Inyección guiada por ecocardiografía para la administración de células madre intramiocárdicas dirigida y confiable en un modelo de infarto de miocardio en ratas

Resumen

Este artículo detalla un protocolo optimizado para inyecciones intramiocárdicas guiadas por ecocardiografía en modelos de infarto de miocardio en ratas utilizando una aguja de 29 G x 88 mm. Esta técnica garantiza una administración robusta, precisa y reproducible de agentes terapéuticos directamente en la zona periinfarto.

Resumen

La inyección intramiocárdica guiada por ecocardiografía (EGI) es una técnica mínimamente invasiva para administrar terapias con células madre en modelos preclínicos de infarto de miocardio (IM). En comparación con los enfoques tradicionales de tórax abierto, EGI ofrece una mejor traducibilidad clínica, una menor invasividad y un impacto fisiológico minimizado en el animal. Si bien EGI está bien establecido en modelos murinos, su aplicación en ratas sigue siendo limitada debido a desafíos anatómicos y técnicos. En particular, el adelgazamiento de la pared anterior del ventrículo izquierdo (DAVI) en las regiones infartada y periinfarto complica la administración miocárdica segura y precisa, ya que el grosor de la pared puede caer por debajo del tamaño del bisel de la aguja de las agujas de 27 G o 28 G de uso común, lo que aumenta el riesgo de perforación ventricular o parto fallido. Para abordar esta limitación, optimizamos un protocolo para EGI en modelos de infarto de miocardio en ratas utilizando agujas Spinocan 29 G. La aguja más larga y de menor diámetro permite un objetivo preciso del tejido miocárdico delgado, minimizando el daño y mejorando la precisión de la inyección, independientemente del grosor de la LVAW. Esta técnica es compatible con las plataformas estándar de ecocardiografía transtorácica y elimina la necesidad de toracotomía, permitiendo estudios longitudinales en el mismo animal. Nuestro método refinado permite una administración robusta y reproducible de agentes terapéuticos en el miocardio viable adyacente a la zona del infarto, donde las terapias regenerativas son más efectivas. Al mejorar la seguridad y la precisión de la orientación, este enfoque aumenta la relevancia traslacional de la investigación cardíaca preclínica y respalda el desarrollo de protocolos estandarizados en todos los laboratorios.

Introducción

Las enfermedades cardiovasculares siguen siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, siendo el infarto de miocardio (IM) un contribuyente significativo a las afecciones cardíacas agudas y crónicas¹. A pesar de los avances en el manejo farmacológico e intervencionista, la capacidad regenerativa del corazón humano adulto es limitada, lo que a menudo resulta en remodelación adversa y progresión a insuficiencia cardíaca ^2,3. En consecuencia, las terapias basadas en células madre han ganado atención como estrategias potenciales para reparar el miocardio dañado, preservar la función cardíaca y mejorar los resultados clínicos⁴.

Los modelos preclínicos sólidos son esenciales para evaluar la seguridad, la eficacia y las estrategias de administración de estas terapias. Entre los modelos de animales pequeños, las ratas ofrecen varias ventajas, incluido un tamaño cardíaco manejable, técnicas de infarto bien caracterizadas y respuestas de remodelación cardíaca traslacionalmente relevantes⁵. Convencionalmente, la administración intramiocárdica de células madre en modelos de infarto de miocardio en ratas se logra mediante toracotomía, lo que permite la visualización directa del lugar de inyección⁶. Sin embargo, este enfoque es invasivo, introduce riesgos significativos en los procedimientos e impide la repetición de intervenciones en estudios longitudinales. Además, carece de alineación con las modalidades de administración clínica, como la inyección basada en catéter o percutánea⁷.

La inyección intramiocárdica guiada por ecocardiografía (EGI) es una alternativa mínimamente invasiva que permite la administración dirigida de agentes terapéuticos bajo guía de imágenes en tiempo real. Si bien está bien establecido en modelos murinos, el uso de EGI en modelos de ratas ha sido limitado. EGI se desarrolla más ampliamente en ratones que en ratas, principalmente porque la mayoría de las investigaciones cardiovasculares se han centrado históricamente en ratones como el modelo preclínico dominante⁸. Además, el tamaño más pequeño y la anatomía del corazón de los ratones permitieron la optimización de los procedimientos guiados por ultrasonido⁹. Por el contrario, las ratas tienen una pared torácica más gruesa y un mayor movimiento respiratorio, lo que complica las imágenes estables y de alta resolución durante los procedimientos¹⁰.

Los avances en la tecnología de ultrasonido de alta frecuencia han hecho factible la EGI en ratas, lo que aumenta la relevancia clínica de su uso. Sin embargo, el adelgazamiento de la pared anterior del ventrículo izquierdo (LVAW) en las regiones infartadas sigue siendo un desafío importante para EGI en roedores. En ratas, el grosor de la pared a menudo disminuye a menos de 1 mm, mientras que las agujas estándar de 27 G o 28 G tienen longitudes de bisel de 1,25-1,5 mm, lo que aumenta el riesgo de perforación ventricular o administración celular mal dirigida. Para abordar esta limitación, refinamos la técnica EGI en ratas utilizando agujas Spinocan de 29 G x 88 mm. Estas agujas tienen una longitud de bisel de 1 mm, lo que permite una administración precisa y atraumática de células en el miocardio adelgazado de las regiones del infarto y el periinfarto. El procedimiento se realiza mediante ecocardiografía transtorácica de alta resolución, lo que permite la visualización de puntos de referencia anatómicos y la trayectoria de la aguja en tiempo real.

Este protocolo EGI refinado proporciona un método mínimamente invasivo y reproducible para la administración dirigida de agentes terapéuticos en el miocardio periinfarto en modelos de rata con infarto agudo y crónico, independientemente del grosor de la DAVI. Facilita la inyección en zonas fronterizas viables, sitios críticos para lograr beneficios terapéuticos, al tiempo que reduce significativamente la carga quirúrgica y el tiempo de recuperación en comparación con los enfoques de tórax abierto. Además, apoya estudios longitudinales que involucran inyecciones repetidas e imágenes de seguimiento, reduciendo así el número de animales de acuerdo con el principio 3R (Reemplazo, Reducción, Refinamiento)¹¹. El protocolo es adaptable para la administración de agentes farmacológicos, terapias génicas, biomateriales y varios tipos de células madre. Al estandarizar EGI en modelos de rata y alinearse con las modalidades de administración clínica, este enfoque mejora la reproducibilidad en todos los laboratorios y fortalece la relevancia traslacional de la investigación cardíaca preclínica.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Local de UHasselt (Comisión de Ética para la Experimentación Animal, UHasselt, Diepenbeek, Bélgica, ID202308 y ID202497) y se llevaron a cabo de acuerdo con la Directiva de la UE 2010/63/UE.

1. Configuración del equipo

1. Encienda la plataforma de imágenes por ultrasonido, la plataforma calentada integrada, la unidad de monitoreo fisiológico y el calentador de gel.
   NOTA: Para permitir una visualización clara y suficientemente detallada de la pared anterior del ventrículo izquierdo durante el procedimiento EGI, se recomienda un sistema de ultrasonido de alta frecuencia equipado con un transductor de matriz lineal ≥ de 15 MHz que proporcione una resolución axial de aproximadamente 75 μm.
2. Encienda la almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal de la rata durante la depilación del pecho.
3. Seleccione el transductor apropiado e inicialice el motor 3D para garantizar un rango completo de movimiento del transductor.
   NOTA: Además de utilizar el micromanipulador del sistema de barandillas de la plataforma del animal, el motor 3D permite ajustes de transductores de alta precisión, lo que puede facilitar la alineación con la aguja de inyección cuando sea necesario. Si es necesario, el procedimiento también se puede realizar sin el motor 3D.
4. Asegúrese de que el sistema esté alineado correctamente antes de obtener imágenes. Coloque el micromanipulador de tornillos que controlan la plataforma del animal en una posición neutral (es decir, centrado dentro del rango completo de movimiento). Centre la plataforma del animal en el medio del sistema de barandillas. Coloque el sistema de montaje del transductor de modo que el transductor esté alineado directamente sobre el centro de la plataforma del animal.

2. Preparación y anestesia de animales

1. Pese la rata y calcule el volumen requerido de buprenorfina (0,04 mg / kg) para administrar para aliviar el dolor.
2. Coloque la rata en una cámara de inducción conectada a una máquina de anestesia. Induzca la anestesia con isoflurano al 2,5% suplementado con oxígeno a un caudal de 2 L/min.
3. Una vez inducida la anestesia, transfiera la rata a una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal a 37 0,5 °C. Mantenga una anestesia adecuada colocando el hocico de la rata en un cono nasal conectado al sistema de anestesia, administrando un flujo constante de isoflurano al 1-3% suplementado con 1-1,5 L / min de oxígeno, ajustado según sea necesario para garantizar una sedación adecuada.
4. Afeitar el pecho de la rata y eliminar el vello residual con crema depilatoria. Después de la depilación, desinfecte el lugar de la inyección alternando un agente exfoliante quirúrgico apropiado (p. ej., povidona yodada) con etanol al 70%, repetido 3 veces. Aplique gel oftálmico en ambos ojos para evitar la sequedad.
5. Administre la dosis precalculada de buprenorfina por vía intramuscular en la pata trasera para minimizar las molestias relacionadas con la EGI.
6. Transfiera la rata de la almohadilla térmica a la plataforma para animales del sistema de imágenes por ultrasonido. Asegure una administración de anestesia constante a través del cono nasal integrado de la plataforma, manteniendo un flujo constante de isoflurano al 1-3% en oxígeno de 1-1,5 L/min. Asegure las patas de la rata en los electrodos de la plataforma, aplicando una pequeña cantidad de gel de electrodos para garantizar una calidad de señal óptima. Inserte la sonda de temperatura rectal para un control continuo de la temperatura corporal.
   NOTA: El monitoreo continuo de los parámetros fisiológicos es esencial durante los procedimientos de imágenes e inyecciones. La frecuencia cardíaca (FC), la frecuencia respiratoria (RR) y la temperatura corporal de la rata deben permanecer dentro de rangos aceptables para evitar complicaciones relacionadas con la anestesia. Como guía general, la FC debe estar en el rango de 250-400 lpm, mientras que la RR debe ser de al menos 30 respiraciones por minuto. Si la FC o el RR caen por debajo de estos umbrales, disminuya inmediatamente la concentración de isoflurano (por ejemplo, del 2-3% al 1-2%) y verifique que el animal permanezca en la posición adecuada y no se vuelva hipotérmico. Los ajustes deben hacerse gradualmente, con un estrecho seguimiento hasta que los parámetros vuelvan a los niveles objetivo.
7. En esta etapa, adquiera las imágenes de referencia o previas a la inyección deseadas. En general, se recomiendan imágenes paraesternales de eje largo (PSLAX) y eje corto (SAX) tanto en modo B como en modo M, junto con imágenes de cuatro cámaras, para la evaluación funcional y anatómica inicial.
   NOTA: Las imágenes generales se pueden realizar con el sistema configurado como se muestra en la Figura 1A. Para el procedimiento de inyección, será necesario reposicionar la plataforma del animal y ajustar el transductor en consecuencia. Si bien las imágenes en modo B de PSLAX se utilizan como guía durante la inyección, estas imágenes pueden no ser óptimas para los análisis funcionales post-hoc debido a la necesidad de una alineación precisa de la aguja.

3. Procedimiento de inyección intramiocárdica guiada por ecocardiografía

NOTA: A partir de este momento, se requieren dos operadores para realizar con éxito la inyección. El operador A es responsable de manipular la plataforma del animal y monitorear la imagen de ecocardiografía en vivo, mientras que el operador B debe colocarse detrás del soporte de inyección para alinear con precisión la aguja y el transductor.

1. Prepare el sistema de inyección conectando una aguja guía de 22 G a una jeringa de 1 ml. Coloque la jeringa con la aguja guía en el soporte de inyección y asegure la abrazadera de inyección.
   NOTA: La aguja de 29 G x 88 mm es demasiado flexible para perforar directamente la piel y las capas musculares; La aguja guía es necesaria para facilitar la inyección.
2. Alinee el transductor con el soporte de inyección para asegurarse de que se pueda visualizar la aguja. Ajuste la posición del transductor usando el soporte del transductor y la abrazadera de sujeción y, si es necesario, gire el soporte de inyección a lo largo de su riel para lograr la alineación adecuada.
3. Sin mover la rata, gire la plataforma del animal de modo que la muesca del transductor apunte al hombro derecho de la rata (Figura 1B-D). Esta configuración permite la adquisición de una imagen clara en modo B de PSLAX del ventrículo izquierdo. Verifique que la aguja guía permanezca dentro del campo de movimiento del transductor. Si está desalineado, ajuste la posición del transductor a través del sistema de motor 3D en lugar de alterar el soporte de inyección.
4. Una vez que se logre la alineación correcta del transductor de aguja, ajuste la imagen utilizando los tornillos micromanipuladores del riel de la plataforma animal. Mantenga la posición del transductor para preservar la alineación con la aguja. Puede ser necesaria una rotación o traslación adicional de la plataforma animal para optimizar la calidad de la imagen.
5. Visualiza el área infartada. Evalúe la extensión del infarto, el movimiento regional de la pared y el adelgazamiento de la pared, utilizando imágenes en modo B y modo M de PSLAX para evaluar la viabilidad del sitio de inyección. Aplique un enfoque de puntuación de movimiento de pared de 16 segmentos para identificar regiones acinéticas o severamente hipocinéticas, que representan el núcleo del infarto.
6. Identifique la zona de periinfarto y seleccione el sitio de inyección objetivo. Elija un área hipocinética adyacente al núcleo del infarto con un espesor de pared diastólica final superior a 1 mm, lo que permite la inserción completa del bisel de la aguja de 29 G en un ángulo poco profundo.
7. Usando el sistema de rieles, avance el soporte de inyección hacia la plataforma del animal. Alinee finamente la aguja con el centro exacto del transductor utilizando los tornillos del micromanipulador en el soporte de inyección.
   NOTA: La alineación precisa es fundamental. Si la aguja no está centrada en el transductor, no será visible durante la inyección.
8. Avance la aguja guía con el tornillo micromanipulador de inyección en el soporte de inyección hasta que se perfore la piel. Confirme que la punta de la aguja sea visible en la imagen de ultrasonido. Si la aguja no es visible, retraiga la aguja con cuidado con el tornillo micromanipulador 'inyectar' y repita el paso 3.7 para realinear.
9. Active la función de guía de aguja en el software de ultrasonido para confirmar la trayectoria de la aguja. Avance la aguja guía hacia la región diana predeterminada, colocando el bisel de la aguja aproximadamente a 1-2 mm de la pared anterior del ventrículo izquierdo (DAVI) (Figura 2A).
   NOTA: Evite pinchar el miocardio con la aguja guía para evitar sangrado excesivo o lesiones cardíacas.
10. Una vez colocada la aguja, haga que el operador A estabilice firmemente la aguja guía en su base, lo que garantiza una visualización constante de la aguja en la pantalla de ultrasonido. Simultáneamente, pídale al operador B que afloje la abrazadera que sujeta la jeringa, retire la jeringa y prepare la jeringa inyectable. Indique al operador A que mantenga la aguja guía estacionaria.
11. Coloque la aguja de 29 G x 88 mm en la jeringa que contiene la inyección (operador B) y asegure la jeringa en el soporte de inyección. Guíe manualmente la aguja de 29 G x 88 mm a través de la aguja guía estacionaria, realizando pequeños ajustes con los tornillos del micromanipulador en el plano del eje x (izquierda o derecha de la sonda) si es necesario. Avance manualmente hasta que el bisel de la aguja se haga visible en la cavidad torácica en la ecografía.
    NOTA: Debido a la flexibilidad de la aguja de 29 G, puede doblarse durante la inserción en la cavidad torácica. Para minimizar esto, el operador A puede estabilizar la parte externa del eje de la aguja mientras el operador B avanza la aguja hacia la cavidad torácica.
12. Una vez que la aguja de 29 G x 88 mm pasa a través de la aguja guía y se hace visible en la ecografía, avance hacia el miocardio del LVAW utilizando los tornillos micromanipuladores para mayor precisión y seguridad. Confirme que el bisel de la aguja esté ubicado completamente dentro del miocardio (Figura 2B).
    NOTA: Debido al bisel relativamente largo de la aguja de 29 G en comparación con el grosor de la pared miocárdica, es fundamental asegurarse de que todo el bisel esté incrustado dentro del miocardio. Utilice la función 'Congelar imagen' para verificar la ubicación si es necesario. Aunque la calibración de la profundidad del ultrasonido puede ayudar en la precisión, en este protocolo, verificamos la profundidad seleccionando sitios de inyección con un grosor de pared diastólica final de >1 mm y confirmando visualmente que la punta de la aguja se acerca, pero no rompe, el borde endocárdico (Figura 2B).
13. Inyecte el inyectado lentamente en el miocardio (Operador B). El éxito de la inyección intramiocárdica se confirma visualmente mediante un punto ecogénico brillante/denso en el lugar de la inyección, que debe moverse sincrónicamente con el LVAW (Figura 2C). Para minimizar el reflujo de la inyección, espere aproximadamente 10 s después de completar la inyección antes de retraer la aguja.
14. Primero, retire la jeringa con las agujas del soporte de inyección para minimizar el riesgo de lesiones por pinchazo de aguja. A continuación, retire con cuidado la rata de la plataforma del animal y deje que se recupere en una almohadilla térmica. Monitoree los parámetros vitales continuamente hasta la recuperación completa de la anestesia.

Resultados

Validación de la precisión de la inyección mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo y ex vivo (BLI)
Para evaluar el éxito y la eficiencia del EGI, primero se transdujeron células madre para expresar luciferasa de luciérnaga (Fluc) a través de un vector lentiviral, lo que permitió el seguimiento in vivo mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI). BLI confirmó un parto i...

Discusión

A medida que avanza la investigación preclínica centrada en terapias regenerativas para restaurar el corazón después de infartos de miocardio, persisten obstáculos con respecto a la administración óptima de agentes terapéuticos¹². Las técnicas de EGI mínimamente invasivas se favorecen cada vez más sobre los abordajes de tórax abierto porque imitan mejor el parto clínico percutáneo, mejoran el bienestar animal y permiten administraciones rep...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
21? Transductor MHz MX250	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	/	Transductor de ultrasonidos de alta frecuencia compatible con el sistema Vevo 3100
Cinta quirúrgica 3M Transpore	3M	1527	Para asegurar las patas del animal a la plataforma del animal
Aquasonic  100 Gel de transmisión de ultrasonidos	Laboratorios Parker BV	01-08	Garantiza un acoplamiento acústico adecuado entre el transductor y la piel del animal para una calidad de imagen óptima
Bupaq 0.3 mg/mL Solución inyectable para perros y gatos	Richter Pharma AG	57446/4008	Analgésico opioide (buprenorfina) administrado para el manejo del dolor
ISOFLUTEK  1000	Alivira	/	Anestésico inhalatorio a base de isoflurano
Calentador de gel multibotella 230 V	Laboratorios Parker BV	83-03-20 CE (LCD)	Calienta el gel de ultrasonido a la temperatura corporal para evitar la hipotermia de las molestias de los animales
Signagel Gel de electrodos	Laboratorios Parker BV	15-25	Aplicado a los electrodos de ECG para mejorar la conducción de señales para el monitoreo fisiológico
PIÑA 29 G X 88 MM	Bbraun	4501900	Aguja de calibre fino para una inyección intramiocárdica precisa
Jeringa Terumo de 3 partes con aguja hipodérmica preconectada	Terumo Europe N.V.	MDSS01S2516E	Se utiliza para montar y asegurar la aguja guía de 22 G y la aguja de inyección de 29 G para una administración controlada en el miocardio.
Unidad de monitorización fisiológica THM150	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	/	Monitorea los signos vitales como la frecuencia cardíaca, la frecuencia respiratoria y la temperatura corporal del animal durante el procedimiento.
Veet Minima Pure	Reckitt Benckiser	/	Crema depilatoria
Vevo 3100	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	/	Sistema de ultrasonido de alta resolución
Gel oftálmico de carbómero Vidisic 980 2mg/g	Bausch + Lomb	/	Aplicado a los ojos de un animal anestesiado para evitar la sequedad de la córnea