Reacción en cadena de la polimerasa digital en microgotas para la detección precisa de mutaciones en el cáncer de pulmón de células no pequeñas

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para detectar de manera sensible y específica mutaciones EGFR T790M mediante reacción en cadena de la polimerasa digital en gotas (ddPCR), que también se puede extender para identificar rápidamente otras mutaciones tumorales como G719S, L858R, L861Q y S768I.

Resumen

A escala mundial, el cáncer de pulmón sigue siendo el principal contribuyente a las muertes relacionadas con el cáncer, y su prevalencia ocupa el segundo lugar después de la del cáncer de riñón. El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPNM) constituye aproximadamente el 80-85% de todos los casos de cáncer de pulmón notificados. La mutación T790M en el gen EGFR es un determinante primario ampliamente reconocido de la resistencia adquirida a los inhibidores de la tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR-TKI). La presencia de esta afección se ha observado en aproximadamente el 50-60% de las personas que experimentan una enfermedad progresiva. Por lo tanto, la implementación de un enfoque rápido y altamente receptivo para detectar mutaciones T790M en el gen EGFR es esencial para la identificación rápida del cáncer de pulmón de células no pequeñas. En el estudio actual, se utilizó ddPCR para detectar la mutación T790M con un límite de detección de 10 copias/μL, que es 10 veces mayor que la sensibilidad de qPCR (1 × 10² copias/μL). Para las 15 muestras simuladas, la ddPCR fue capaz de detectar la presencia de mutaciones T790M en el gen EGFR, que se observó que estaban en niveles reducidos cuando se analizaron mediante qPCR. Se está investigando la detección de mutaciones T790M dentro del gen EGFR mediante un método de detección rápida para determinar su idoneidad.

Introducción

El cáncer de pulmón es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer a nivel mundial y se erige como la segunda neoplasia maligna más prevalente en general. El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) representa una mayoría significativa, aproximadamente del 80% al 85%, de todos los casos de cáncer de pulmón notificados 1,2,3,4. Para los pacientes diagnosticados con CPNM avanzado que albergan mutaciones en EGFR, el enfoque terapéutico establecido implica la aplicación de inhibidores de la tirosina quinasa (TKI) del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de primera, segunda o tercera ^{generación5,6,7}. Sin embargo, la mayoría de los pacientes tratados con EGFR-TKI de primera o segunda generación eventualmente desarrollan resistencia adquirida al medicamento. Esta resistencia se atribuye con frecuencia a la presencia de la mutación T790M en el gen EGFR, que se encuentra en aproximadamente el 50-60% de los pacientes que experimentan progresión de la enfermedad 8,9,10,11,12.

Tradicionalmente, las anomalías genéticas en el ADN tumoral de muestras de tejido se identifican mediante técnicas como la hibridación fluorescente in situ (FISH) o la secuenciación de próxima generación (NGS)^13,14. Sin embargo, las biopsias de tejido pueden ser un desafío debido a la inaccesibilidad del tumor, la mala salud del paciente o el contenido insuficiente de células tumorales 15,16,17. Como alternativa, las biopsias líquidas, particularmente de plasma, ofrecen una forma menos invasiva de identificar mutaciones impulsoras al detectar ADN tumoral circulante (ctDNA). Las células tumorales liberan ADN en el torrente sanguíneo, el líquido pleural, la saliva o las heces, lo que proporciona una fuente valiosa para el análisis genético^18,19. El perfil genético del ctDNA a menudo refleja la composición genética del tumor, ofreciendo una visión integral de la heterogeneidad tumoral, un factor crucial para un diagnóstico preciso y un tratamiento personalizado del cáncer^20,21.

Entre las diversas técnicas para identificar mutaciones de EGFR en sangre periférica, incluida la secuenciación, la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), la PCR digital, la cromatografía líquida de alta resolución desnaturalizante (DHPLC), el sistema de mutación refractaria a la amplificación (ARMS) y la PCR enriquecida con mutantes (ME-PCR), la PCR digital de microgotas (ddPCR) se ha convertido en una herramienta altamente efectiva para la detección de mutaciones de ctDNA^22,23. Su sensibilidad, precisión y capacidad superiores para detectar mutaciones de baja abundancia con alta precisión lo distinguen. A diferencia de la PCR tradicional, la ddPCR divide las muestras en miles de gotas, lo que permite la cuantificación absoluta de las secuencias de ADN diana sin curvas estándar. Esto lo hace excepcionalmente adecuado para detectar mutaciones raras como la mutación T790M en EGFR. A pesar de las ventajas de la ddPCR, su amplia aplicación clínica se ha visto limitada por los desafíos en la preparación de muestras, la optimización del sistema y el análisis comparativo del rendimiento con técnicas establecidas como la qPCR. Existe una brecha crítica en la optimización de los protocolos de ddPCR para la detección de mutaciones de ctDNA, particularmente con respecto a la sensibilidad, especificidad y reproducibilidad esenciales para la adopción clínica.

En este estudio, planteamos la hipótesis de que la ddPCR ofrece una sensibilidad y fiabilidad superiores para detectar la mutación EGFR T790M en el ADNct en comparación con los métodos tradicionales de qPCR. Nos centramos en optimizar el proceso de extracción de ácidos nucleicos para mejorar la eficiencia, seguido de la optimización de ddPCR para la detección de mutaciones. Además, comparamos el rendimiento de ddPCR y qPCR en términos de sensibilidad, especificidad y reproducibilidad utilizando muestras simuladas. Al evaluar sistemáticamente el potencial de la ddPCR, nuestro objetivo es establecerla como una alternativa viable y superior a la qPCR para la detección de mutaciones de EGFR en biopsias líquidas.

Protocolo

Este estudio no involucró participantes humanos, tejidos humanos o experimentos con animales vivos; por lo tanto, no se requería aprobación ética formal. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales. El plásmido mutante T790M se sintetizó comercialmente. La sangre de cerdo utilizada para simular muestras clínicas se obtuvo de un proveedor certificado siguiendo las normas de bienestar animal, sin participación de animales vivos. Todos los demás reactivos, incluidas las perlas magnéticas, los cebadores, las sondas y las enzimas de PCR, se obtuvieron comercialmente y se utilizaron según las instrucciones de los fabricantes.

Extracción de ácidos nucleicos
La extracción de ácidos nucleicos se realizó utilizando un kit de extracción de perlas magnéticas y un instrumento extractor de ácido nucleico completamente automático. El procedimiento estándar consistió en agregar 200 μL de muestra y 20 μL de proteinasa K a la columna 1 o 7 de la placa de pocillos profundos preempaquetada. Luego, se agregaron 15 μL de perlas magnéticas suministradas con el kit a la columna 2 u 8. El programa de extracción se inició en el instrumento, con la funda magnética colocada en su ubicación designada. Después de la extracción, el líquido de la columna 6 o 12 se transfirió a un nuevo tubo libre de nucleasas de 1,5 ml y se almacenó a -20 °C.

Para optimizar la extracción de ácidos nucleicos objetivo de baja concentración, se realizaron experimentos de optimización. Los parámetros de extracción recomendados fueron: temperatura de lisis 70 °C, tiempo de lisis 10 min, 1 min para cada una de las tres soluciones de lavado, secado de 2 min y elución de 3 min a 56 °C. Los parámetros más influyentes se optimizaron sistemáticamente: temperatura de lisis (62 °C, 66 °C, 70 °C, 74 °C y 78 °C), tiempo de lisis (1, 3, 5, 7 y 9 min) y tamaño de la perla magnética (100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm y 1000 nm). Estas optimizaciones se realizaron utilizando el plásmido mutante T790M a 1 × 10⁵ copias/μL. Las perlas magnéticas de 100 nm se suministraron con el kit de extracción, mientras que otros tamaños de partículas se obtuvieron de una empresa de biotecnología. La eficiencia de cada condición de extracción se evaluó mediante el análisis de las curvas de amplificación de qPCR y los valores de Ct de las muestras extraídas. El análisis estadístico de estos resultados se realizó mediante software estadístico.

ADN plásmido estándar
El plásmido mutante T790M del gen EGFR fue sintetizado a medida por una empresa de biotecnología. Se resuspendieron cuatro microgramos del plásmido seco en polvo en 100 μL de 1x Tampón TE. La concentración de plásmido se determinó utilizando un espectrofotómetro. El número de copias por microlitro se calculó mediante la fórmula: Número de copias/μL = [(6,02 × 10²³) × (concentración de ADN (ng/μL) × ^10-9)] / (longitud del ADN en pares de bases × 660). La concentración del fragmento sintetizado fue de 1,26 × 10,9 copias/μL. Este plásmido de reserva se diluyó 126 veces para obtener una concentración de trabajo de 1 × 10⁸ copias/μL.

Diseño y síntesis de imprimaciones
Los cebadores y una sonda TaqMan para la mutación EGFR T790M se diseñaron utilizando Primer 6 basado en principios de diseño de cebadores estándar. Cebador aguas arriba: 5′-CCTCACCTCCACCGTGC-3′; Cebador aguas abajo²⁴: 5′-AGGCAGCCGAAGGGCA-3′; Sonda: 5′-FAM-AGCTCATCACGCAGCTCA-BHQ1-3′. Todos los cebadores y sondas fueron sintetizados por un servicio comercial de síntesis de oligonucleótidos.

Establecimiento y optimización del sistema de detección cuantitativa de fluorescencia ddPCR y TaqMan
Un stock de plásmido T790M de 1 × 10⁸ copias/μL se diluyó a 1 × 10⁶ copias/μL utilizando un tampón TE 1× para su uso en experimentos de optimización de sistemas de ddPCR y qPCR.

Optimización del sistema de ddPCR: El sistema de ddPCR se optimizó en función de las recomendaciones del fabricante de la enzima. El sistema inicial recomendado incluía: 7,5 μL de mezcla de PCR 4x, 1,2-3 μL de cebador aguas arriba (10 μM), 1,2-3 μL de cebador aguas abajo (10 μM), 0,3-1,8 μL de sonda (10 μM), 1-15 μL de molde de ADN y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 30 μL. El ciclo de amplificación recomendado implicó 10 min iniciales a 95 °C, seguidos de 40 ciclos de 30 s a 94 °C y 60 s a 55-65 °C. La temperatura de recocido (55-61,8 °C), la concentración del cebador (1-3 μL), la concentración de la sonda (0,75-1,75 μL) y la concentración de la plantilla (3-15 μL) se optimizaron sistemáticamente. Los resultados de la optimización se analizaron estadísticamente utilizando software estadístico.

Optimización del sistema qPCR: El sistema qPCR se optimizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante de la enzima. El sistema inicial sugerido incluía: 5 μL de polimerasa Taq, 0,45 μL de 250 mM de MgCl2, 0,5-2,5 μL de cebador directo (10 μM), 0,5-2,5 μL de cebador inverso (10 μM), 0,5-2,5 μL de sonda (10 μM), 5 μL de muestra de ADN y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 25 μL. El programa de amplificación recomendado fue de 5 min a 95°C; seguido de 45 ciclos de 15 s a 95 °C y 30 s a 56-64 °C, con recogida de fluorescencia a 56-64 °C. Se optimizaron la temperatura de recocido (56-64 °C), la concentración del cebador (1-3 μL), la concentración de la sonda (0,5-2,5 μL) y la concentración de la plantilla (1-5 μL). El análisis estadístico de estos resultados se realizó mediante software estadístico.

ddPCR y prueba de sensibilidad de PCR cuantitativa de fluorescencia Taqman
Para evaluar la sensibilidad de la ddPCR frente a la qPCR, el plásmido T790M de 1 × 10⁸ copias/μL se diluyó en serie 10 veces utilizando 1x TE Buffer para crear un gradiente de concentración que oscilaba entre 10⁶ y 10¹ copias/μL. Para la ddPCR, se prepararon siete soluciones de reacción de acuerdo con el sistema de ddPCR optimizado, una para cada concentración, incluido un control negativo. Las muestras se cargaron en un chip generador de microgotas y se procesaron con un instrumento de generación de gotas para generar microgotas. Estas gotas se amplificaron utilizando un termociclador de PCR y posteriormente se analizaron mediante un instrumento de detección de PCR digital. Al mismo tiempo, se prepararon siete soluciones de reacción basadas en el sistema de qPCR optimizado, con plantillas idénticas. Estos se ejecutaron en un instrumento de PCR en tiempo real para evaluar las sensibilidades respectivas de los dos enfoques (n = 3).

Pruebas de repetibilidad ddPCR
Para evaluar la repetibilidad, se diluyó ADN plasmídico T790M estándar a 1 × 10⁸ copias/μL para generar estándares de concentración alta (1 × 10⁶ copias/μL), media (1 × 10⁴ copias/μL) y baja (1 × 10² copias/μL). Se prepararon seis soluciones de reacción de acuerdo con el sistema de ddPCR optimizado. Las muestras se cargaron en un chip generador de microgotas y se procesaron con un instrumento de generación de gotas para formar microgotas. Luego, las microgotas se amplificaron con un termociclador y se analizaron mediante un instrumento de detección de PCR digital. Se incluyó un control negativo. El experimento se realizó por triplicado. La reproducibilidad se evaluó comparando los perfiles de amplificación y calculando los valores del coeficiente de variación (CV) de las tres réplicas experimentales.

Pruebas de muestras analógicas
Para probar la confiabilidad de los sistemas ddPCR y qPCR de mutación T790M, usamos sangre de cerdo mezclada aleatoriamente con concentraciones altas y bajas de plásmidos estándar de mutación T790M respectivamente, y se usó sangre de cerdo sin plásmidos estándar mixtos como muestras negativas, y se prepararon 15 muestras simuladas al azar, y se extrajo ácido nucleico de las muestras simuladas. y detectado mediante los métodos ddPCR y qPCR, respectivamente.

Análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron en al menos tres réplicas técnicas. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 10. Las diferencias entre los grupos se analizaron mediante la prueba t de Student o el análisis de varianza de una vía (ANOVA), según correspondiera. Un valor de p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Optimización de la extracción de ácidos nucleicos
El flujo de trabajo basado en ddPCR para detectar la mutación EGFR T790M se resume esquemáticamente en la Figura 1. Primero, determinamos la temperatura óptima de lisis. Como se muestra en la Figura 2A, una temperatura de escisión de 66 °C produjo el valor promedio de Ct más pequeño, lo que indica la escisión más eficiente. Por lo tanto, se seleccionó 66 °C para experimentos posteriores. A con...

Discusión

El cáncer de pulmón, como la principal causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo, siempre ha sido un punto focal en la investigación médica. En este estudio, exploramos múltiples aspectos críticos del cáncer de pulmón, con el objetivo de proporcionar información más profunda sobre su diagnóstico, tratamiento y pronóstico. La piedra angular del diagnóstico y tratamiento precisos del cáncer de pulmón son las pruebas genéticas precisas. Como lo demuestran Zhao et

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1&veces; Tampón TE	Sangon Biotech	B548144	Tampón Tris-EDTA utilizado para la dilución de ADN
4 veces; Mezcla de enzimas Unimix-U	TargetingOne Bio	UNIMIXU-4X	ddPCR mezcla de enzimas
A300 Termociclador rápido	LongGene	A300	Amplificación de PCR
Analizador de biochip	SEED Bio	DigitalPCR-Biochip	Sistema de detección para PCR digital
Marcador de gota Instrumento de preparación de muestras	PCR digital Xinyi Biotechnology TD-2	Preparación de microgotas
Kit de extracción de ácidos nucleicos con perlas magnéticas	LemnisCare Technology	MXP-1005	Extracción de ácidos nucleicos
Chip generador de microgotas	TargetingOne Biotech	MG-Chip-01	Se utiliza para generar microgotas para ddPCR
NanoDrop	Allsheng	NC-500	Medición de la concentración de ácidos nucleicos después de la extracción de muestras
Espectrofotómetro NanoDrop ND-500	Allsheng Instrumentos	Espectrofotómetro ND-500	para cuantificación de ADN
Instrumento de PCR A300 Termociclador rápido	LongGene	A300	Termociclador para amplificación de PCR
Primers y sonda TaqMan	Sangon Biotech	Imprimadores sintetizados a medida	y sonda TaqMan para detección de T790M
instrumento qPCR Gentier mini	Tianlong Tecnología	Gentier mini	PCR en tiempo real instrumento
T790M mutación plásmido	Tsingke biología	T790M	Curva estándar y prueba límite de detección