Artículo de método

Uso de microperfusión cerebral de flujo abierto para la recogida longitudinal de fluido intersticial en un modelo animal de glioblastoma

DOI:

10.3791/68748

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23 de diciembre de 2025

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1Department of Neurological Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo, las comunicaciones intercelulares que sustentan muchas enfermedades del sistema nervioso central, como el glioblastoma (GBM), son notoriamente difíciles de medir y caracterizar. Aquí describimos procedimientos de microperfusión cerebral de flujo abierto (cOFM) que pueden emplearse para muestrear componentes del líquido intersticial en un modelo animal longitudinal de GBM.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las enfermedades del sistema nervioso central (SNC) se manifiestan a través de una red compleja y dinámica de comunicación intercelular. El glioblastoma (GBM), el tumor cerebral primario más común y agresivo, es emblemático de esta complejidad, con su rápida progresión y pronóstico desalentador medido en meses en lugar de años. La biología de GBM está impulsada por intrincados intercambios de moléculas de señalización entre células neoplásicas y estromales, que sustentan la progresión agresiva de la enfermedad. Aquí describimos un protocolo detallado de microperfusión cerebral de flujo abierto (cOFM) en modelos murinos GBM, que permite la monitorización longitudinal en tiempo real de la dinámica del microambiente tumoral dentro del fluido intersticial (ISF). Nuestro enfoque describe la implantación de montajes duraderos en la cabeza de la cánula guía, su uso para el enjerto intracerebral de glioma directamente a través de la guía, y la recogida de muestras de cOFM de alta fidelidad para análisis metabolómicos y proteómicos de LC-MS. De forma crucial, la cOFM supera las limitaciones de tamaño molecular de la microdiálisis tradicional. Más allá de la GBM, la metodología cOFM promete conocimientos transformadores sobre un espectro de trastornos del SNC, incluyendo condiciones neurodegenerativas, epilépticas y neuropsiquiátricas, gracias a su capacidad para proporcionar biomarcadores etiológicos y sensibles al tratamiento dentro de sus respectivos modelos animales.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Investigar las enfermedades del sistema nervioso central (SNC) es notoriamente complicado debido a la compleja y multimodal señalización intercelular mediada por el líquido intersticial (ISF)1,2,3,4. Esta complejidad es especialmente pronunciada en tumores cerebrales, como el glioblastoma (GBM), donde se transmiten señales intercelulares entre células neoplásicas yestromales 5,6,7,8,9. En muchos casos, el intercambio aberrante de diversas biomoléculas, incluidos metabolitos y mensajeros proteicos, contribuye a la etiología subyacente de las patologías del SNC. Este desafío investigativo se agrava, especialmente en GBM, por el hecho de que la composición molecular de la ISF es temporalmente dinámica y evoluciona a lo largo de la progresión de la enfermedad así como en respuesta a tratamientosintervencionistas 10,11.

Los métodos tradicionales de investigación preclínica de la GBM incluyen estudios in vitro y modelos animales de un único punto final. La naturaleza de estos enfoques limita su aplicabilidad clínica más amplia debido a su incapacidad para captar tanto las características del microambiente tumoral como los cambios temporales longitudinales. Los avances realizados a principios de los años 80 superaron estas limitaciones contextuales con el desarrollo de la microdiálisis intracerebral (cMD)12,13,14,15. Desde su creación hace 45 años, la cMD se ha consolidado como el método estándar para el muestreo longitudinal de fluido intersticial (ISF) en el cerebrovivo 16. Esto se logra mediante la difusión libre y convección de solutos ISF de alta concentración a través de una membrana semipermeable hacia un líquido cefalorraquídeo (aCSF)17 de flujo continuo y baja concentración de solutos, típicamente artificial. Estas membranas semipermeables están compuestas por varios polímeros biocompatibles con cortes comunes de tamaño de poro en peso molecular que van desde 20 kDa hasta 3MDa 18. Este procedimiento mínimamente invasivo permite la recogida longitudinal in situ de una amplia variedad de analitos, que van desde pequeñas moléculas, como metabolitos o neurotransmisores, hasta proteínas grandes, como anticuerpos. Sin embargo, la porosidad estructural de las membranas de cMD junto con la naturaleza adsortiva de sus polímeros composicionales puede afectar significativamente la recuperación relativa de analitos con características bioquímicas o dimensionales particulares, como lípidos o anticuerpos, respectivamente19,20.

Los avances para superar esta limitación de las membranas de cMD comenzaron a principios de la década de 2010 con el desarrollo de la microperfusión cerebral de flujo abierto (cOFM)21. Funcionando bajo principios generales similares a los de cMD, cOFM elimina limitaciones bioquímicas impuestas por las membranas semipermeables al sustituirlas por una sonda de red plástica con aberturas macroscópicas de baja adsorción de aproximadamente 100 μm de tamaño20. Multitud de informes han demostrado la mayor utilidad de la cOFM frente a la cMD mediante la recopilación de componentes detectables de la ISF, incluyendo hormonas peptídicas, nanocuerpos/anticuerpos, pequeñas terapias lipofílicas y liposomasPEGilados 19,22,23,24,25. Informes previos que examinan la reacción fisiológica del tejido a la implantación de la sonda guía cOFM muestran que la integridad de la barrera hematoencefálica se restablece a los 15 días tras la implantación, y que no se forman cicatrices gliales hasta los 30 días posteriores ala implantación 26. Debido al reemplazo de las membranas de microdiálisis por aberturas macroscópicas, los investigadores también han demostrado la capacidad innovadora de las sondas guía cOFM para facilitar la inyección de células de glioma xenoinjertadas en los cerebros de ratas inmunodeficientes, de modo que el enfrasto y crecimiento tumoral no traumático ocurran directamente alrededor del área de muestreo27 de cOFM.

Las consideraciones en el uso de cOFM en el estudio de patologías del SNC deben reconocer sus limitaciones metodológicas. Debido a su dependencia de la difusión pasiva y convección de analitos ISF en un perfusado fluido, estas limitaciones giran en torno a la concentración de analito y el volumende muestra 18. Los componentes de ISF muestreados se diluirán dentro del perfusado de cOFM recogido en comparación con los niveles endógenos, lo que llevó a muchas investigaciones a comparar las relaciones relativas de analitos entre condicionesexperimentales 28. Los caudales típicos varían desde 0,1 μL/min hasta 1,0 μL/min, equivalentes a solo 6 μL/h a 60 μL/h. Al tener en cuenta los tiempos de despeje en espacios muertos de la tubería, también debe considerarse la duración total del muestreo. Esto es especialmente importante al realizar recogidas de cOFM en animales anestesiados, donde las preocupaciones sobre el bienestar animal deben abordarse con cuidado. Una descripción más detallada de estas y otras consideraciones está disponible en un informe de métodos anterior del equipo de desarrollo decOFM 29.

En este manuscrito, ofrecemos un protocolo actualizado para emplear el muestreo longitudinal de cOFM en el estudio de enfermedades neurológicas, con un enfoque en la GBM. El protocolo incluye pasos para la implantación de cánula guía de cOFM, inyección de células tumorales e injerto a través de la guía cOFM, así como dos configuraciones de muestreo de cOFM en animales despiertos y en movimiento libre. Presentamos datos representativos que demuestran los efectos del tratamiento en componentes metabolómicos y proteómicos de ISF medidos por cOFM, el impacto de la configuración del muestreo en las concentraciones de analitos y la eficacia de la implantación celular tumoral guiada por cOFM.

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Protocolo

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Todos los procedimientos animales dentro de este protocolo son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Northwestern (ID de protocolo: IS00021383) y siguen las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Este protocolo fue desarrollado para su uso en ratones C57BL/6J, tanto machos como hembras, con una edad mínima de 8 a 10 semanas. La línea celular de glioma murino utilizada en este protocolo, CT2A, fue proporcionada por el laboratorio Seyfried de la Universidad de Boston y fue cultivada y preparada tras condiciones de cultivo de tejido estéril.

1. Planificación y preparación quirúrgica

  1. Información animal: Para experimentos cOFM, utiliza ratones de un mínimo de 8-10 semanas para permitir un crecimiento y desarrollo completos. Los implantes craneales en posición fija pueden desplazarse o dificultar el crecimiento adecuado en el cráneo y/o cerebro aún en desarrollo.
  2. Selección de coordenadas quirúrgicas: Utiliza un atlas cerebral animal para localizar las coordenadas ortogonales de la región de interés respecto a Bregma. Por ejemplo, las implantaciones de células de glioma suelen realizarse en el estriado para replicar mejor los microambientes nativos de GBM y maximizar la eficacia del desarrollo tumoral posterior. Las coordenadas guía de implantación de cOFM utilizadas en este protocolo son mediolateral (ML) = 2,5 mm, anteroposterior (AP) = 0 mm y dorsoventral (DV) = 3,5 mm.
    NOTA: Las coordenadas estereotácticas pueden variar entre cepas y edades de ratón. Por favor, utilice las coordenadas del atlas específicas por especie y cepa para asegurar la colocación deseada de la guía cOFM.
  3. Selección de configuraciones adecuadas de componentes cOFM: Ordenar componentes para configuraciones cOFM apropiadas en longitudes totales específicas que van de 2 mm a 22 mm, con longitudes de superficie abierta de 1 mm a 2 mm.
    NOTA: Los animales pueden desalojar las cabezas guía cOFM mal implantadas mientras realizan comportamientos de acicalado. Para minimizar la palanca mecánica sobre la cabeza durante esta actividad, recomendamos usar guías no superiores a 2 a 3 mm superiores a la distancia de coordenadas DV prevista.
  4. Planificación de los tiempos de los procedimientos quirúrgicos y de muestreo para los objetivos experimentales: Dependiendo de la enfermedad de interés y las características del modelo, planifica cuidadosamente el momento y el orden de los procedimientos relacionados con cOFM para investigar de forma óptima la biología subyacente en cuestión.
    1. Si se investigan diferencias composicionales de ISF entre cerebros sanos y microambientes tumorales, realizar procedimientos de muestreo de cOFM antes y después de la implantación tumoral en el mismo animal.
    2. Si se investigan los efectos de intervenciones clínicas en patologías del SNC, realizar procedimientos de muestreo de cOFM antes y después de la administración en cohortes animales paralelas que reciben tratamiento de control o experimental.

2. cirugía de colocación guía de cOFM

  1. Ensamblar herramientas quirúrgicas para la cOFM, guiar la cirugía de colocación ( Tabla de Materiales) y esterilizarlos por autoclave si es necesario.
  2. Preparación en el centro quirúrgico:
    1. Desinfectar gabinete de bioseguridad: Realizar procedimientos quirúrgicos dentro de un gabinete de bioseguridad debidamente desinfectado. Activa el flujo de aire del armario de bioseguridad y limpia las superficies interiores con un método de desinfección y limpieza aprobado institucionalmente. Forra la superficie inferior del armario con cortinas estériles.
    2. Prepara instrumentos estereotácticos: Limpia el marco estereotáctico con un desinfectante y colócalo en el armario de bioseguridad. De igual modo, limpia y desinfecta el taladro y el portaguía estereotácticos y colócalos en el armario de bioseguridad.
    3. Almohadilla eléctrica en la etapa quirúrgica: Utiliza una almohadilla térmica en la etapa quirúrgica estereotáctica para proporcionar calor adicional mientras el animal está anestesiado. Limpia y desinfecta la superficie de la almohadilla térmica y colócala sobre el marco estereotáctico donde se situará el animal. Pone la almohadilla térmica a fuego bajo y coloca 1-2 cortinas estériles encima.
    4. Coloca instrumentos y equipos quirúrgicos adicionales: Coloca asepticamente equipos esterilizados adicionales en el armario de bioseguridad.
    5. Instalación de la jaula de recuperación: Coloca una jaula limpia sobre una almohadilla térmica ajustada a la temperatura más baja posible. Cada animal deberá ser colocado en una jaula individual de recuperación hasta que esté completamente recuperado, por lo que el número total de jaulas de recuperación dependerá del rendimiento y los tiempos de recuperación de la cirugía.
  3. Preparaciones animales prequirúrgicas (resumidas en la Figura 1A):
    1. Anestesia: Administrar compuestos anestésicos y dosis aprobados institucionalmente para lograr la profundidad adecuada de anestesia, utilizando la prueba de reflejo de pellizco de la pata así como la profundidad/frecuencia respiratoria para asegurar una anestesia suficiente. Por ejemplo, la inyección intraperitoneal de cóctel de ketamina-xilazina (100 mg/kg - 10 mg/kg, en solución salina) es suficiente para lograr la profundidad anestésica adecuada en ratones C57BL/6J.
    2. Analgesia: Administrar compuestos analgésicos aprobados institucionalmente para ayudar en el manejo del dolor peri y postoperatorio. Por ejemplo, la inyección subcutánea de meloxicam (20 mg/kg, en solución salina) es adecuada para el manejo del dolor perioperatorio.
    3. Depilación (afeitado, crema depilatoria): Elimina el vello del lugar quirúrgico previsto en la parte superior del cráneo usando una afeitadora eléctrica y/o crema depilatoria. Si usas crema depilatoria, asegúrate de que no se deje demasiado tiempo sobre la piel para evitar irritaciones.
    4. Pomada oftálmica: Utilice un aplicador estéril con punta de algodón para aplicar suavemente la pomada oftálmica en ambos ojos y así evitar el resecamiento corneal durante la cirugía.
    5. Colocación del animal en el marco estereotáctico: Colocar correctamente al animal dentro del marco estereotáctico insertando incisivos en el bloque de mordida, insertando barras para los oídos con firmeza pero suave en los conductos auditivos y fijando la pinza nadal sobre el hueso nasal del animal ( Figura 1B). Si está correctamente posicionado, el cráneo del animal debe estar firmemente fijado sin ningún movimiento.
    6. Preparaciones asépticas del sitio quirúrgico: Limpia la piel alrededor de la zona quirúrgica con tres hisopos alternos de alcohol (etilo- o isopropilo-) y povidona, yodo para desinfectar asépticamente la zona para la incisión.
  4. Preparación de la incisión y la superficie del cráneo:
    NOTA: Todos los siguientes pasos deben realizarse de la forma más aséptica posible. Por ello, el cirujano veterinario principal debe llevar guantes quirúrgicos estériles sobre guantes estándar de laboratorio antes de continuar con la incisión.
    1. Ubicación y longitud de la incisión: Utilice un bisturí estéril para realizar una incisión sagital en la línea media a lo largo de la superficie del cráneo, comenzando entre los ojos y extendiéndose caudal 8-10 mm ( Figura 1C).
    2. Retracción de la piel: Utiliza pinzas estériles, aplicadores con punta de algodón y/o una cuchilla de bisturí para retraer lateralmente la piel desde la incisión media. Asegúrate de que tanto Bregma como Lambda sean visibles y extiende la incisión si no es así.
    3. Incisión del periostio: Utiliza un bisturí estéril para hacer una incisión en el periostio y retrae lateralmente el tejido con pinzas.
    4. Hisopo de peróxido de hidrógeno: Limpiar la superficie del cráneo con peróxido de hidrógeno diluido al 1%-3% aplicado con un aplicador estéril con punta de algodón ( Figura 1D). Esto también ayuda a identificar Bregma y Lambda a través de las suturas craneales sagital, coronal y lambdoide.
    5. Adhesivo dental autograbado: Utilice una jeringuilla de insulina de 0,3 mL a 1,0 mL para aplicar uniformemente entre 20 y 40 μL de adhesivo dental autograbado en la superficie del cráneo ( Figura 1D). Aplica una luz de curado dental para ayudar en el grabado. Una vez curado, utiliza aplicadores estériles con punta de algodón y suero fisiológico para eliminar el exceso de adhesivo.
      PRECAUCIÓN: Los adhesivos dentales autograbados, como Bond Force, son sustancias potencialmente peligrosas: peligro inflamable (GHS02: H225), peligro para la salud (GHS07 y GHS08: H315, H319, H317, H361fd, H336) y peligro ambiental (GHS09: H412). Por favor, siga las directrices locales e institucionales para una correcta eliminación de residuos peligrosos.
  5. Localización y perforación de agujeros de rebabas:
    1. Inserta una broca esterilizada de 0,7 mm en el microtaladro e instala el taladro en el marco estereotáctico con el soporte adecuado.
    2. Localiza el Bregma en la intersección de las suturas sagital y coronal y utiliza micromanipuladores estereotácticos para colocar la broca allí.
    3. Reposicionar la broca a la coordenada guía cOFM (ML = 2,5, AP = 0,0), acoplar la broca a 15.000 rpm y taladrar cuidadosamente un agujero de rebabas ajustando la esfera micromanipuladora DV (Figura 1E). Realiza observaciones frecuentes del grosor del cráneo mientras perforas para evitar daños en el cerebro subyacente. Utiliza solución fisiológica salina durante el taladro para eliminar los restos óseos y reducir el calor entre la broca y el cráneo.
    4. Repetir el procedimiento de perforación para cada coordenada de tornillo de anclaje (Figura 1E). Las ubicaciones recomendadas de los tornillos de anclaje son ML = 2,5, AP = -2,5 y ML = -2,5, AP = -2,5.
    5. Después de perforar los agujeros de rebabas, desconecta el microtaladro y el soporte del taladro del marco estereotáctico.
    6. Usa una aguja de 30 g para pinchar suavemente la duramadre bajo el orificio de la muela guía cOFM.
  6. Instala tornillos de anclaje usando un par de pinzas estériles y un destornillador estéril del tamaño adecuado (Figura 1F). Dependiendo del paso de rosca del tornillo, el anclaje es suficiente cuando el tornillo se inserta a una o dos longitudes de rosca de profundidad. Ten cuidado de no clavar demasiado los tornillos de anclaje para evitar dañar la corteza.
  7. Instala la guía cOFM y el conjunto de dummy cOFM en el portaguías y el soporte del soporte al marco estereotáctico. Colocar la punta guía cOFM sobre el orificio de la rebala (ML = 2,5 mm, AP = 0,0 mm) a una altura de DV igual a la de Bregma, y descender lentamente la guía cOFM a través del orificio de la muela hasta la profundidad predeterminada adecuada a una velocidad de 1 mm/min ( Figura 1F). Por ejemplo, la profundidad de colocación de la guía de cOFM con la implantación de células tumorales que se pretende posteriormente es DV = -3,5 mm.
  8. Aplica agente cementante sobre la superficie del cráneo, asegurándote de que cubra las zonas debajo y alrededor tanto de la guía cOFM como de los tornillos de anclaje en una capa fina y uniforme. Utiliza una luz de curado dental para endurecer cada capa de agente cementante antes de aplicar las siguientes capas ( Figura 1G). Continúa aplicando el agente cementante hasta que la superficie del cráneo entre cada componente esté cubierta, los tornillos de anclaje estén completamente cubiertos y el área bajo la guía cOFM hasta y alrededor de la ranura esté cubierta. Ten cuidado de no colocar el agente cementante sobre o cerca de la cuña de bloqueo.
    PRECAUCIÓN: Los agentes cementantes, como Tetric EvoFlow, son sustancias potencialmente peligrosas: peligrosas para la salud (GHS07: H317, H319, H335, H360). Por favor, siga las directrices locales e institucionales para una correcta eliminación de residuos peligrosos.
  9. Desconecta el portaguía de la guía cOFM y sube lentamente el portaguía con el mando de ajuste DV del micromanipulador. Quita el micromanipulador del marco estereotáxico.
  10. Desconecta al animal del marco estereotáctico aflojando y retirando primero las barras de las orejas, aflojando y retrayendo la pinza nasal, y después levantando los incisivos del animal del bloque de mordida.
  11. La piel de sutura se cerró sobre el agente cementante dental, asegurando que el cuerpo guía del cOFM permanezca expuesto. Se recomiendan suturas absorbibles 4-0, como el ácido poliglicólico (PGA) o la poliglactina (Vicryl) (Figura 1H).
  12. Aplica pomada antibiótica triple en la zona cutánea adyacente a la incisión original.
  13. Recuperación y apoyo animal:
    1. Transfiere al animal a una jaula de recuperación aislada (un animal por jaula) y proporciona calor suplementario con una almohadilla térmica en baja temperatura.
    2. Opcional: Proporciona al animal un agente anestésico para acelerar la recuperación. Por ejemplo, las inyecciones subcutáneas de atipamezol (1 mg/kg, en solución salina fisiológica) aceleran los tiempos de recuperación anestésica de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 20 minutos.
    3. Proporcionar observación y apoyo continuos hasta que el animal haya recuperado suficientemente la conciencia y la reclinación esternal. No dejes a los animales sin supervisión hasta que se hayan recuperado completamente de la cirugía y la anestesia.
    4. Una vez que el animal se ha recuperado completamente, puede ser devuelto a jaulas de vivienda común junto con otros animales.
    5. Un día después de la cirugía, proporciona apoyo adicional con analgésicos administrando un analgésico aprobado institucionalmente, como meloxicam (véase el paso 2.3.2).
  14. Permite un tiempo de recuperación de 14 días tras la cirugía de implantación de la guía cOFM para permitir la curación completa de la barrera hematoencefálica antes de realizar cualquier procedimiento adicional en los animales.

3. Implantación de células de tumores intracraneales mediante guía cOFM

  1. Cultivo celular y preparación:
    1. Cultivar y expandir las células según protocolos específicos de cada tipo celular. Por ejemplo, células sinegénicas de glioma de ratón como CT2A pueden cultivarse en platos de 10 cm o en frascos T-75 que contienen DMEM con suero fetal bovino (FBS) al 10% y suplementos de penicilina/estreptomicina al 1%.
    2. Preparar las células cultivadas para la implantación según protocolos específicos de cada tipo celular.
      1. Por ejemplo, con células de glioma CT2A singénicas, retirar el medio de crecimiento, lavar brevemente con PBS e incubar las células durante 5 minutos en tripsina al 0,05% (con 0,53 mM de EDTA) a 37 °C.
      2. Neutralizar la tripsina con un volumen igual de DMEM que contiene FBS al 1%, transferir las células a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C para aplicar las celdas en pellet.
      3. Retira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet celular en 1 mL de PBS (o solución fisiológica). Determina el número total de células por mL con un hemotómetro manual o automatizado. Centrifugar la suspensión de celda de nuevo a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C, retirar el sobrenadante y volver a suspender en un volumen adecuado de PBS (o solución salina) para alcanzar 50.000 celdas por μL. Colocar la suspensión de celda sobre hielo hasta que esté lista para implantar (paso 3.5.2).
  2. Preparar herramientas quirúrgicas para la cirugía de implantación de células de tumores intracraneales (Tabla de Materiales) y esterilizarlas por autoclave si es necesario.
  3. Preparación del espacio de trabajo quirúrgico
    1. Desinfectar armario de bioseguridad: Véase el paso 2.2.1.
    2. Prepara instrumentos estereotácticos: Limpia el marco estereotáctico con desinfectantes y colócalo en el armario de bioseguridad. De igual modo, limpia y desinfecta el portajeringuillas montado en el estereotáctico y colócalo al armazón estereotáctico.
    3. Realiza los pasos 2.2.3.-2.2.5. para los pasos preparatorios restantes.
  4. Preparaciones prequirúrgicas para animales:
    1. Realiza los pasos 2.3.1., 2.3.2., 2.3.4 y 2.3.5. para la preparación animal.
  5. Implantación de células tumorales:
    1. Montaje de jeringuilla e inserto de infusión (resumido en la Figura 2)
      1. Remojad los conectores de tubos con brida en etanol al 70% durante al menos 5 minutos.
      2. Inserta la punta de una jeringuilla de vidrio hermético esterilizada de 10 μL o 25 μL en un extremo de un conector de tubo con brida.
      3. Coloca la entrada de un inserto de infusión cOFM en el otro extremo del conector de la tubería.
      4. Fija el conjunto del inserto jeringuilla-infusión en el soporte estereotáctico montado en la jeringuilla.
    2. Carga el conjunto del inserto jeringuilla-infusión con un volumen adecuado de suspensión de celdas. Por ejemplo, carga 3 μL de suspensión celular a 50.000 células por μL para una inyección total de 150.000 células por animal.
    3. Sustituir el inserto ficticio por el inserto de infusión:
      1. Usa pinzas para quitar la cuña de bloqueo de la guía y el conjunto de dummy cOFM, luego levanta suavemente el muñeco cOFM de la guía.
      2. Utiliza los mandos de ajuste ML y AP del micromanipulador para maniobrar el conjunto de inserto jeringuilla-infusión por encima de la guía cOFM. Utiliza el mando de ajuste DV para bajar cuidadosamente el inserto de infusión en la guía cOFM y fijarlo en su posición reinsertando firmemente la cuña de bloqueo con pinzas.
    4. Inyectar 3 μL de suspensión celular desde la jeringuilla a una tasa de 1 μL/min. Observa cuidadosamente el área alrededor de la guía cOFM y el inserto de infusión para asegurarte de que ninguna suspensión de celda salga del conjunto. Después de que se haya inyectado todo el volumen, espera 1 minuto adicional para que la presión intracraneal se equilibre.
    5. Sustituye el inserto de infusión por un inserto ficticio.
      1. Utiliza pinzas para quitar la cuña de bloqueo de la guía cOFM y el conjunto del inserto de infusión, luego ajusta suavemente el mando de ajuste DV del micromanipulador para levantar el inserto de infusión cOFM de la guía.
      2. Vuelve a colocar el muñeco cOFM en la guía y asegúralo en su posición reinsertando la cuña de bloqueo con pinzas.
  6. Desconecta al animal del marco estereotáctico aflojando y retirando primero las barras de las orejas, aflojando y retrayendo la pinza nasal, y después levantando los incisivos del animal del bloque de mordida.
  7. Recuperación y apoyo animal:
    1. Transfiere al animal a una jaula de recuperación aislada (un animal por jaula) y proporciona calor suplementario con una almohadilla térmica en baja temperatura.
    2. Opcional: Proporcionar al animal un agente de reversión anestésico (como atipamezol) para acelerar la recuperación del tiempo, véase el paso 2.13.2.
    3. Proporcionar observación y apoyo continuos hasta que el animal haya recuperado suficientemente la conciencia y la reclinación esternal. No dejes a los animales sin supervisión hasta que se hayan recuperado completamente de la cirugía y la anestesia.
    4. Una vez que el animal se ha recuperado completamente, puede ser devuelto a jaulas de vivienda común acompañado de otros animales.
    5. El día siguiente a la cirugía, proporciona apoyo analgésico adicional administrando un analgésico aprobado institucionalmente, como meloxicam (véase el paso 2.3.2).
      NOTA: Si se utilizan líneas celulares luciferasas positivas, se puede realizar una imagen bioluminiscente (BLI) 1-2 semanas después de la implantación celular para verificar el éxito del injerto tumoral. Aunque características físicas como el pelaje animal o la presencia en la cabeza pueden dificultar la luminiscencia detectada, aún pueden usarse para hacer aproximaciones aproximadas aproximaciones aproximadas de la presencia o ausencia tumoral. Alternativamente, se puede realizar una resonancia magnética si los tornillos de anclaje usados en la colocación de la guía cOFM no son ferromagnéticos ni compatibles con la resonancia magnética.

4. muestreo cOFM de líquido intersticial cerebral

NOTA: Dada su dependencia de la difusión pasiva de analitos, las muestras de cOFM contienen concentraciones diluidas de analito en comparación con el entorno endógeno ISF. Por ello, se han propuesto previamente varios métodos para calibrar las mediciones de muestras y así reflejar mejor las concentraciones in situ 18. Esta sección describe dos modalidades diferentes de muestreo. Paso 4.1. describe el modo de configuración recomendado por el fabricante (a partir de aquí denominado fraccionado) que ofrece una mayor sensibilidad temporal, pero a costa de la concentración del analito. Paso 4.2. detalla un modo alternativo de configuración que hemos desarrollado (a partir de aquí denominado recirculado) que puede lograr una mayor concentración de analito a costa de una disminución de la resolución temporal.

  1. Muestreo fraccionado de cOFM (resumido en la Figura 3A):
    1. Remojar los conectores de tubos con brida en etanol al 70% durante al menos 5 minutos para facilitar la fijación en tubos e insertos de muestra.
    2. Carga la bolsa de perfusado con suficiente perfusado de aCSF. Por ejemplo, 680 μL son mínimamente suficientes tanto para un enjuaguado de línea de 20 minutos a 10 μL/min como para un muestreo de 8 horas a 1 μL/min. Sin embargo, se recomienda un volumen mínimo de 2 mL para evitar el colapso y fallo de la bolsa de perfuso.
    3. Prellena ambas líneas de empuje y tracción con un volumen adecuado de aCSF usando jeringuillas de vidrio herméticas. Por ejemplo, el tubo universal push-pull de baja unión tiene un diámetro interior de 0,25 mm y longitudes individuales de tubo de 100 cm. Esto equivale aproximadamente a 1 μL por 2 cm, y por tanto aproximadamente 55 μL en el tubo de empuje y 100 μL en el tubo de tracción.
    4. Instalar correctamente la sección peristáltica del tubo en la cabeza de la bomba de microperfusión como se muestra en la Figura 3A.
      NOTA: Consulte el manual de instrucciones de BASi para más instrucciones si es necesario.
    5. Conecta la bolsa de perfusión a la sección de empuje del tubo usando el conector Luer lock (Figura 3A, componente i).
    6. Conecta el inserto de muestreo a las líneas de tubería usando conectores de tubo con brida. La entrada del inserto de muestreo (longitud de eje más larga) debe estar fijada al extremo de salida del tubo de empuje, frente a la línea del tubo del saco de perfuso (Figura 3A, arriba a la izquierda). La salida del inserto de muestreo (eje más corto) debe estar unida al extremo de entrada del tubo de pulling, paralela a la línea del tubo de la bolsa de perfuso (Figura 3A, arriba a la derecha). Coloque el inserto de muestreo conectado en un tubo microcentrífuga estéril que contiene 750 μL de aCSF en preparación para el lavado del sistema.
    7. Conecta la aguja del colector de fracciones con un conector de tubo con brida a la línea de salida del tubo de extracción (extremo opuesto a la salida del inserto de muestreo).
    8. Realiza un lavado del sistema de tubos durante 20 minutos a 10 μL/min para eliminar cualquier burbuja de gas atrapada dentro del sistema de tubos.
    9. Configuración de colector de fracciones:
      1. Etiquetar y pesar los tubos de recogida de fracciones, anotando cada peso para la posterior comparación y validación del volumen de muestra recogido. Coloca tubos en las ranuras correspondientes del carrusel colector de fracciones.
      2. Activa el colector de fracciones y configura los ajustes a los valores deseados. Ejemplos de ajustes incluyen # de muestras, tiempo de muestreo (m), retardo (horas), refrigeración de refrigeración y modo _cannula.
        NOTA: El descarte del volumen de fluido en espacio muerto en el tubo de tracción que nunca contactó con ISF ortotópico se aproxima por i) longitud y volumen del tubo (aproximadamente 2 cm/μL para OFM-PP2-100-LB), ii) caudal y iii) retardo (horas). Estos parámetros deben considerarse cuidadosamente al establecer el sistema de recogida para asegurar una correcta recogida de fracciones.
  2. Muestreo recirculado de cOFM (resumido en la Figura 3B):
    1. Remojando los conectores de tubos con brida en etanol al 70% para facilitar la fijación en tubos y insertos de muestra.
    2. Prellena la línea de extracción del tubo con un volumen adecuado de aCSF usando jeringuillas de vidrio herméticas.
    3. Instala correctamente la sección peristáltica del tubo en la cabeza de la bomba de microperfusión.
    4. Conecta el inserto de muestreo a las líneas de tubería usando conectores de tubo con brida. La entrada del inserto de muestreo (longitud de eje más larga) debe estar fijada al extremo de salida del tubo de pulling. La salida del inserto de muestreo (eje más corto) debe estar fijada al extremo de entrada del tubo de pull. Coloque el inserto de muestreo conectado en un tubo microcentrífuga estéril que contiene 750 μL de aCSF en preparación para el lavado del sistema.
    5. Realiza un lavado del sistema de tubos durante 20 minutos a 10 μL/min para eliminar cualquier burbuja de gas atrapada dentro del sistema de tubos.
  3. Configuración del sistema de jaula giratoria:
    NOTA: Los sistemas de jaulas para animales rotativos, como el Sistema Raturn, facilitan el muestreo de cOFM animal despierto al evitar el hiperenrollamiento y el enredo de los tubos de empuje y tirón. Esto también puede ayudar en la automatización del muestreo de cOFM al eliminar la necesidad de desenredar manualmente los tubos durante las sesiones de recogida de cOFM en estado de despertado.
    1. Coloca la cama limpia de la jaula de forma uniforme en el suelo giratorio y equipa la jaula con fuentes de comida y agua fácilmente accesibles.
    2. Enciende el controlador de rotación de la jaula y prueba su actividad girando el cable suspendido. La jaula debe girar en sentido contrario respecto a la dirección de rotación impartida al amarre. Configura el controlador de rotación en modo de espera hasta que el animal esté conectado al cable.
  4. Conectando animales con el sistema cOFM:
    NOTA: La conexión y desprendimiento de los animales al sistema cOFM se realiza con mayor facilidad mientras el animal está bajo anestesia temporal de isoflurano. Si se realiza correctamente, este proceso no dura más de 5 minutos por animal; sin embargo, se recomienda encarecidamente el uso de pomada oftálmica.
    1. Anestesia animal: Coloque al animal en la cámara de inducción de anestesia con isoflurano. Comienza la anestesia con un flujo de oxígeno a 2 L/min y el isoflurano ajustado al 3%. Observa al animal hasta que alcance un nivel adecuado de anestesia (inmóvil con una frecuencia respiratoria de aproximadamente 1 respiración/s). Transfiere al animal de la cámara de inducción a la mascarilla anestésica ajustada a 2 L/min de flujo de oxígeno y 3% de isoflurano.
    2. Chaqueta animal: Coloque al animal una chaqueta del tamaño adecuado, pasando completamente las extremidades delanteras por las sisas y abrochando la chaqueta firmemente a lo largo de la espalda del animal (como se muestra en la Figura 3C).
    3. Sustituir el simulacro por el inserto de muestra: Utiliza un par de pinzas para quitar la cuña de bloqueo del conjunto de guía y muñeco y levanta cuidadosamente el muñeco fuera de la guía. Instala suavemente la muestra, insértala en la guía y luego vuelve a insertar la cuña de bloqueo.
    4. Saca al animal de la anestesia y colócalo en el sistema de jaula giratoria. Sujeta el anclaje de la jaula a la chaqueta del animal y activa el sistema de jaula giratoria.
  5. Realización de muestreo cOFM:
    1. Ajusta las bombas de microperfusión a 5 μL/min y realiza un lavado de 2 minutos para eliminar cualquier microburbuja que pudiera haber resultado de la instalación del inserto de muestreo cOFM.
    2. Cambia la configuración de la bomba de microperfusión al caudal deseado correctamente para el modo de bomba (por ejemplo, 1 μL/min).
    3. Activa el modo bombeo. Si se realiza muestreo fraccionado de cOFM, activa el colector de fracciones.
    4. Durante las etapas iniciales del muestreo de cOFM, realiza observaciones detalladas del tubo de empuje y tracción para asegurar la ausencia de burbujas de gas, ya que estas dificultarán el correcto funcionamiento de la máquina y la recogida de muestras y podrían poner en peligro al animal. Si se observan burbujas de gas, detener los componentes del sistema, desconectar al animal del sistema cOFM y eliminar las burbujas de gas mediante un lavado de aCSF a través del tubo.
    5. Durante toda la duración del proceso de muestreo de cOFM, realiza observaciones adicionales frecuentes del tubo de cOFM y del comportamiento animal. Si el comportamiento animal indica cambios repentinos en la salud, detenga inmediatamente los componentes del sistema y aborde la preocupación de salud animal. Consulta con el personal veterinario de la institución si es necesario.
  6. Desacoplar un animal del sistema cOFM:
    1. Desactiva el sistema de jaula giratoria y desconecta el amarre de la jaula de la chaqueta animal.
    2. Transfiere al animal a la cámara de inducción de anestesia con isoflurano, con el inserto de muestreo y el tubo de cOFM aún adheridos. Comienza la anestesia con un flujo de oxígeno a 2 L/min y el isoflurano ajustado al 3%. Observa al animal hasta que alcance un nivel adecuado de anestesia (inmóvil con una frecuencia respiratoria de aproximadamente 1 respiración/s). Transfiere al animal de la cámara de inducción a la mascarilla anestésica fijada en 2 L/min de flujo de oxígeno y 3% de isoflurano.
    3. Sustituye el inserto de muestreo por un inserto ficticio: Utiliza un par de pinzas para quitar la cuña de bloqueo del conjunto de guía y inserto de muestra, y levanta cuidadosamente el inserto de muestreo fuera de la guía. Vuelve a instalar suavemente el inserto de dummy en la guía y luego vuelve a insertar la cuña de bloqueo.
    4. Descamisa: Desengancha los cierres de la parte trasera de la chaqueta del animal y quítala suavemente del animal.
    5. Recuperación y observación del animal: Retirar al animal de la anestesia con isoflurano y colocarlo en una jaula limpia de recuperación, proporcionando observación continua hasta que recupere completamente la conciencia y la reclinación esternal. Vuelve a colocarla en una jaula casera una vez que el animal esté completamente recuperado.
  7. Recogida y almacenamiento de muestras:
    1. Muestreo fraccionado:
      1. Retirar los tubos de recogida de fracciones del colector y colocarlos sobre hielo para su transporte a corto plazo.
      2. Pesa cada tubo de recogida y compáralo con el peso previo a la recolección para verificar el volumen de la muestra.
      3. Proceder a análisis aguas abajo de muestras de cOFM o colócalas en un congelador a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.
    2. Muestreo recirculado:
      1. Dejando el tubo de extracción conectado a la salida del inserto de muestreo cOFM (eje más corto), despega del resto del montaje y coloca el tubo y el inserto de muestreo en un tubo microcentrífuga nuevo y limpio.
      2. Coloca una aguja estéril de 18G en una jeringuilla estéril de 1 mL a 5 mL y llénala con aire.
      3. Inserta cuidadosamente la aguja en el conector de tubo con brida en el extremo de entrada del tubo de pull.
      4. Asegurándose de que el inserto de muestreo de cOFM permanezca en el tubo de la microcentrífuga, presione el émbolo de la jeringuilla para expulsar el volumen de muestra recirculado de cOFM del tubo de extracción con aire. Asegúrate de que toda la muestra de cOFM sea expulsada del tubo de extracción y la lleve al tubo de la microcentrífuga, desmontando la jeringuilla y rellenando con aire si es necesario.
      5. Colocar la muestra recirculada de cOFM sobre hielo para su transporte a corto plazo.
      6. Procede a análisis aguas abajo o colócalos en un congelador a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.
  8. Almacenar suministros de cOFM si se repite el muestreo de cOFM en el mismo animal:
    NOTA: El fabricante no recomienda la reutilización de desechables cOFM, como insertos de muestreo y tubos de entrada/salida.
    1. Enjuaga el tubo push-pull cOFM con aproximadamente 500 μL de aCSF estéril o solución salina a una tasa no superior a 10 μL/min. A continuación, se aplica un lavado similar de 1-2 mL de etanol al 70%. Por último, utiliza una jeringuilla de 5 o 10 mL equipada con una aguja de 18G y un conector de tubo con brida para enjuagar el tubo con aire.
    2. Enjuague los tubos de entrada y salida del inserto de muestreo cOFM con 50 μL de aCSF estéril o solución salina utilizando una jeringuilla de vidrio hermética equipada con un conector de tubo con brida. A continuación, 50 μL de etanol al 70%. Desconecta el inserto de muestreo de cOFM del conector de la tubería y guárdalo en un vial lleno de etanol al 70% hasta que esté listo para su reutilización.

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Resultados

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Diversas medidas evaluativas para determinar el éxito experimental pueden ocurrir en etapas experimentales intermedias o culminantes, dependiendo de la naturaleza específica de la patología subyacente y del modelo animal de investigación. Para los exámenes de biología de GBM, la imagen bioluminiscente (BLI) puede utilizarse como medida evaluativa intermedia para la eficacia del injerto celular tumoral mediado por guía de cOFM (Figura 4A). Sin embargo, esto s...

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Discusión

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Los procedimientos de cOFM descritos en este protocolo tienen el potencial de revolucionar el estudio de las enfermedades del SNC gracias a su capacidad para muestrear longitudinalmente componentes endógenos de la ISF del tejido patológico. Sin embargo, el éxito investigativo de emplear esta metodología depende del correcto desempeño de varios pasos críticos. De estos, la colocación correcta y segura de la cánula guía cOFM es una de las más importantes. Procedimientos quirúrgicos o estra...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la subvención 1R01NS096376 del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Ictus, 1R01NS112856 y P50CA221747 SPORE para Enfoques Traslacionales al Cáncer Cerebral (A.U.A.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Broca de 0,7 mmHerramientas Científicas Fines19008-07Perforación de agujeros de rebala
Jeringuilla de 1 a 5 mLBD#309646Retreival de muestra de perfusado recirculado
Aguja de 18 gBD#305195Retreival de muestra de perfusado recirculado
Aguja de 30GBD Ultra-Fine328438Durámetro punzante
Suturas vicryl 4-0Dynarex9130La cirugía de cierre sería
Toallitas con alcoholFisherBrand22-363-750Desinfección cutánea en el sitio quirúrgico
Tornillos de anclajeBASiMD-1310Colocación de la cabeza del cOFM
Líquido cefalorraquídeo artificial (LCR)BASi (Joanneum)MD-2400Muestreo ISF
Inserto ficticio cOFMBASi (Joanneum)cOFM-D- #Colocación de la cabeza del cOFM
Guía cOFMBASi (Joanneum)cOFM-GD-#- #Colocación de la cabeza del cOFM
Portaguía cOFMBASi (Joanneum)OFM-STM-1Colocación de la cabeza del cOFM
Inserto de infusión cOFMBASi (Joanneum)cOFM-I- #Inyección celular
Cuña de bloqueo cOFMBASi (Joanneum)cOFM-LOCKColocación de la cabeza del cOFM
Inserto de muestreo cOFMBASi (Joanneum)cOFM-S-XMuestreo ISF
Aplicadores con punta de algodónFisherBrane22363160Absorción de fluidos, aplicación de peróxido de hidrógeno
Línea celular de glioma de ratón CT2ASeyfried Lab - Universidad de BostonNACélulas tumorales injertadas
Agente de cementación dentalIvoClar595953USColocación de la cabeza del cOFM
Luz de curado dentalHenry Schein5700253Colocación de la cabeza del cOFM
Crema depilatoriaVeet3116875Depilación del sitio quirúrgico
Afeitadora eléctricaWahl Clipper Corp. 8841Depilación del sitio quirúrgico
Pinzas de punta finaHerramientas Científicas Fines5SFIncisión, colocación del tornillo del anclaje
Conectores de tubos con bridaBASi (Joanneum)MD-1510Inyección celular
Frascos de recogida de fraccionesBASi (Joanneum)MF-5281Almacenamiento fraccionado de muestras
Jeringuilla de vidrio hermética (25 y mu; L)Hamilton80465Inyección celular
Peróxido de hidrógeno (1-3%)WalgreensNDC: 0363-0268-32Limpieza de superficies del cráneo
Jeringuillas de insulina (0,3 a 1,0 mL) con agujas de 31GBD Ultra-Fine328438Administración de anestésicos y analgésicos
Tubos microcentrífugasBasix02-682-002Retreival de muestra de perfusado recirculado
Microtaladro y soporte estereotácticoAparato de Harvard75-1874Perforación de agujeros de rebala
Chaqueta de ratónLomirMJ 02Conexión animal con el sistema de jaulas giratorias
Tubería de bajo acoplamiento OFMBASi (Joanneum)OFM-PP2-100-LBMuestreo ISF
OFM-Bomba - Bomba de microperfusiónBASi (Joanneum)MPP102-PCMuestreo ISF
Ungüento oftálmicoDechra211-38Lubricación ocular perisugrícola
Aguja de muestreo de metal pasivadaBASi (Joanneum)MW-2310Almacenamiento fraccionado de muestras
Bolsa de perfusadoBASi (Joanneum)OFM-BAGMuestreo ISF
Solución fisiológica salinaMedicina de UCI y nbsp;0990-7983-03Limpieza de la superficie del cráneo, ayuda en la perforación de agujeros de rebarba
Hisopos de povidona-yodoPDI HealthcareSKU B40600Desinfección cutánea en el sitio quirúrgico
PortasondasStoelting51633
Colector de fracciones refrigeradoBASi (Joanneum)MD-1201Almacenamiento fraccionado de muestras
Sistema de jaula giratoriaBASi (Joanneum)AMD-R RaturnCarcasa automatizada para muestreo cOFM despierto
Hojas y mangos de bisturíFisher Scientific & nbsp;22079693Incisión
DestornilladorColocación de la cabeza del cOFM
Adhesivo dental autograbado  TokuyamaImprimación de la superficie del cráneo para agente cementante
Tapón empujador de silicona para viales de colecciónBASi (Joanneum)MF-5283Almacenamiento fraccionado de muestras
Marco estereotácticoStoelting51725

Referencias

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