1 h o toda la noche a 4 °C.
    6. Enjuague dos veces con D-PBS.
    7. Preparar el tampón de anticuerpos CD45: 0,2% (p/v) de BSA y 20 μg/ml de anticuerpo CD45 biotinilado, diluido a volumen con D-PBS.
    8. Inyecte 20 μL del tampón de anticuerpos CD45 en el chip HB para la selección negativa de glóbulos blancos. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h, luego enjuagar con D-PBS.
    9. Añadir una solución bloqueante que contenga un 3% (p/v) de BSA y un 0,05% (p/v) de Tween-20, incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Enjuague con D-PBS antes de cargar la muestra.
  2. Carga de muestras
    1. Aspire la muestra con una jeringa, asegurándose de eliminar las burbujas de aire. Selle la entrada y salida del chip con líquido para eliminar las burbujas de aire. Inserte los tubos de entrada y salida de muestras en el chip.
    2. Inyecte la muestra con una bomba de jeringa y ajuste el caudal a 0,6 ml/h.
    3. Recolecte las células tumorales purificadas de la salida para el recuento y la secuenciación de una sola célula.

3. Método 3: Tecnología de secuenciación y códigos de barras unicelulares basada en micropocillos

  1. Preparación de reactivos y materiales
    1. Pretratamiento de virutas
      1. Agregue 200 μL de 1x D-PBS y solución de F-68 al 0,5% a la entrada del chip.
      2. Realice una sonicación en baño de agua mientras sostiene el chip. Cuando las burbujas sean visibles en toda la región microporosa, continúe la sonicación durante 30 s para eliminar las burbujas de los pocillos dobles.
    2. Preparación de cuentas con código de barras
      1. Mezcle bien la solución madre de perlas magnéticas con código de barras y transfiera 200 μL a un tubo de centrífuga. Aplique separación magnética hasta que la solución se aclare y deseche el sobrenadante.
      2. Lave las perlas con código de barras dos veces con 500 μL de TE-TW (10 mM de Tris-HCl pH = 8,0, 1 mM de EDTA, 0,01% de Tween-20).
      3. Lave y vuelva a suspender las perlas con código de barras en 200 μL de 20x TE (10 mM de Tris-HCl pH = 7,5, 1 mM de EDTA) y 50 mM de solución de DTT, luego colóquelas en hielo.
    3. Preparación de suspensión unicelular
      1. Transfiera las células tumorales purificadas a un tubo centrífugo de 1,5 ml y centrifugue a 400 × g durante 3 min a temperatura ambiente. Lave y vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de 1x D-PBS.
      2. Realice el recuento de células y prepare la suspensión unicelular en consecuencia. El volumen de carga de la muestra debe ser de 200 μL, con un total de 80.000 células (400 células/μL).
    4. Prepare el tampón de lisis celular, que incluye 1x citrato salino de sodio (SSC), 0,5 M de LiCl, 0,6% de Triton X-100, 10 mM de EDTA, 5 mM de DTT y 1 U/μL de inhibidor de la ARNasa.
  2. Funcionamiento de chips microfluídicos
    1. Captura de células
      1. Inyecte 200 μL de la suspensión de células tumorales en el chip (60000 pocillos dobles), luego agite a 10 rpm en un agitador decolorante durante 5 min para permitir que las células se asienten en los pocillos de captura por gravedad.
      2. Pipetea suavemente la suspensión celular en el chip hacia arriba y hacia abajo dos veces. Luego, coloque el chip en un agitador decolorante a 10 rpm durante 5 minutos para volver a suspender las células no capturadas y permitir que se asienten nuevamente.
      3. Agregue 200 μL de 1x D-PBS y solución de F-68 al 0,5% a través de la entrada y aspire la solución de la salida. Repita dos veces para un total de tres lavados de la papa fritas.
    2. Captura de cuentas con código de barras
      1. Vuelva a suspender la suspensión de cordón con código de barras, luego inyecte inmediatamente 200 μL de la suspensión en el chip a través de la entrada. Agitar a 10 rpm durante 20 s.
      2. Pipetea suavemente la suspensión de perlas dos veces, luego agita a 10 rpm durante 20 s. Repita este paso una vez.
      3. Retire la suspensión de perlas con código de barras de la salida, agregue 200 μL de 20x TE (pH = 7,5) y 50 mM de solución DTT, luego retire el líquido de la salida. Repita este paso dos veces, para un total de tres lavados.
    3. Lisis celular y captura de ARNm
      1. Agregue lentamente 200 μL del tampón de lisis celular al chip a través de la entrada. Inmediatamente después, agregue lentamente 200 μL de aceite mineral para sellar los pocillos dobles.
        NOTA: El sellado debe ocurrir inmediatamente para evitar la contaminación.
      2. Retire la solución que sale de la salida de virutas hacia el depósito de residuos. Coloque el chip horizontalmente y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Recuperación de perlas con código de barras
      1. Después de la lisis, agregue lentamente 200 μL de 6x SSC a través de la entrada, elimine el líquido residual y aspire la solución restante de la salida del chip.
      2. Agregue lentamente 200 μL de 6x SSC para llenar el chip. Sostenga un imán cerca de la superficie del chip y muévalo lentamente desde la entrada hasta la salida para recolectar perlas con código de barras de los pozos de captura. Luego, aspire rápidamente la solución, así como las perlas con código de barras del chip en un tubo de centrífuga precargado con 6x SSC.
      3. Lavar tres veces con 200 μL de 6x SSC, seguido de una vez con 1x tampón RT (ver Tabla de Materiales).
  3. Transcripción inversa (RT), tratamiento con exonucleasa I y PCR
    1. RT
      1. Vuelva a suspender las perlas con código de barras en 100 μL de mezcla de reacción de transcripción inversa, que contiene 1× tampón RT, 1 mM GTP, 1 mM dNTP, 5% PEG 8000, 2,5 μM Template Switch Oligo (consulte la tabla de materiales), 1 U/μL de inhibidor de ARNasa y 10 U/μL de transcriptasa inversa. Incubar la solución a 42 °C durante 120 min.
    2. Tratamiento con exonucleasas
      1. Después de la transcripción inversa, lave las perlas una vez con 200 μL de 1x TE-SDS (10 mM de Tris-HCl pH = 8,0, 1 mM de EDTA, 0,5% de SDS), una vez con 200 μL de 1x TE-TW y una vez con 200 μL de 10 mM de Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Vuelva a suspender las perlas en 100 μL de mezcla de exonucleasas, que contenga 1x tampón de exonucleasa I y 1 U/μL de exonucleasa I, e incube a 37 °C durante 45 min.
    3. Síntesis de segunda hebra
      1. Lave las perlas una vez con 200 μL de 1x TE-SDS. Vuelva a suspender las perlas en 200 μL de NaOH 0,1 M e incube durante 5 min a temperatura ambiente con rotación a 30 rpm para desnaturalizar el producto híbrido ARNm-ADNc. A continuación, lave las perlas una vez con 200 μL de 1x TE-TW y una vez con 200 μL de 10 mM Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Vuelva a suspender las perlas en 100 μL de la mezcla de reacción, que contiene 1x tampón RT, 1 mM dNTP, 5% PEG 8000, 0,5 μM de cebador de síntesis de segunda hebra (consulte la Tabla de materiales) y 0,125 U/μL de fragmento de Klenow. Incubar la solución a 37 °C durante 60 min.
    4. Amplificación de ADNc
      1. Lave las perlas una vez con 200 μL de 1x TE-SDS, una vez con 200 μL de 1x TE-TW y una vez con 200 μL de 10 mM de Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Vuelva a suspender las perlas en 150 μL de mezcla de PCR, incluida 1x mezcla de reacción de PCR y 0,8 μM de oligo ISPCR (consulte la tabla de materiales). Configure el programa de PCR de la siguiente manera: 95 °C durante 3 min; cuatro ciclos de 98 °C durante 20 s, 65 °C durante 30 s y 72 °C durante 3 min; ocho ciclos de 98 °C durante 20 s, 67 °C durante 20 s y 72 °C durante 3 min; 72 °C durante 5 min.
      3. Purifique el producto de PCR dos veces con perlas magnéticas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) de 0,6x para la purificación del ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante y eluya en 20,5 μL de H2O. Mida la concentración del producto de PCR purificado utilizando un ensayo de cuantificación de ADN basado en fluorescencia.
      4. Realice una segunda amplificación del producto de PCR purificado utilizando una mezcla de PCR que contenga 1x mezcla de reacción de PCR y 0,8 μM de oligo ISPCR (consulte la Tabla de materiales). Configure el programa de PCR de la siguiente manera: 98 °C durante 3 min; cinco ciclos de 98 °C durante 20 s, 67 °C durante 20 s y 72 °C durante 3 min; 72 °C durante 5 min.
      5. Purifique el producto de PCR dos veces con perlas magnéticas SPRI de 0,6x para la purificación del ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante y eluya en 20,5 μL de H2O. Mida la concentración del producto de PCR purificado utilizando un ensayo de cuantificación de ADN basado en fluorescencia23.
    5. Construcción de bibliotecas de ADNc
      1. Construya la biblioteca con un kit de preparación de bibliotecas de ADN estándar (consulte la tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      2. Amplíe la biblioteca mediante PCR utilizando el par de cebadores N70X / P5 (consulte la tabla complementaria). Configure el programa de PCR de la siguiente manera: 72 °C durante 3 min; 98 °C durante 30 s; doce ciclos de 98 °C durante 15 s, 58 °C durante 30 s y 72 °C durante 3 min; 72 °C durante 5 min.
      3. Purifique la biblioteca con perlas magnéticas SPRI de 0,6x para la purificación del ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante y eluya en 20 μL de H2O. Mida la concentración del producto de PCR purificado utilizando un ensayo de cuantificación de ADN basado en fluorescencia.
        NOTA: En general, se considera aceptable una concentración final de la biblioteca de ADN de ≥ 2 ng/μL y una cantidad total de ≥ 50 ng24.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El ensamblaje y la liberación de la interfaz de captura de CTC se pueden evaluar mediante microscopía. Una distribución uniforme de las perlas magnéticas (MB) en la parte inferior del chip HB bajo un campo magnético indica un ensamblaje exitoso, mientras que un mínimo o ningún MB residual confirma una liberación exitosa (Figura 2C). Este paso es fundamental para determinar el rendimiento y la pureza de los CTC capturados. Para validar la eficiencia de captura del chip de aislamiento CTC, realizamos un experimento de pico. Un pequeño número de células tumorales con alta expresión de EpCAM (PC3 o LNCaP) se introdujeron en PBS que contenían una gran población de células Jurkat, que exhiben una baja expresión de EpCAM, simulando la presencia de abundantes células sanguíneas en circulación. El chip de aislamiento de CTC capturó eficientemente las células tumorales de muestras de 1 ml y 10 ml, lo que demuestra su capacidad de clasificación de CTC eficiente y de alto rendimiento (Figura 2D). Para evaluar la especificidad de la captura basada en IMB, utilizamos un chip de control modificado con SA-MB que carecen de conjugación de anticuerpos EpCAM. La ausencia de captura significativa de células tumorales confirmó la especificidad del aislamiento de CTC mediado por IMB (Figura 2D).

Además de la eficiencia de captura, la pureza es otro parámetro crítico para evaluar las plataformas de aislamiento de CTC. Comparamos la pureza de las células tumorales aisladas utilizando el chip de captura o el chip de purificación solo, así como la pureza lograda a través de la selección secuencial positiva y negativa (Figura 2E). Ambos chips mejoraron significativamente la pureza de las células tumorales en comparación con el grupo de control, lo que demuestra su eficacia en el aislamiento de CTC. Más importante aún, el uso combinado de la selección positiva y negativa mejoró aún más la pureza y el rendimiento de las células tumorales en comparación con el uso de un solo método.

Para evaluar más a fondo el rendimiento de los chips de captura y clasificación de CTC en entornos clínicos, recolectamos muestras de sangre periférica (PB) de seis donantes sanos y realizamos experimentos de picos. Dada la abundancia extremadamente baja de CTC en muestras clínicas, se agregaron aproximadamente 500-1000 células LNCaP en cada 10 ml de muestra de PB. Los recuentos de glóbulos blancos en todas las muestras de PB recolectadas estaban dentro del rango normal (4-10 × 106 células / ml). Los resultados demostraron que el sistema de clasificación CTC mantuvo una alta eficiencia de captura y pureza de las células tumorales, incluso cuando se procesaron muestras clínicas (Figura 2F-G y Figura complementaria 2).

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Figura 2: Plataforma de captura y purificación de CTC estructurada en espiga. (A) Flujo de trabajo del chip de aislamiento de CTC. Primero, un campo magnético estable e IMB conjugados con anticuerpos EpCAM ensamblan la interfaz de captura. A continuación, la mezcla de vórtices dentro del chip HB mejora la eficiencia de transferencia de masa entre CTC e IMB, lo que facilita la captura acumulada. Finalmente, se logra una liberación suave de CTC eliminando el campo magnético. (B) Flujo de trabajo del chip de purificación CTC. El chip HB se modifica con anticuerpos de selección negativa, y la mezcla de vórtice facilita aún más las interacciones leucocitos-anticuerpos, lo que en última instancia produce CTC altamente purificadas. Barra de escala, 100 μm. (C) Las imágenes microscópicas demuestran el ensamblaje y la liberación exitosos del chip de captura. (D) Los gráficos de barras comparan la eficiencia de captura de CTC de la plataforma de aislamiento en diferentes volúmenes de muestra, utilizando SA-MB no funcionalizados como control. Barras de error, media ± DE, n = 3. (E) Los gráficos de barras comparan la pureza de los CTC obtenidos utilizando un solo chip HB frente a los que se someten a captura y purificación secuenciales. El grupo de control representa la pureza de CTC no tratada. Barras de error, media ± DE, n = 3. (F) Identificación celular en el chip de aislamiento CTC. Las células LNCaP se tiñeron con Hoechst y Calcein AM, mientras que las células sanguíneas se tiñeron solo con Hoechst. Barra de escala, 100 μm. (G) Pureza de las células tumorales y eficiencia de captura en experimentos de aumento utilizando 1 ml o 10 ml de sangre periférica. Barras de error, media ± DE, n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las células tumorales aisladas se sometieron posteriormente a secuenciación unicelular de alto rendimiento. Nuestro protocolo incorpora un sistema de código de barras de una sola célula que consta de 60.000 micropocillos anidados (Figura 3A-B). Los micropocillos inferiores de forma cuadrada sirven para capturar células individuales, mientras que los micropocillos superiores están diseñados para la carga de perlas. Cada micropocillo inferior mide 25 μm de largo, ancho y alto, adecuado para la mayoría de los tipos de células. Los pocillos hexagonales superiores tienen un diámetro de círculo inscrito y una altura de 50 μm para acomodar perlas que suelen oscilar entre 30 y 50 μm. El sistema mejora la eficiencia de captura celular basada en la captura acumulativa al tiempo que evita los dobletes celulares a través de los micropocillos de exclusión de tamaño. Para optimizar el protocolo de carga de celdas, investigamos la eficiencia de captura de celdas y la relación de ocupación de micropozos en diferentes condiciones de entrada de celdas (Figura 3C). Los resultados mostraron que el aumento de la entrada de células no disminuyó la eficiencia de captura; más bien, mejoró significativamente la tasa de ocupación. Para el chip de captura de 60,000 pocillos, la tasa de ocupación de micropozos se estabilizó cuando la entrada de la celda alcanzó los 80,000, sin mostrar un aumento adicional con la entrada adicional. Para minimizar la aparición de dobletes debido a la carga excesiva de celdas, seleccionamos 80,000 celdas como la entrada óptima. Como se muestra en la Figura 3D, el chip de código de barras de una sola celda logró una relación de ocupación de celdas del 85,6% y una tasa de ocupación de perlas con código de barras del 95,7%, lo que resultó en una tasa de emparejamiento del 81,9%. Además, se realizaron múltiples asentamientos de acuerdo con el protocolo, lo que mejoró significativamente la eficiencia de captura y la tasa de emparejamiento a través del efecto de captura acumulativo (Figura 3D). En particular, la diferencia observada en las relaciones de ocupación entre las células y las perlas se atribuye a la mayor densidad y masa de las perlas en comparación con las células, lo que les permite asentarse de manera más eficiente en los micropozos por gravedad. Por lo tanto, en condiciones de carga optimizadas, generalmente se considera ideal una tasa de ocupación de emparejamiento de aproximadamente el 80%.

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Figura 3: Tecnología de secuenciación y códigos de barras de una sola célula de alto rendimiento basada en micropocillos. (A) Flujo de trabajo del protocolo de secuenciación de CTC único. (B) La microcopia demuestra estructuras microfluídicas de pocillos de captura de perlas unicelulares / con código de barras. Los procesos de captura celular, captura de perlas y recuperación de perlas se muestran de izquierda a derecha. Barra de escala 30 μm. (C) Los gráficos de líneas ilustran la eficiencia de captura celular y la relación de ocupación de micropocillos del chip de código de barras de una sola célula (60000 pocillos dobles) en diferentes condiciones de entrada de células. (D) Tasas de ocupación de celdas y perlas con código de barras en condiciones de entrada de celdas optimizadas, junto con la relación de emparejamiento celda-perla correspondiente. Los paneles izquierdo y derecho muestran el enfoque de captura utilizando múltiples intentos de asentamiento y solo un solo asentamiento, respectivamente. Barras de error, media ± DE, n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Finalmente, para validar el protocolo integrado para la clasificación de CTC y scRNA-seq, mezclamos células PC3, LNCaP y Jurkat en una proporción estimada de 1:3:4000 y las cargamos en los chips microfluídicos para la captura, purificación y secuenciación de células tumorales. A través de la eficiente plataforma de aislamiento de células tumorales, obtuvimos células tumorales positivas para EpCAM de alta pureza (Figura 4B). Al mismo tiempo, el chip scRNA-seq basado en microfluidos demostró una capacidad precisa de perfil de tipo celular, con los resultados visualizados a través del análisis de inclusión de vecinos estocásticos distribuidos (t-SNE) (Figura 4A). Identificamos con éxito tres poblaciones celulares distintas, cada una de las cuales podría distinguirse por marcadores únicos (Figura 4C). Además, las proporciones de celdas en la salida final coincidían estrechamente con las de la entrada purificada, lo que confirma que el proceso de código de barras de una sola célula fue imparcial y libre de contaminación (Figura 4B). Un grupo se identificó como células Jurkat en función de la expresión específica de TRBC1, IGLL1, CD1E y CD3D (Figura 4D). El análisis de enriquecimiento de vías confirmó aún más la solidez de esta clasificación (Figura 4E). Además, las dos líneas celulares de cáncer de próstata se separaron claramente en grupos individuales de acuerdo con genes expresados diferencialmente (DEG) (Figura 4F-G). El grupo de PC3 se caracterizó por una alta expresión de microseminoproteína (MSMP), también conocida como microproteína secretada por PC3. Por otro lado, el grupo LNCaP expresó de forma única marcadores relacionados con la adhesión celular, la proliferación y la pluripotencia, como NEDD4, CTNNA1 (α-catenina 1) y RBBP7.

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Figura 4: Validación de la clasificación de CTC y la secuenciación de una sola célula mediante un experimento de pico. (A) Gráfico t-SNE que muestra el perfil de tipo celular de las células capturadas y purificadas. (B) Gráfico de barras que representa las proporciones de los tres tipos de células en tres etapas: entrada inicial, postpurificación y salida de secuenciación final. (C) Diagrama de puntos que ilustra la expresión de genes marcadores únicos en diferentes grupos celulares. (D) Niveles de expresión de TRBC1, IGLL1, CD1E y CD3D en todas las células. (E) Análisis de enriquecimiento de la vía GO y KEGG de genes expresados diferencialmente (DEG) en el grupo de Jurkat. (F) Patrones de expresión de NEDD4 y MSMP en todas las células. (G) Gráfico volcánico que muestra DEG entre los cúmulos PC3 y LNCaP. Los puntos rojos representan genes regulados al alza en PC3; los puntos azules representan los regulados al alza en LNCaP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Mezcla maestraReactivoDilución finalTipo de búfer
0.5% F-68F-680.50%Agua tratada con DEPC
PBS1×
TE-TWTris-HCl (pH = 8,0)10 mMAgua tratada con DEPC
EDTA1 mM
Interpolación-200.01%
20× TE (pH = 7,5)Tris-HCl (pH = 7,5)200 mMAgua tratada con DEPC
EDTA20 mM
TE-SDSTris-HCl (pH = 8,0)10 mMAgua tratada con DEPC
EDTA1 mM
SDS0.50%

Tabla 1: Composición de la mezcla de reactivos para la preparación de secuenciación de CTC único. Se muestran partes de los reactivos necesarios para scRNA-seq, que se pueden preparar antes de la operación del chip para garantizar un proceso rápido y sin problemas.

Figura complementaria 1: Diseño para el chip HB. (A) Diagrama esquemático de la estructura microfluídica de dos capas. Parte superior: Capa superior con estructura de espiga. Un recuadro ampliado muestra la geometría detallada de la espiga, que está orientada en un ángulo de 45° con respecto a la pared del canal, con un ancho de ranura de 100 μm y un paso de 200 μm. Fondo: Capa inferior compuesta por una matriz de pilares de soporte (28 columnas × 7 filas), numerada de #1 a #28 a lo largo de la dirección del flujo. (B) Vista lateral de la astilla en espiga. Las ranuras en espiga tienen un ancho de 100 μm. Las alturas de las estructuras en espiga y los pilares de soporte son de 50 μm. (C) Vista superior de la astilla en espiga. Cada pilar de soporte mide 500 μm de ancho y 1150 μm de largo, con un espacio de 550 μm entre pilares adyacentes. (D) Fotografía del HB-chip fabricado. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Imagen representativa que muestra células tumorales teñidas con fluorescencia y células sanguíneas presentes en el líquido de desecho recolectado de la salida del chip de aislamiento de CTC. Las células LNCaP se tiñeron con Hoechst y Calcein AM, mientras que las células sanguíneas se tiñeron solo con Hoechst. Barra de escala 100 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria: Secuencias de oligonucleótidos utilizadas en la transcripción inversa y la preparación de bibliotecas Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

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Las CTC sirven como biomarcadores valiosos para el diagnóstico del cáncer, la orientación del tratamiento y los estudios sobre el inicio, la progresión y la metástasis del tumor25. Sin embargo, los métodos de aislamiento de CTC existentes no logran una alta eficiencia y un alto rendimiento26. Además, la baja eficiencia de liberación de las CTC a menudo da como resultado una baja pureza y un alto daño celular, lo que limita su compatibilidad con los análisis posteriores27. Aquí, hemos propuesto un protocolo integrado para la clasificación de CTC de alto rendimiento y la secuenciación de CTC única, que consta de tres procedimientos principales: captura de CTC, purificación y scRNA-seq.

Esta plataforma basada en microfluidos ofrece flexibilidad y escalabilidad. El número de canales paralelos en los chips HB, así como los pocillos de captura en el chip de código de barras, se pueden ajustar de acuerdo con los diferentes requisitos de la muestra, cumpliendo así con las demandas de alto rendimiento. En el chip de captura CTC, los IMB se pueden optimizar de acuerdo con el tipo de cáncer específico. Por ejemplo, en muestras de pacientes con cáncer de próstata, los IMB se pueden funcionalizar con un cóctel de anticuerpos EpCAM y PSMA para mejorar la eficiencia de captura. Además, confiar únicamente en la captura basada en EpCAM puede resultar en la pérdida de CTC mesenquimales que han sufrido una transición epitelio-mesenquimal (EMT). Para abordar este problema, se pueden incorporar anticuerpos adicionales contra la proteína de choque térmico 70 (HSP-70) o la vimentina de la superficie celular (CSV) para capturar CTC en diferentes etapas de EMT.

Dado que los chips HB para la captura y purificación de CTC se basan en microfluídica, es esencial un manejo cuidadoso durante los experimentos. Antes de introducir reactivos en la entrada de viruta, se deben eliminar todas las burbujas de aire y tanto la entrada como la salida se pueden sellar para eliminar el aire atrapado. Además, los reactivos deben introducirse rápidamente (dentro de 1-2 s), ya que las burbujas de aire atrapadas pueden obstruir el paso de IMB y celdas, lo que reduce significativamente la eficiencia y la pureza de la captura. Además, como se mencionó anteriormente, la distribución uniforme de los IMB es fundamental para la captura exitosa de CTC. Después de cargar los IMB, el chip debe colocarse verticalmente sobre el imán y fijarse en su posición durante al menos cinco minutos para evitar que los cambios en el campo magnético interrumpan la distribución de IMB. En particular, el caudal de carga celular especificado en el protocolo debe optimizarse en función de diferentes tipos de muestras. Por ejemplo, las muestras de leucocitos exhiben niveles elevados de concentración y viscosidad de leucocitos. Si el caudal es demasiado rápido, puede dificultar las interacciones eficientes entre CTC e IMB, evitando la captura magnética acumulada y, por lo tanto, reduciendo la pureza de CTC. Para evaluar el rendimiento de nuestra plataforma de aislamiento y purificación de CTC en el procesamiento de muestras de sangre clínicas, recolectamos PB de varios donantes sanos y agregamos una pequeña cantidad de células LNCaP (aproximadamente 50-100 células por ml) en las muestras. En particular, aunque la plataforma exhibió una alta eficiencia de captura y pureza para las células tumorales en muestras de PB, su rendimiento fue ligeramente inferior al observado en las muestras de células basadas en PBS (Figura 2D, Figura 2E y Figura 2G). Especulamos que esta discrepancia se debe a la mayor viscosidad de la sangre y a la presencia de abundantes glóbulos rojos y plaquetas en comparación con el PBS. Por lo tanto, al manipular muestras de sangre clínicas, se pueden considerar los pasos previos al tratamiento, como la lisis de glóbulos rojos o la extracción de PBMC, para mejorar el rendimiento.

Al igual que los chips HB, el chip de código de barras de una sola célula basado en microfluidos requiere un manejo cuidadoso para evitar la formación de burbujas de aire. Dada la variedad de reactivos involucrados, algunos reactivos se pueden preparar previamente antes de iniciar las operaciones de chip (Tabla 1). Al cargar celdas y perlas, es necesario un control cuidadoso de la velocidad de inyección para garantizar una distribución uniforme, ya que las celdas tienen una densidad más baja mientras que las perlas con código de barras son más densas. Por lo general, la suspensión celular debe agregarse lentamente durante 3 ~ 5 s, seguida de la adición rápida de la suspensión de perlas dentro de 1 ~ 2 s. Después de cargar las celdas y las perlas, realice dos rondas de aspiración y dispensación, luego coloque el chip en un agitador para completar el proceso de captura acumulativa. Este paso es fundamental para mejorar la tasa de ocupación y la tasa de emparejamiento. Durante la lisis celular, se utiliza un método de sellado de aceite para aislar las superficies de los micropocillos, evitando la contaminación cruzada entre pocillos. En particular, el aceite mineral debe agregarse inmediatamente después de la lisis sin demora. Después de la lisis, la recuperación de perlas con código de barras se realiza moviendo lentamente el imán desde la entrada hasta la salida para garantizar una alta tasa de recuperación de perlas. Si es necesario, este paso se puede repetir varias veces. Finalmente, las perlas magnéticas recuperadas en el tubo de centrífuga se someten a RT, síntesis de segunda hebra, amplificación por PCR y construcción de bibliotecas, seguidas de secuenciación de próxima generación (NGS).

Esta plataforma microfluídica integrada tiene un potencial significativo para aplicaciones clínicas. Al mejorar la eficiencia y el rendimiento del aislamiento de CTC, aumenta la detección de CTC en etapas de baja carga tumoral, lo que permite el establecimiento de un modelo de clasificación que vincula el recuento de CTC con la estadificación tumoral. Este avance proporciona un enfoque novedoso para el diagnóstico del cáncer, el seguimiento del tratamiento, la evaluación del pronóstico y la predicción de la recurrencia. Además, el análisis transcriptómico unicelular de CTC permite la identificación de características moleculares clave, incluidas las vías genéticas esenciales, las redes de interacción y los genes biomarcadores. Este análisis proporciona información sobre los factores críticos que impulsan la metástasis temprana del cáncer y revela los mecanismos moleculares subyacentes a la formación de lesiones metastásicas, ofreciendo posibles objetivos terapéuticos para pacientes con cáncer recurrente o metastásico. Además, esta plataforma es altamente escalable. Se puede adaptar para cumplir con requisitos analíticos específicos y expandirse para admitir análisis multiómicos, incluida la transcriptómica y la genómica.

Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant Nos. 82227801).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Mercaptopropilo) trimetoxisilano Sigma Aldrich175617-100GSolución MPTS
20 y más veces; SSC BufferSangon BiotechB548109-0200
5 y veces; Búfer RTSangon BiotechB610020-0500
Anticuerpo monoclonal biotinilado CD45eBiociencia13-0459-82Almacenamiento a 2°Deg; De Do a 8º y £; C 
Anticuerpo monoclonal EpCAM biotiniladoeBiociencia13-9326-82Almacenamiento a 2°Deg; De Do a 8º y £; C 
Albúmina sérica bovina (BSA)Sangon BiotechA600332-0100Almacenamiento a 2°Deg; De Do a 8º y £; C 
Chip de cartucho DECODIFICADORBiosistemas Dinámicos2203106Almacenamiento a 2°Deg; De Do a 8º y £; C 
Kits de reactivos de cartucho DECODERBiosistemas Dinámicos2203206Almacenamiento a 2°Deg; De Do a 8º y £; C 
Agua tratada por DEPCSangon BiotechB501005-0500
D-PBSSangon BiotechE607009-0500Contiene: NaCl 136,89 mM; KCl 2,67 mM; Na2HPO4 8,10 mM; KH2PO4 1,47 mM. pH=7.2-7.4 
DTTTermo CientíficaR0861Almacenamiento a 2°Deg; De Do a 8º y £; C 
Dynabeads MyOne SA T1Invitrogen65602SA-MBs, 1 y mu; m
EDTASangon BiotechB540625-05000,5 M, pH=8,0
KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKK26012 y veces; Mezcla de Reacción PCR
Soln de precipitación de cloruro de litio.InvitrogenAM94800.2 & micro; Filtrado por m
Éster de N-γ-maleimidobutiril-oxisuccinimidaTermo Científica22309Solución GMBS
Pluronic F-68Sangon BiotechA600749-0025
Qubit 1 y veces; Kit de análisis HS dsDNATermo CientíficaP33231
Solución SDSSangon BiotechB648118-010010% SDS
EstreptavidinaSigma Aldrich189730Almacenamiento a 2°Deg; De Do a 8º y £; C 
Fotorresist SU-8MicroquímicaSU-8 3050
Kit de elastómeros de silicona SYLGARD 184Dow Corning4019862
Tris-HCl (pH 7,5)LEAGENENR00721 mol/L, pH=7,5, RNasa libre
Tris-HCl (pH 8.0)LEAGENENR00731 mol/L, pH=8,0, libre de RNAS
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
Trueprep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina VazymeTD502Kit de preparación de biblioteca de ADN
Preadolescente-20Sangon BiotechA600560-0500
Cuentas limpias de ADN VAHTSVazymeN411Perlas magnéticas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) para purificación del ADN

References

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