Mejora de la tecnología de vesículas extracelulares con receptor de antígeno quimérico (CAR-EV): el futuro de la terapia contra el cáncer

Resumen

La aplicación terapéutica de vesículas extracelulares (EV) tiene el potencial de revolucionar el tratamiento del cáncer y la administración de fármacos. Las EV derivadas de células del receptor de antígeno quimérico (CAR) aisladas mediante cromatografía de intercambio iónico muestran una mayor capacidad de carga, lo que mejora significativamente su eficacia funcional. Este estudio caracteriza aún más los CAR-EV para dilucidar su actividad biológica y potencial terapéutico.

Resumen

Las terapias con células CAR han avanzado significativamente en el tratamiento personalizado para varias neoplasias hematológicas. Actualmente, siete productos de células CAR-están aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y seis por la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) para tratar el linfoma, el mieloma múltiple y la leucemia linfocítica crónica. Siguen existiendo varios desafíos y limitaciones, siendo el síndrome de liberación de citoquinas (CRS) y el síndrome de neurotoxicidad asociada a células efectoras inmunitarias (ICANS) los más significativos. Las terapias libres de células, como los CAR-EV, ofrecen ventajas sustanciales sobre sus contrapartes celulares. Estos incluyen una mayor infiltración tumoral y la posibilidad de repetir la administración al tiempo que se minimizan los riesgos de CRS, ICANS y otros efectos secundarios adversos. Además, la potencia de los CAR-EV se puede ajustar mediante la ingeniería de la inclusión de agentes citotóxicos y ácidos ribonucleicos (ARN) modificadores de la función. En este documento, informamos sobre el desarrollo de una plataforma CAR-EV escalable para producir CAR-EV sintonizables. Esta plataforma incluye la ingeniería y el preacondicionamiento de células productoras de VE (por ejemplo, células CAR-T y CAR-natural killer (CAR-NK)), el aislamiento y el enriquecimiento de CAR-EV utilizando una plataforma de cromatografía de intercambio iónico de grado (IEX) de grado de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP), análisis de subpoblaciones de VE de alto rendimiento totalmente automatizado e in vitro evaluación de la actividad citotóxica funcional de CAR-EV. La plataforma ha sido validada utilizando CAR-NK-EV y CAR-T-EV para líneas celulares hematológicas y de tumores sólidos. La plataforma CAR-EV representa un enfoque prometedor para el rápido desarrollo de CAR-EV terapéuticos listos para usar adaptados a indicaciones específicas de enfermedades, con el potencial de reducir los efectos secundarios adversos asociados con las terapias basadas en células CAR.

Introducción

Las terapias basadas en células CAR han sido aprobadas para el tratamiento de neoplasias hematológicas, sin embargo, persisten desafíos y limitaciones significativas¹. En particular, los riesgos de CRS e ICANS siguen siendo factores críticos al evaluar la idoneidad del paciente para la terapia con CAR, lo que subraya la necesidad de avances continuos en las estrategias de tratamiento².

Las VE derivadas de células CAR (CAR-EV) han surgido como una opción terapéutica alogénica más eficaz y potencialmente más segura. Estas VE ofrecen varias ventajas, como la reducción de la inmunogenicidad, el menor riesgo de SRC, la mejora de la infiltración tumoral, la idoneidad para la repetición de la dosificación, el potencial de terapias combinadas, así como la eficiencia de los procesos de producción y almacenamiento³. Las VE de origen biológico se pueden diseñar para expresar moléculas dirigidas al cáncer que se unen con alta afinidad a receptores de superficie específicos en las células cancerosas. Una vez modificados, estos vehículos eléctricos de diseño presentan una estrategia prometedora para administrar carga terapéutica de forma selectiva, con el potencial de minimizar los efectos fuera del objetivo. Derivados de las células CAR, estos VE armados exhiben propiedades funcionales mejoradas que permiten una administración terapéutica más precisa y potente. Sus características inherentes confieren múltiples ventajas que contribuyen colectivamente a mejorar la eficacia del tratamiento.

Dos obstáculos principales para el uso efectivo de VE en la clínica son la escala y la eficacia. Las metodologías delineadas en este documento exhiben una escalabilidad inherente y son fácilmente adaptables a través de un amplio espectro de paradigmas experimentales. La ampliación de la producción de vehículos eléctricos a la fabricación de grado clínico es un área de desarrollo activo, pero requiere una mayor optimización para generar cantidades suficientes de material de grado clínico⁴. Es importante destacar que estudios recientes han demostrado enfoques prometedores para mejorar la eficacia de las EV, como el preacondicionamiento de las células madre con interleucinas (p. ej., IL-7, IL-15, IL-21) y la generación de EV en condiciones hipóxicas (1-2% O₂) ^5,6,7.

El objetivo de este estudio fue investigar el potencial terapéutico de los CAR EV dirigidos al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y al receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) in vitro, utilizando células de cáncer de mama MCF-7 y células de leucemia mieloide K562. Los VE se aislaron y enriquecieron a partir de medios acondicionados por células (CM) CAR a través de IEX, se caracterizaron mediante seguimiento de nanopartículas y análisis de Western blot, y se sometieron a ensayos funcionales. Los CAR EV que contienen carga citotóxica endógena indujeron eficazmente la muerte celular in vitro. Los datos obtenidos establecen la viabilidad de la producción escalable de VE dirigida para aplicaciones terapéuticas.

Protocolo

NOTA: Manipule todas las células vivas dentro de un gabinete certificado de bioseguridad de nivel 2 (BSL-2) con el EPP adecuado (p. ej., guantes, batas de laboratorio). Los materiales de riesgo biológico, como los gránulos celulares que contienen células vivas, deben descontaminarse con una solución final de hipoclorito de sodio (lejía) al 10%.

1. Cultivo celular y recolección de CM

1. Cultivo de células CAR
   NOTA: Aunque las células CAR transducidas por lentivirus utilizadas en este estudio se han subcontratado, el protocolo sigue siendo aplicable a las células CAR-T/NK generadas internamente mediante técnicas estándar de ingeniería celular.
   1. Mantener las células CAR/NK/T en cultivo libre de xenocultivos (medio de crecimiento suplementado con 100 UI/ml de IL-2) a una densidad de 0,5-1 x 10⁶/ml, en una cámara humidificada a 37 °C (5% de CO₂, 21% de O₂). Monitoree cada 2-3 días y limite los recuentos de celdas a 3 veces por semana debido a las limitaciones de capacidad de paso.
   2. Confirme la expresión de CAR mediante microscopía, asegurándose de que las células sean fluorescentes (si se etiquetan adecuadamente). Las células en grupos sanos son indicativas de un cultivo celular CAR robusto.
2. Colección CM
   1. Una vez que los cultivos celulares alcancen el 80% de confluencia, evalúe la viabilidad celular y determine la densidad de células vivas mediante el análisis automatizado de recuento celular azul de tripano.
   2. Centrifugar las células a 300 × g (temperatura ambiente) durante 5 min para formar un gránulo.
   3. Recoger cuidadosamente el sobrenadante y centrifugar a 3.000 × g durante 10 min a 4 °C para aclarar.
   4. Almacene el CM clarificado a -80 °C hasta que esté listo para el enriquecimiento de EV.

2. Aislamiento y enriquecimiento de vehículos eléctricos

NOTA: Los siguientes métodos describen dos enfoques para el enriquecimiento de vesículas extracelulares (EV): el método IEX, desarrollado para el aislamiento de EV para análisis funcionales in vitro , y el método de alto rendimiento de captura de panexosomas, optimizado para estudios de caracterización posteriores.

1. Enriquecimiento de vehículos eléctricos funcionales a través de IEX
   NOTA: Todas las especificaciones volumétricas se expresan en términos de volumen de columna (CV), lo que refleja la relación proporcional entre los volúmenes de reactivos y el volumen del lecho de resina dentro de la columna cromatográfica.
   1. Lleve la columna IEX (consulte la Tabla de materiales para obtener detalles de la columna utilizada) a temperatura ambiente (RT) dejándola reposar durante 15 minutos antes de usarla. Agregue 10 CV de tampón de regeneración, seguido de equilibrio con tampón de equilibrio isotónico de 10 CV (a pH 7,4) (consulte la Tabla de materiales para obtener detalles de los tampones).
      NOTA: No permita que la columna se seque durante períodos prolongados. Mantenga siempre la columna en posición vertical.
   2. Descongele el CM y páselo a través de un filtro de polietersulfona (PES) de 0,22 μm.
   3. Agregue la muestra a la columna equilibrada (hasta 31,2 CV), seguida de 10 CV de tampón de lavado isotónico (a pH 7,4). Agregue 2,5 CV de tampón de elución hipertónica (consulte la tabla de materiales) y recoja el flujo, ya que esta es la muestra de eluido EV.
   4. Realice un intercambio de tampón en el eluido de EV utilizando filtros centrífugos de ultrafiltración disponibles en el mercado (corte de 30 kDa) y una solución isotónica como diluyente, asegurando un factor de dilución mínimo de 100x. El usuario puede determinar el volumen objetivo después del intercambio de tampón para adaptarse a sus parámetros experimentales.
   5. Realice un paso de filtración final utilizando un filtro de 0,22 μm para esterilizar los EV enriquecidos para ensayos funcionales in vitro .
   6. Determinar la distribución del tamaño, la concentración y el rendimiento de CAR-EV mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)^8,9.
2. Aislamiento de EV panexosoma de alto rendimiento (a través de un sistema de purificación automatizado, realizado a temperatura ambiente (RT)), para la caracterización de una variedad limitada o grande de muestras^10,11.
   1. Prepare tres placas de 96 pocillos profundos (DW) con 1 ml de 1x PBS por pocillo.
   2. Cree una placa de "elución" agregando 35 μL de tampón de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1% a cada pocillo.
   3. Prepare una placa de "unión" que contenga 1 ml de la muestra de CM y 30 μl de perlas de captura de panexosomas EXO-NET por pocillo.
   4. Establezca la siguiente configuración en el sistema de aislamiento automatizado:
      1. Paso 1: Punta de recogida: Asegúrese de que el protocolo de aislamiento comience con el instrumento enganchando un peine de punta de 96 pocillos profundos para permitir la manipulación de perlas magnéticas durante todo el proceso de aislamiento.
      2. Paso 2: Asegúrese de que la muestra de CM y las perlas magnéticas se mezclen en condiciones continuas de baja velocidad durante 30 minutos para permitir una captura eficiente de los vehículos eléctricos en las partículas magnéticas. Después de la mezcla, se incluyen 5 ciclos de 30 s cada uno para garantizar la captura de perlas magnéticas.
      3. Paso 3: Asegúrese de que cada uno de los tres pasos de lavado utilice una mezcla suave de 30 s a baja velocidad para eliminar los contaminantes unidos de forma no específica y preservar la integridad de los vehículos eléctricos unidos. Como anteriormente, el paso finaliza con 5 ciclos de 30 s cada uno para capturar las perlas magnéticas.
      4. Paso 4: Elución de proteínas EV (lisis): Asegúrese de que los EV unidos se lisen para la recuperación de proteínas a través de un proceso de dos fases. Se realiza una mezcla inicial durante 30 s (mezcla de fondo) antes de una incubación durante 7 min y 30 s en un estado pausado, con la posición de la punta mantenida por encima del pocillo. Una vez transcurrido el tiempo, hay unos segundos 30 s mezclando y haciendo una pausa durante otros 7 min y 30 s. Finalmente, se incorporan 5 ciclos de 30 s cada uno.
      5. Paso 5: En este punto, asegúrese de que el contenido de proteína esté en el tampón, mientras que las perlas están unidas a la punta. Después del paso de elución, se desecha el peine de punta usado, completando el protocolo.
         NOTA: Las perlas de captura de exosomas Pan-Exosoma de EXO-NET contienen una solución conservante al 0,05% (p/p). Si bien no está clasificado como peligroso según las regulaciones de la Administración de Seguridad y Salud Ocupacional (OSHA), se debe usar equipo de protección personal (EPP) adecuado al manipular, especialmente en el contexto de biofluidos.

3. Caracterización de vehículos eléctricos mediante western blot

NOTA: Los CAR-EV se caracterizaron por Western blot (Granzima B y Calnexina), en comparación con las células como control.

1. Preparar lisados celulares añadiendo 10 μl de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) 1x (con inhibidores de la proteasa) por 1 × 10⁶ células. Incubar en hielo durante 30 min, luego centrifugar a 14.000 × g (4 °C) durante 15 min para eliminar los restos celulares. Los EV se pueden lisar utilizando el mismo tampón o SDS al 1%.
2. Cuantifique la cantidad de proteína utilizando un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (o un nanoespectrofotómetro adecuado).
3. Ensamble un gel de poliacrilamida SDS al 4-12% en un aparato de electroforesis siguiendo el protocolo del fabricante. Preparar lisados de proteínas con el tampón de Laemmli.
   NOTA: Los sistemas de gel pueden variar según la marca
4. Cargue 5 μg de muestra en cada pocillo y deje correr geles a 200 V durante 20 min.
5. Realice una transferencia Western utilizando membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF), bloqueando las transferencias con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en solución salina tamponada con Tris al 0,1% con Tween 20 (1x TBST) a partir de entonces.
6. Incubar las transferencias en anticuerpo monoclonal primario (Granzima B y Calnexina, dilución 1 en 500 en una solución de BSA al 5% en 1x TBST), estancado (sin agitación) y durante la noche a 4 °C.
7. Al día siguiente, lavar las transferencias 3 veces durante 5 min cada una con 10-15 ml de 1x TBST antes de incubar en un anticuerpo secundario (dependiente de la especie, 1 en 1.000 diluciones en una solución de BSA al 5% en 1x TBST durante 1 h a temperatura ambiente). Detecte bandas mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL), con imágenes capturadas a través de una cámara digital de dispositivo de acoplamiento cargado (CCD).

4. Ensayo funcional (a través de MTS)

NOTA: La citotoxicidad se evaluó mediante el ensayo in vitro MTS [(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio], donde las células reducen el compuesto de tetrazolio en un producto formazán coloreado soluble, medible a 490 nm de absorbancia. Las células de cáncer de mama MCF-7 y K-562 de cáncer de sangre se trataron hasta 3 días en tres experimentos independientes con concentraciones crecientes (0-500,000 partículas / célula) de CAR-EV.

1. Siembre 5.000 células receptoras por pocillo (50 μl/pocillo) en una placa de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal. Reserve una columna para el medio en blanco (para la resta de fondo del reactivo MTS). Evite los pozos de borde, llenándolos con 200 μL de agua estéril.
   NOTA: Las células adherentes deben colocarse con un día de anticipación para garantizar la unión celular a la superficie de la placa antes del tratamiento.
2. Agregue EV en cantidades crecientes (p. ej., 2.5 x 10⁵ y 4.5 x 10⁵, o 0.5, 0.75 y 1 millón de EV por celda). Incluya controles: 'Sin EV', 1x PBS 'EV buffer' y un control de muerte celular positivo (por ejemplo, un inhibidor de molécula pequeña específico de la diana o 0,1% TX-100).
3. Incubar las células en una cámara humidificada a 37 °C (5% CO₂, 21% O₂) durante 2-3 días.
4. En el momento de tratamiento designado, examine las células mediante microscopía. Agregue el reactivo MTS (20 μL por cada 100 μL de cultivo por pocillo). Incubar entre 1-4 h, midiendo la absorbancia usando un lector de placas a 490 nm, cada hora.
5. Reste la lectura de absorbancia del medio en blanco para el análisis de datos. Calcule estadísticas utilizando la prueba t de Student para comparaciones de dos grupos o ANOVA de una vía con comparaciones múltiples para tres o más grupos.

Resultados

En la Figura 1 se ilustra un flujo de trabajo típico de cultivo de células CAR T/NK, seguido del aislamiento, caracterización y utilización de EV en un ensayo funcional. Se recolecta CM del cultivo de células CAR T/NK, antes del enriquecimiento de EV y la caracterización posterior (incluido el análisis de seguimiento de nanopartículas) y la actividad funcional se evalúa mediante un ensayo MTS de placa de múltiples pocillos (Figura 1).

Las células CAR marcadas con GFP se pueden visualizar mediante microscopía para confirmar la expresión de la construcción CAR en cultivo. La microscopía debe realizarse como un paso de rutina antes y durante la recolección de la MC para garantizar una eficiencia de transducción suficiente. Es importante superponer los canales de campo claro y GFP, para capturar la autofluorescencia potencial al evaluar la eficiencia. Cabe destacar que las células T poseen una tendencia a agruparse naturalmente (observada de manera similar en las células NK; datos no mostrados), y la fluorescencia se puede observar claramente cuando las células exhiben un fenotipo agrupado (Figura 2).

Después del enriquecimiento de EV, los EV se pueden caracterizar mediante NTA e inmunotransferencia occidental. Usando NTA, el análisis del rendimiento de partículas puede confirmar un aumento de la concentración en los EV aislados, en comparación con CM (Figura 3A). Los datos de Western blot confirman además la expresión del marcador citolítico granzima B en células CAR y EV, y la ausencia de calnexina en estas últimas, lo que confirma la ausencia de material celular en las preparaciones. HEK293T células se incluyen como control negativo para CAR (Figura 3B).

El análisis de la funcionalidad de EV se realizó mediante un ensayo MTS para determinar la viabilidad/capacidad de proliferación celular. El efecto de los CAR-EV dirigidos a EGFR y HER2 en la viabilidad y el crecimiento de las células del cáncer de mama MCF-7 y el cáncer de sangre K562 se determina mediante la medición del reactivo colorimétrico MTS a una absorbancia de 490 nm (después de la eliminación de la señal de fondo). En este ejemplo, el EGFR dirigido a los CAR-EV redujo la viabilidad de las células MCF-7 y K562 en un 70% y 40%, respectivamente. El HER-2 dirigido a los CAR-EV redujo el MCF-7 en ~10% (según lo determinado a través de la prueba t de Student). Teniendo en cuenta el diseño experimental, el empleo de una prueba no paramétrica (por ejemplo, Mann-Whitney U) puede ofrecer información más sólida en estudios posteriores (Figura 4).

Figura 1: Generación, enriquecimiento, caracterización de CAR-EV y lectura funcional. Diagrama esquemático que representa un flujo de trabajo típico de generación, producción y caracterización de EV de muestras CAR-EV enriquecidas antes del análisis de funcionalidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Análisis microscópico representativo mediante la confirmación de la expresión de GFP en células CAR-T dirigidas a HER2. Las imágenes se capturaron mediante microscopía de fluorescencia, utilizando un objetivo de 20x. La barra de escala blanca representa una longitud de 50 μm. Las células T tienen una tendencia natural a crecer en grupos antes de desprenderse en células individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Caracterización de células CAR y EV. (A) Análisis de partículas de nanoseguimiento de CAR-T CM y EV enriquecidos. La concentración de partículas de los EV fue de 1,6 a 2,1 veces mayor que la de CM, mientras que la concentración de proteínas se redujo en un >80%. Las diferencias estadísticamente significativas se probaron con ANOVA de una vía y prueba de comparación múltiple de Tukey; p≤ 0,001, **** p≤ 0,0001. (B) El análisis de Western blot de células T transducidas y CAR-EV enriquecidos confirmó la presencia de granzima B citolítica tanto en células CAR como en EV, mientras que se observó una ausencia en HEK293T células sin CAR. No se detectó calnexina en CAR-EV, lo que indica baja contaminación por partículas de retículo endoplásmico. Carga de proteína por carril = 5 μg. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Efecto de los CAR-EV sobre la viabilidad de las células diana (células de cáncer de mama MCF-7 y línea celular de leucemia mielógena crónica K562). Las células diana se trataron con una dosis única de 4,5 x 10⁵ y 2,5 x 10⁵ EV / célula (EGFR o HER2 CAR, respectivamente) o control (tampón EV) durante un máximo de 3 días. (A) Células CAR-EV dirigidas a EGFR. (B) CAR-EV dirigidos a HER2. Se observó una disminución en la lectura de absorbancia (indicativa de la eficacia del tratamiento) en ambas líneas celulares. Los datos representan la absorbancia media ± DE (n = 3), analizada mediante una prueba t de Student no apareada de dos colas, con valores de p que indican significación estadística; ** pág≤ 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La combinación de la eficacia probada de la terapia con CAR con las ventajas prometedoras de la terapia basada en vesículas extracelulares (EV) puede mejorar la eficacia de los tratamientos contra el cáncer, como se demuestra en estudios dirigidos a cánceres de mama y pulmón^12,13. El enfoque terapéutico CAR-EV aborda las limitaciones actuales de la terapia CAR, como los desafíos de administración y la toxicidad asociada, al tiempo que aprovecha la biocompatibilidad y las capacidades de orientación de los EV. La integración de estas modalidades puede facilitar el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el cáncer, ampliando las oportunidades para la aplicación de VE en un entorno clínico. Además, la ingeniería y el enriquecimiento de los VE funcionales proporcionan un método más seguro (a través de la encapsulación de la carga citolítica) y más preciso (es decir, la adición de dominios de orientación) para administrar carga terapéutica, especialmente en lugares difíciles como el núcleo del tumor, la médula ósea y áreas protegidas por barreras como la barrera sangre-cerebro o sangre-testículo 14,15,16. A pesar del método bien establecido de enriquecimiento de VE mediante ultracentrifugación, siguen existiendo varias limitaciones. Las limitaciones notables incluyen: escalabilidad, coaislamiento de impurezas y rendimiento limitado de posproducción¹⁷. Existe una clara necesidad de mejorar los procesos para generar VE terapéuticas a escala.

Este estudio de prueba de concepto demuestra que IEX es un método escalable y eficaz para producir, aislar y enriquecer CAR-EV funcionales, utilizando CM clarificado de células que expresan CAR como entrada. IEX permite un procesamiento de alto rendimiento y admite tanto la investigación como la producción a escala de cGMP, lo que permite el control de calidad en todo el flujo de trabajo, desde la generación de vehículos eléctricos hasta las pruebas finales del producto farmacéutico^18,19. Si bien la caracterización de EV es esencial para confirmar la función, el rendimiento puede variar significativamente debido a las diferencias en el volumen de la muestra, la concentración de entrada y las propiedades específicas de EV, como la carga superficial y las propiedades de unión. Los datos internos que utilizan celdas MCF-7 muestran un rendimiento promedio de prepurificación de ~ 2.85 × 10⁸ partículas / ml, con concentraciones posteriores a la purificación que generalmente oscilan entre 3 × 10¹¹ y 1 × 10¹² partículas / ml. Estos niveles se pueden ajustar modificando el volumen de resuspensión durante el intercambio de tampones para que coincida con las necesidades posteriores. Dada esta variabilidad, se recomienda encarecidamente a los usuarios que optimicen el protocolo con CM relevante para su configuración experimental, para garantizar rendimientos reproducibles y sólidos.

Varios pasos dentro del protocolo son críticos para la producción exitosa de CAR-EV, con especial énfasis en las fases de carga y elución de la muestra. Estos pasos influyen directamente en la eficiencia de la captura de vehículos eléctricos por parte de la columna y, en consecuencia, en el rendimiento general. El paso de intercambio de tampones es crucial, ya que la eliminación incompleta del exceso de solutos puede comprometer la estabilidad del vehículo eléctrico, lo que lleva a la degradación con el tiempo. Las VE se pueden caracterizar mediante el uso de métodos como NTA o perfiles proteómicos. Si los CAR-EV están destinados a ensayos funcionales, como estudios de captación celular o intervenciones terapéuticas, la esterilidad es de suma importancia. Un paso final de esterilización "terminal" (0,22 μm) es esencial para prevenir la contaminación microbiana, que puede confundir los resultados experimentales o plantear riesgos de bioseguridad. Dados estos factores, se recomienda encarecidamente a los usuarios que tengan especial cuidado durante estos pasos para mantener la reproducibilidad y la integridad funcional de la preparación final de EV.

Es posible que sean necesarias varias modificaciones de protocolo para abordar problemas comunes encontrados durante la producción de CAR-EV. El bajo rendimiento es causado más comúnmente por una carga subóptima de CM, ya sea que exceda o no alcance la capacidad de unión de la columna. Para determinar el volumen de entrada óptimo, es aconsejable realizar un estudio de valoración de CM, aumentando gradualmente la carga para identificar el punto de máxima recuperación de EV. La obstrucción del filtro, que generalmente se observa durante el paso final de filtración estéril, a menudo es el resultado de una concentración y viscosidad excesivas de la muestra, lo que puede promover la agregación de EV. En tales casos, se recomienda diluir la preparación final de EV. Si la dilución no es factible, se puede realizar una filtración estéril antes del intercambio de tampones; sin embargo, este enfoque requiere que todos los pasos posteriores se realicen en condiciones asépticas estrictas para mantener la esterilidad.

El desarrollo de VE como terapéutica contra el cáncer requiere procesos de producción reproducibles y una validación sólida de su eficacia contra las líneas celulares diana del cáncer. Una limitación común de IEX en el enriquecimiento de EV es el aislamiento conjunto de partículas que no son EV, un desafío identificable a través del análisis posterior de marcadores específicos de EV y reducible mediante una mayor optimización de CM. La caracterización de la liberación de control de los VE debe incluir: NTA para determinar el número y tamaño de las partículas, y la concentración de EV después del enriquecimiento; análisis genético y de transcripción de la expresión de constructos CAR; determinación de la expresión celular y de proteínas EV del CAR, biomarcadores EV canónicos y marcadores citolíticos (p. ej., granzima B y perforina); y efectos dentro y fuera del objetivo. La incorporación de técnicas adicionales, como la microscopía electrónica de transmisión (TEM), proporcionará validación morfológica para complementar la caracterización basada en el tamaño, lo que respaldará un análisis más completo. Para mantener el control de calidad, los productos EV deben someterse a pruebas de contaminación por micoplasma y endotoxinas para verificar la esterilidad y la idoneidad para la producción clínica. El empleo de formulaciones adecuadas para el almacenamiento a largo plazo de CAR-EV funcionales puede ofrecer oportunidades para mejorar su estabilidad, incluido el mantenimiento de la calidad, la cantidad y la eficacia terapéutica. La evaluación constante del rendimiento funcional es esencial para garantizar la integridad del producto. En particular, el ensayo MTS utilizado en este estudio ofrece una evaluación indirecta de la citotoxicidad a través de la medición de la actividad metabólica. Los estudios futuros se beneficiarían de la integración de ensayos estandarizados de citotoxicidad, como la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH), la tinción con anexina V/PI o el perfil de activación de caspasas, para delinear los efectos citotóxicos con mayor precisión. Además, la incorporación de comparadores de células CAR (no incorporados en el estudio actual debido a limitaciones de fuentes) ya sea solos o en combinación con CAR-EV, e incluir el tratamiento paralelo de líneas celulares no cancerosas de control, podría profundizar el valor interpretativo de los hallazgos.

Este estudio destaca el uso potencial de los CAR EV EGFR/HER2 como una estrategia terapéutica viable para cánceres específicos. Se puede mejorar la eficacia de los CAR EV mediante la dosificación múltiple o la preactivación de las células T parentales para aumentar la citotoxicidad. Además, los avances en enfoques emergentes, como las cargas de ARNip, y las mejoras en la capacidad de unión de EGFR/HER2 presentan oportunidades para refinar el diseño de estas plataformas terapéuticas^20,21. La prometedora aplicación de los receptores de antígenos quiméricos duales (CAR duales) en la terapia celular ofrece una oportunidad adicional para el avance. Extender el uso de CAR duales mediante la utilización de sus contrapartes EV en terapias podría ser un paso fundamental para ampliar su alcance terapéutico y mejorar las modalidades de tratamiento^22,23. El monitoreo en tiempo real de la citotoxicidad de las células cancerosas impulsada por CAR EV (p. ej., activación de caspasa 3/7, lectura de impedancia) proporciona información valiosa para determinar los regímenes de dosificación óptimos, lo que facilita la traducción optimizada a futuras aplicaciones in vivo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Materiales
1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4	Gibco	10010049	Enriquecimiento de vehículos eléctricos
1% de dodecil sulfato de sodio (SDS)	Sigma	L3771-100G	Disuelva 1 g de polvo SDS en 10 ml de agua ultrapura
1x solución salina tamponada con trís con Tween-20 (TBST)	Productos químicos Thermo Scientific	J77500. K2	Diluir con agua ultrapura para hacer una solución 1x (alternativamente, preparar una solución de polisorbato-20/Tween-20 al 0,1% en solución salina tamponada con tris 1x)
Microplaca de poliestireno tratada con TC de fondo plano transparente de 96 pocillos, estéril	Corning	3595	Ensayo funcional In vitro
Bolt Bis-Tris Plus Mini Geles Proteicos, 4-12%, 1,0 mm, formato WedgeWell	Invitrogen		Caracterización de celdas/EV
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A9647-100G	Caracterización de celdas/EV
Anticuerpo de calnexina	Señalización celular	2433S	Caracterización de celdas/EV
Células CAR-NK/T	ProMab Biotecnologías	Varía	El dominio de unión al ligando extracelular CAR depende del objetivo preferido en las células receptoras
CellTiter 96 Ensayo de proliferación celular de una solución (MTS)	Promega	G3580	Ensayo funcional In vitro
Cóctel completo de inhibidores de proteasa sin EDTA	Roche	11836170001	Lisis celular
Reactivo de detección de Western blot ECL	Amersham	RPN2232	Caracterización de celdas/EV
Tampón de elución	INOVIQ		Enriquecimiento/aislamiento de vehículos eléctricos
Tampón de equilibrio	INOVIQ		Enriquecimiento/aislamiento de vehículos eléctricos
Columna EXO-ACE IEX	INOVIQ		Enriquecimiento/aislamiento de EV para ensayo funcional aguas abajo ID de patente AU2024901931
Perlas de captura de panexosomas EXO-NET	INOVIQ		Aislamiento de EV para la caracterización posterior ID de patente WO/2014/011673
Anticuerpo Granzima B	Señalización celular	4275	Caracterización de celdas/EV
IL-2 IS humana, grado premium	Miltenyi Biotec	130-097-744	Cultivo libre de xenocélulas T/NK
iBlot 2 Pilas de transferencia, PVDF	Invitrogen		Caracterización de celdas/EV
ImmunoCult-XF (cGMP)	Tecnologías de células madre	100-0956	Cultivo libre de xenocélulas T/NK
K-562	ATCC	CCL-243	Ensayo funcional In vitro
MCF-7	ATCC	HTB-22	Ensayo funcional In vitro
Unidad de filtro de jeringa Millex-GP, 0.22 µ m	Merck Millipore	SLGPR33RS	Filtración terminal
Búfer de regeneración	INOVIQ		Enriquecimiento/aislamiento de vehículos eléctricos
Tampón RIPA (10X)	Tecnología de señalización celular	9806	Lisis celular
Solución de azul de tripano, 0,4%	Gibco	15250061	Evaluación de la viabilidad y densidad celular
Tampón de lavado	INOVIQ		Enriquecimiento/aislamiento de vehículos eléctricos
Equipo
Contador de células automatizado	Invitrogen	Condesa II FL	Evaluación de la viabilidad y densidad celular
Instrumento de extracción automatizado de sobremesa	Invitrogen	Sistema KingFisher Apex	Sistema de purificación automatizado de alto rendimiento Consulte el enlace para obtener detalles del protocolo: https://www.inoviq.com/site/technology/resources
Microscopio de fluorescencia	Zeiss	Axio Observador 7	Cultivo celular
Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)	Particle Metrix GmbH	Zetaview PMX-130	Análisis de partículas
Lector de placas	BMG Labtech	SPECTROstar Nano	Ensayo funcional In vitro
Centrífuga refrigerada de sobremesa	Beckman Coulter	Avanti J-15R	Cultivo celular y Procesamiento de enriquecimiento EV
Tanque de gel SDS-PAGE mini	Invitrogen	Referencia A25977	Caracterización de celdas/EV
Sistema de transferencia Western blot	Invitrogen	iBlot 2	Caracterización de celdas/EV