Metabolómica espacial multimodal con imágenes de espectrometría de masas guiada por microscopio de infrarrojo medio

Resumen

Presentamos un flujo de trabajo metabolómico espacial multimodal que integra imágenes de espectrometría de masas (MSI) e imágenes de infrarrojo medio (MIR) en la misma sección de tejido para análisis metabólicos y bioquímicos resueltos espacialmente.

Resumen

La metabolómica espacial es un campo en rápida evolución para mapear la distribución de metabolitos dentro de tejidos, órganos e incluso células individuales. Este enfoque proporciona información metabólica contextual, que es fundamental para comprender la heterogeneidad bioquímica de los sistemas biológicos. Las imágenes de infrarrojo medio (MIR) y las imágenes de espectrometría de masas (MSI) se han convertido en enfoques poderosos para la metabolómica espacial, cada uno de los cuales ofrece ventajas únicas y complementarias. En este estudio, presentamos un flujo de trabajo para realizar imágenes MIR y desorción láser asistida por matriz MSI (MALDI-MSI) en la misma sección de tejido, que abarca procedimientos experimentales, co-registro de imágenes, integración de datos y análisis bioinformático. Las imágenes MIR se emplean como modalidad ascendente, lo que permite el análisis bioquímico no destructivo de los tejidos. Posteriormente, se deposita una matriz en el tejido para MALDI-MSI, guiada por la información espacial obtenida de las imágenes MIR. Las imágenes se integran después del registro conjunto, lo que permite el análisis metabolómico espacial multimodal utilizando herramientas bioinformáticas avanzadas como Seurat. La integración de las imágenes MIR y MSI representa un avance transformador en la metabolómica espacial, que ofrece oportunidades sin precedentes para explorar la complejidad espacial y química de los procesos metabólicos tanto en la salud como en la enfermedad. Este enfoque multimodal tiene un potencial significativo para impulsar innovaciones en el descubrimiento de biomarcadores, el diagnóstico de enfermedades y el desarrollo terapéutico.

Introducción

La metabolómica espacial implica el mapeo de metabolitos dentro de su contexto tisular nativo mediante la integración de imágenes de espectrometría de masas (MSI) u otras técnicas resueltas espacialmente, con análisis metabólico, lo que ofrece información sobre el metabolismo en resolución subtisular, celular o subcelular 1,2,3,4,5,6,7,8 . Entre estas modalidades de imagen, la microscopía de infrarrojo medio (MIR) está ganando cada vez más atención por su capacidad para mapear químicamente biomoléculas basadas en el contraste vibracional molecular 4,7,9,10,11,12. La naturaleza no destructiva, sin etiquetas, de alta velocidad y rentable 4,7,9,10,11,12 hace que las imágenes MIR sean particularmente adecuadas para la integración con MSI, formando un enfoque multimodal prometedor para el análisis espacial integral.

La ionización por desorción láser asistida por matriz MSI (MALDI-MSI) es una de las técnicas más utilizadas en metabolómica espacial (Figura 1A)¹³. Permite la detección de una amplia gama de metabolitos, incluidos lípidos, aminoácidos, azúcares, nucleótidos y metabolitos secundarios, con alta sensibilidad¹. Los avances en la selección de matrices (p. ej., ácido 2,5-dihidroxibenzoico [DHB], 9-aminoacridina [9AA] o N- (1-naftil) diclorhidrato de etilendiamina [NEDC]) y técnicas de ionización (p. ej., métodos posteriores a la ionización) han ampliado aún más la cobertura de detección, particularmente para especies de baja abundancia y poco ionizables¹⁴. Los sistemas modernos MALDI-MSI admiten velocidades de imagen que suelen oscilar entre 5 y 50 píxeles por segundo, según la resolución espacial y el tipo de analizador de masas utilizado (por ejemplo, tiempo de vuelo [TOF], Orbitrap o resonancia de ciclotrón de iones por transformada de Fourier [FT-IRC]). En particular, los instrumentos MALDI-TOF de alta velocidad han alcanzado velocidades superiores a 100 píxeles por segundo, lo que permite obtener imágenes de gran área en unas pocas horas¹⁵. La resolución espacial de MALDI-MSI generalmente se encuentra entre 5 y 50 μm, suficiente para resolver estructuras celulares e incluso subcelulares ^16,17. Sin embargo, una mayor resolución espacial generalmente tiene el costo de tiempos de adquisición más largos, una relación señal-ruido reducida y mayores demandas computacionales durante el procesamiento de datos.

A diferencia de MSI, las imágenes MIR son un enfoque óptico de campo amplio⁴, lo que lo hace inherentemente no destructivo y de alto rendimiento. Los avances recientes en láseres de cascada cuántica de alta potencia (QCL) permiten un nuevo marco conocido como imágenes infrarrojas de frecuencia discreta (DFIR), que aumentan significativamente la velocidad de imagen hasta la velocidad de video (Figura 1B)^12,18. Además, las fuentes de QCL han hecho que los detectores microbolómetros no refrigerados sean viables para la obtención de imágenes MIR, lo que permite el uso de detectores de matriz de plano focal (FPA)^{más grandes 12}. Como resultado, se puede adquirir una imagen MIR de frecuencia única en un área de 1 cm² con resolución celular (~ 5 μm) en solo unos segundos. Las imágenes MIR pueden funcionar tanto en modo sin etiquetas como en modo etiquetado. En estudios previos ^4,19,20, se han introducido pequeñas sondas vibratorias IR activas para monitorear la cinética de diversas actividades metabólicas in situ. Estas sondas permiten el seguimiento en tiempo real de las vías metabólicas al informar de las transformaciones químicas globales a través de bandas espectrales MIR únicas⁴. Por lo tanto, las imágenes MIR proporcionan perfiles bioquímicos estáticos y monitoreo metabólico dinámico con alta resolución espacial y velocidad de adquisición rápida.

En este manuscrito, presentamos un flujo de trabajo integral para realizar metabolómica espacial MALDI-MSI guiada por MIR, demostrando la viabilidad de adquirir ambas modalidades a partir de la misma muestra (Figura 2, Figura 3). Al integrar las imágenes MIR con MSI, establecemos un enfoque multimodal que aprovecha las fortalezas complementarias de cada técnica. Las imágenes MIR ofrecen un mapeo bioquímico rápido y sin etiquetas de todo el portaobjetos a resolución celular, lo que sirve como una guía valiosa para la selección de la región de interés (ROI) en la posterior adquisición de MSI. Esta estrategia permite un flujo de trabajo MSI más específico y eficiente, reduciendo el tiempo y el costo de adquisición al tiempo que mejora la interpretabilidad y la relevancia biológica de los datos metabolómicos espaciales. A su vez, MSI proporciona anotaciones moleculares altamente detalladas de las imágenes hiperespectrales MIR, lo que permite una comprensión más profunda de la bioquímica de los tejidos. En general, este enfoque integrado tiene un gran potencial para avanzar en el descubrimiento de biomarcadores, el diagnóstico de enfermedades y el desarrollo terapéutico.

Protocolo

El protocolo se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo experimental con animales (DSF-2024-004) aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro de Recursos para Animales de Laboratorio de la Universidad de Fudan.

NOTA: Este estudio proporciona un flujo de trabajo para realizar imágenes MIR y MALDI-MSI en la misma sección de tejido. Este enfoque integrado abarca procedimientos experimentales, co-registro de imágenes, fusión de datos y análisis bioinformático posterior (Figura 1C). Las imágenes MIR se utilizan como modalidad ascendente, lo que permite un mapeo bioquímico no destructivo y sin etiquetas del tejido. Guiado por la información espacial de las imágenes MIR, se aplica posteriormente una matriz para la adquisición de MALDI-MSI. Después de un co-registro preciso, los conjuntos de datos se integran para el co-análisis multivariado (Figura 4), lo que permite una metabolómica espacial integral a través de herramientas computacionales avanzadas.

1. Preparación de la muestra

1. Preparación de muestras de tejido
   1. Recolección de tejido de ratón
      1. Ratones domésticos C57BL / 6J (20 semanas de edad, 40 g) en condiciones específicas libres de patógenos (SPF), mantenidos en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h y provistos de acceso ad libitum a alimentos y agua para garantizar una salud óptima antes del experimento.
      2. Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico a una dosis de 50 mg/kg de peso corporal para asegurar una anestesia profunda. Monitorizar al animal y confirmar la ausencia de reflejos pedales y corneales antes de proceder a la perfusión.
      3. Perfunda aproximadamente 20-30 ml de PBS frío que contenga heparina (5 UI/ml) a través del ventrículo izquierdo a una presión controlada de 150 mmHg durante 6 min para eliminar la sangre y desangrar el órgano antes de la extracción.
      4. Apague inmediatamente todos los tejidos recolectados con nitrógeno líquido y guárdelos a -80 °C para su posterior análisis.
         NOTA: La congelación rápida es esencial para evitar la formación de cristales de hielo, que pueden distorsionar la morfología del tejido.
   2. Inclusión de tejidos y criosección
      1. Ajuste el micrótomo a -20 °C y descontamine la cámara y la cuchilla con etanol (EtOH) para eliminar el medio de inclusión residual. Deje que los portaobjetos CaF₂ , el sobre de portaobjetos, el portamuestras y la muestra de tejido se equilibren dentro del criostato.
      2. Recorte el tejido a aproximadamente 5 mm × 5 mm × 3 mm. Insértelo en gelatina al 10% dentro de un criopoldo estándar a -20 °C, asegurando la orientación adecuada para el seccionamiento. Congele rápidamente la muestra incrustada en hielo seco y guárdela a -80 °C hasta la criosección.
      3. Extraiga el tejido de su molde, recorte el exceso de material para optimizar el corte y fíjelo al portamuestras con agua ultrapura para garantizar una adhesión estable.
      4. Corte secciones de 10 μm de espesor e inmovilice las secciones sobre sustratos de CaF₂ prerecubiertos y guárdelas a -80 °C.
      5. Coloque las secciones de tejido montadas en un liofilizador al vacío antes de obtener imágenes en el infrarrojo medio. Ajuste la presión de la cámara a 0,1 mPa y la temperatura a -100 °C. Seque las muestras durante 30 min.
2. Preparación de muestras celulares
   1. Sembrar 1,25 × 10 células HeLa de⁵ en sustratos circulares de CaF₂ de 13 mm de diámetro colocados en placas de cultivo estándar. Use Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con alto contenido de glucosa suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina. Incubar las células en condiciones de cultivo estándar (37 °C, 5% CO₂) durante 24 h.
   2. Después de 24 h, retire con cuidado el medio y fije las células incubándolas en paraformaldehído (PFA) al 4% disuelto en tampón PBS durante 20 min a temperatura ambiente (RT).
   3. Enjuague las celdas fijas tres veces con tampón HBSS, luego lávelas tres veces más con ddH₂O.
   4. Seque al aire los sustratos de CaF₂ completamente a temperatura media antes de proceder a la obtención de imágenes MIR.

2. Adquisición de imágenes multimodales

1. Adquisición de imágenes MIR con láser de cascada cuántica (QCL)
   1. Realice microscopía de imágenes QCL MIR utilizando un microscopio QCL-MIR equipado con un microbolómetro refrigerado por líquido 520 × 480 que no_{sea N 2}, detector de matriz de plano focal (FPA) y tecnología de reducción de coherencia espacial.
   2. Seleccione el rango espectral de 950 ^cm-1 a 1800 ^cm-1.
   3. Utilice un objetivo de 4× con una apertura numérica (NA) de 0,6, lo que da como resultado un tamaño de píxel nominal de 4,25 μm.
   4. Recopile un espectro de fondo en un sustrato limpio de CaF₂ con una resolución espectral ^{de 4 cm-1} .
   5. Seleccione el área de adquisición en función de la morfología del tejido y recopile datos espectrales con una resolución espectral de 4 ^cm-1. A esta resolución espectral, la velocidad de adquisición de imágenes es de aproximadamente 0,3 mm²/s.
      NOTA: Todas las mediciones se realizan en modo de transmisión utilizando portaobjetos CaF₂ , con ajuste de enfoque manual.
2. Adquisición de imágenes por espectrometría de masas
   1. Aplicación de matriz
      1. Utilice las secciones de tejido post-MIR para MALDI-MSI, aplique marcadores de fiducial alrededor del tejido con un bolígrafo Tippex y capture una imagen óptica pre-MSI con un escáner plano para el registro de imágenes.
      2. Prepare la matriz NEDC a 7 mg/ml en metanol/acetonitrilo/agua desionizada (V/V/V=75:25:5), luego filtre a través de una membrana de 0,2 μm para eliminar las partículas.
      3. Cargue los portaobjetos de tejido marcados en un rociador de matriz automatizado. Dispense la matriz NEDC sobre la muestra utilizando los parámetros predefinidos.
   2. Medición MALDI-MSI
      1. Deposite 0,2 μl de suspensión de fósforo rojo en el portaobjetos CaF₂ para que sirva como estándar de calibración de masa externo.
      2. Asegure la corredera recubierta de matriz en el adaptador de la corredera, asegurando un contacto eléctrico óptimo con el soporte. Cargue la placa en un sistema MALDI-MSI.
      3. Alinee la imagen óptica del portaobjetos con las coordenadas del motor XY de la platina MALDI utilizando marcadores de referencia. Defina ROI para el análisis de tejidos e incluya un área de "solo matriz" como control negativo.
      4. Configure el instrumento en modo de iones negativos con un tamaño de píxel de 20 × 20 μm², cubriendo un rango m /z de 50-1000. Realice la calibración de masa utilizando el punto de fósforo rojo antes de iniciar la adquisición de datos. Realice la adquisición de datos utilizando una plataforma comercial de análisis de datos.

3. Preprocesamiento y análisis de datos de imágenes

NOTA: Los códigos personalizados de MATLAB se cargan como Archivo complementario 1.

1. Preprocesamiento y análisis de datos QCL-MIR
   1. Preprocesamiento de datos
      1. Exporte datos hiperespectrales en un formato apropiado para su posterior análisis.
      2. Realice el preprocesamiento de datos con CytoSpec y MATLAB, siguiendo estos pasos 3.1.1.3-3.1.1.8
      3. Importe los datos espectrales MIR en CytoSpec v2.00.07 para su preprocesamiento.
      4. Evalúe la calidad espectral utilizando el módulo de pruebas de calidad integrado en CytoSpec. Seleccione el criterio 2 (espesor de la muestra) para evaluar la consistencia de la muestra. Establezca el rango de integración espectral en 950-1800 ^cm-1. Defina los umbrales de absorbancia entre 50 y 1000 unidades para excluir espectros de regiones que son excesivamente delgadas o gruesas.
      5. Reduzca el ruido mediante el filtrado basado en PCA en CytoSpec. Conserve los primeros 10 componentes principales (PC) para eliminar el ruido de alta frecuencia y preservar la variación bioquímica clave.
      6. Exporte los datos espectrales preprocesados de CytoSpec en formato .mat para su posterior análisis en MATLAB.
      7. Realice la corrección de la línea de base en MATLAB utilizando un algoritmo de corrección de banda elástica en el rango espectral de 950-1800 ^cm-1 para eliminar la deriva de la línea de base y mejorar la precisión espectral.
      8. Aplique la normalización espectral utilizando la escala mínima-máxima en el mismo rango espectral para estandarizar las intensidades en todos los espectros y garantizar la comparabilidad en todo el conjunto de datos.
   2. Análisis de datos
      1. Identificar características asociadas a proteínas a 1.550 ^cm-1 y 1.650 ^cm-1, correspondientes a las bandas de amida II y amida I, respectivamente. Identifique las características asociadas a los lípidos a 1.740 ^cm-1, que representan la vibración de estiramiento del éster C = O.
      2. Calcule la relación de intensidad de la banda de amida I (1650 ^cm-1) con el estiramiento de éster C = O (1740 ^cm-1) y genere mapas de relación para visualizar la distribución espacial de lípidos a proteínas.
      3. Análisis de clústeres no supervisado: Realice un análisis de clústeres jerárquicos (HCA) en datos hiperespectrales utilizando la distancia euclidiana y el enlace de Ward para clasificar regiones en función de la similitud espectral. Genere mapas de clústeres para identificar regiones bioquímicamente distintas y revelar diferencias estructurales o patológicas.
2. Preprocesamiento y análisis de datos MSI
   1. Importe los datos MSI sin procesar a una plataforma comercial de análisis de datos.
   2. Realice picos de picking con una intensidad relativa > 0,01%.
   3. Excluya los picos derivados de la matriz de la lista de picos experimentales comparándolos con el espectro obtenido de una región de control solo de matriz. Elimine los picos que aparecen en el espectro de control y que tengan una relación señal/ruido (SNR) inferior a 3.
   4. Normalice el conjunto de datos a la raíz cuadrada media (RMS) para tener en cuenta la variabilidad en la intensidad de la señal de iones entre píxeles y muestras.
   5. Refinar la identificación de metabolitos filtrando las características en función de su distribución tisular, coincidir con las entradas en la base de datos de metabolomas humanos (HMDB) y concordar con los valores teóricos m / z.
   6. Seleccione los metabolitos relevantes en función de los objetivos experimentales y el contexto del tejido.
   7. Exporte las intensidades de las entidades seleccionadas para todos los píxeles como un archivo CSV.
   8. Aplicar técnicas de reducción de dimensionalidad (por ejemplo, PCA, t-SNE o UMAP) para reducir la complejidad de los datos e identificar grupos de píxeles con firmas metabólicas similares utilizando herramientas bioinformáticas como Seurat y Banksy, facilitando la visualización de la heterogeneidad metabólica espacial.

4. Co-registro y co-análisis de imágenes multimodales

1. Seleccione la imagen MIR adquirida a 1650 ^cm-1 como referencia espacial para el registro conjunto. Este número de onda específico resalta la banda de proteína amida I, ofreciendo un fuerte contraste tisular.
2. Normalice los valores de intensidad de las imágenes MIR y MSI para mejorar la comparabilidad visual. Aplique técnicas de mejora del contraste, como la ecualización del histograma mediante la función histeq en MATLAB, para redistribuir las intensidades de la imagen y mejorar la visibilidad de las características estructurales críticas para la selección de puntos de referencia.
3. Cargue las imágenes MIR y MSI en MATLAB mediante la función cpselect de Image Processing Toolbox. Esta función abre una interfaz interactiva para la selección de puntos de referencia.
4. Anote manualmente de cinco a diez puntos de control anatómicamente relevantes y bien distribuidos en las imágenes MIR y MSI utilizando la función cpselect . Estos puntos de referencia deben corresponder a características morfológicas distintas, como los límites de los tejidos.
   NOTA: Distribuya los puntos de control uniformemente en el campo de la imagen para minimizar la distorsión localizada.
5. Exporte y registre las coordenadas de los puntos de control anotados de ambas imágenes. Guárdelos como dos matrices coincidentes para el cálculo de transformación (por ejemplo, movingPoints y fixedPoints).
6. Calcule una matriz de transformación afín mediante la función fitgeotrans de MATLAB en modo afín . Esta transformación tiene en cuenta el escalado, la rotación, la traslación y la distorsión.
7. Aplique la transformación calculada a la imagen MSI mediante la función imwarp en MATLAB. Este paso genera una imagen MSI registrada espacialmente que está alineada geométricamente con el marco de referencia MIR.
8. Inspeccione visualmente la alineación utilizando la función imshowpair en el modo de fusión para superponer las imágenes MSI y MIR y confirmar el registro correcto de las características estructurales.
9. Convierta tanto la imagen MSI registrada como la imagen MIR de referencia en máscaras binarias mediante la función imbinarize en MATLAB.
10. Calcule el coeficiente de similitud de dados (DSC) para cuantificar la superposición espacial entre las dos máscaras binarias. La LLSD se define como: LLSD = 2 × (Área de superposición)/(Área total de ambas máscaras). Un valor de LLSD cercano a 1,0 indica una alta superposición espacial y precisión de registro.
    NOTA: Si es necesario, refine el registro ajustando el número o la ubicación de los puntos de control y repitiendo el proceso de transformación. Considere métodos de registro no rígidos si persisten las desalineaciones locales.
11. Guarde la imagen registrada, los parámetros de transformación y las coordenadas de puntos de referencia para el análisis de imágenes multimodales aguas abajo, como la correlación espacial de características bioquímicas y estructurales.

Resultados

Para validar la estrategia metabolómica espacial multimodal descrita anteriormente, la implementamos en un modelo de ratón de cáncer. Las células tumorales se modificaron genéticamente para expresar la proteína verde fluorescente (GFP), lo que permitió una localización precisa de la región tumoral a través de imágenes de fluorescencia. La Figura 2A muestra los resultados de imágenes QCL-MIR sin etiquetas con una cobertura espectral de 950-1800 ^cm-1, conocida como "región de huella...

Discusión

Aquí, presentamos una estrategia metabolómica espacial multimodal que integra imágenes MSI y MIR para permitir un perfil metabólico molecularmente específico de alto rendimiento en las mismas muestras. Las imágenes MIR permiten un mapeo químico no destructivo y sin etiquetas basado en vibraciones moleculares, proporcionando información detallada de grupos estructurales y funcionales. Por el contrario, MSI ofrece alta sensibilidad y especificidad para la identificación y cuantificación de...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4% Paraformaldehído, solución de fijación tisular	Sangon Biotech
Albúmina sérica bovina	Sigma Aldrich	126615
C57BL/6JNifdc ratones	Charles River	219
CaF2 portaobjetos	Crystran	CAFP25-1
Ccriostato microtomo	Dakewe Biotech	CT520
Cytospec	Peter Lasch	Versión 2.10.01	Software para el análisis de datos MIR, incluida la corrección de la línea de base, la normalización, la generación de imágenes y el análisis hiperespectral.
Tampón DPBS	Fisher Scientific	14-190-250
Suero fetal bovino	Gibco	10270106
Liofilizadores	LABCONCO	FreeZone
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	Tipo A, de
tampón HBSS	Sangon Biotech
DMEM con alto contenido de glucosa	ThermoFisher Scientific
Software Matlab	MathWorks	Matlab R2024a	para el análisis de datos MIR, incluida la corrección de la línea de base, la normalización, la generación de imágenes y el análisis hiperespectral.
Sistema de imágenes de espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-MSI)	Bruker Daltonics GmbH	timsTOF fleX MALDI-2
Metanol	Sinopharm Reactivo	químico 10014108
Instituto de Entomología mMass, Centro de Biología de la Academia Checa de Ciencias, República Checa	Versión 5.5.0		Softwares para el análisis de datos MSI. Importe los datos MSI sin procesar en SCILS Lab para su preprocesamiento. Realice picos de picking en mMass con una intensidad relativa > 0,01%.
Matriz de diclorhidrato de etilendiamina (NEDC) N-(1-naftilo)	Sigma Aldrich	222488
Penicilina-estreptomicina	ThermoFisher Scientific
Microscopía de infrarrojo medio (QCL-MIR) con láser en cascada cuántica	Bruker Optics GmbH	LUMOS II ILIM
Fósforo rojo	Sigma-Aldrich	8.0727
SCiLS Lab	Bruker Daltonics	SCiLS Lab 2024b	Softwares para el análisis de datos MSI. Importe los datos MSI sin procesar en SCILS Lab para su preprocesamiento. Realice picos de picking en mMass con una intensidad relativa > 0,01%.
Pulverizador	HTX Technologies	TM
Tripsina, 0.25% EDTA	ThermoFisher Scientific