Reacción en cadena de la polimerasa digital en microgotas para la detección precisa de mutaciones en el cáncer de pulmón de células no pequeñas

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para detectar de manera sensible y específica mutaciones EGFR T790M mediante reacción en cadena de la polimerasa digital en gotas (ddPCR), que también se puede extender para identificar rápidamente otras mutaciones tumorales como G719S, L858R, L861Q y S768I.

Resumen

A escala mundial, el cáncer de pulmón sigue siendo el principal contribuyente a las muertes relacionadas con el cáncer, y su prevalencia ocupa el segundo lugar después de la del cáncer de riñón. El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPNM) constituye aproximadamente el 80-85% de todos los casos de cáncer de pulmón notificados. La mutación T790M en el gen EGFR es un determinante primario ampliamente reconocido de la resistencia adquirida a los inhibidores de la tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR-TKI). La presencia de esta afección se ha observado en aproximadamente el 50-60% de las personas que experimentan una enfermedad progresiva. Por lo tanto, la implementación de un enfoque rápido y altamente receptivo para detectar mutaciones T790M en el gen EGFR es esencial para la identificación rápida del cáncer de pulmón de células no pequeñas. En el estudio actual, se utilizó ddPCR para detectar la mutación T790M con un límite de detección de 10 copias/μL, que es 10 veces mayor que la sensibilidad de qPCR (1 × 10² copias/μL). Para las 15 muestras simuladas, la ddPCR fue capaz de detectar la presencia de mutaciones T790M en el gen EGFR, que se observó que estaban en niveles reducidos cuando se analizaron mediante qPCR. Se está investigando la detección de mutaciones T790M dentro del gen EGFR mediante un método de detección rápida para determinar su idoneidad.

Introducción

El cáncer de pulmón es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer a nivel mundial y se erige como la segunda neoplasia maligna más prevalente en general. El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) representa una mayoría significativa, aproximadamente del 80% al 85%, de todos los casos de cáncer de pulmón notificados 1,2,3,4. Para los pacientes diagnosticados con CPNM avanzado que albergan mutaciones en EGFR, el enfoque terapéutico establecido implica la aplicación de inhibidores de l....

Protocolo

Este estudio no involucró participantes humanos, tejidos humanos o experimentos con animales vivos; por lo tanto, no se requería aprobación ética formal. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales. El plásmido mutante T790M se sintetizó comercialmente. La sangre de cerdo utilizada para simular muestras clínicas se obtuvo de un proveedor certificado siguiendo las normas de bienestar animal, sin participación de animales vivos. Todos los demás reactivos, incluidas las perlas magnéticas, los cebadores, las sondas y las enzimas de PCR, se obtuvieron comercialmente y se utilizaro....

Resultados

Optimización de la extracción de ácidos nucleicos
El flujo de trabajo basado en ddPCR para detectar la mutación EGFR T790M se resume esquemáticamente en la Figura 1. Primero, determinamos la temperatura óptima de lisis. Como se muestra en la Figura 2A, una temperatura de escisión de 66 °C produjo el valor promedio de Ct más pequeño, lo que indica la escisión más eficiente. Por lo tanto, se seleccionó 66 °C para experimentos posteriores. A con.......

Discusión

El cáncer de pulmón, como la principal causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo, siempre ha sido un punto focal en la investigación médica. En este estudio, exploramos múltiples aspectos críticos del cáncer de pulmón, con el objetivo de proporcionar información más profunda sobre su diagnóstico, tratamiento y pronóstico. La piedra angular del diagnóstico y tratamiento precisos del cáncer de pulmón son las pruebas genéticas precisas. Como lo demuestran Zhao et

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1&veces; Tampón TE	Sangon Biotech	B548144	Tampón Tris-EDTA utilizado para la dilución de ADN
4 veces; Mezcla de enzimas Unimix-U	TargetingOne Bio	UNIMIXU-4X	ddPCR mezcla de enzimas
A300 Termociclador rápido	LongGene	A300	Amplificación de PCR
Analizador de biochip	SEED Bio	DigitalPCR-Biochip	Sistema de detección para PCR digital
Marcador de gota Instrumento de preparación de muestras	PCR digital Xinyi Biotechnology TD-2	Preparación de microgotas
Kit de extracción de ácidos nucleicos con perlas magnéticas	LemnisCare Technology	MXP-1005	Extracción de ácidos nucleicos
Chip generador de microgotas	TargetingOne Biotech	MG-Chip-01	Se utiliza para generar microgotas para ddPCR
NanoDrop	Allsheng	NC-500	Medición de la concentración de ácidos nucleicos después de la extracción de muestras
Espectrofotómetro NanoDrop ND-500	Allsheng Instrumentos	Espectrofotómetro ND-500	para cuantificación de ADN
Instrumento de PCR A300 Termociclador rápido	LongGene	A300	Termociclador para amplificación de PCR
Primers y sonda TaqMan	Sangon Biotech	Imprimadores sintetizados a medida	y sonda TaqMan para detección de T790M
instrumento qPCR Gentier mini	Tianlong Tecnología	Gentier mini	PCR en tiempo real instrumento
T790M mutación plásmido	Tsingke biología	T790M	Curva estándar y prueba límite de detección

Plataforma de