Este estudio establece un protocolo estandarizado para aislar hepatocitos primarios de ratones con enfermedad hepática esteatótica asociada a disfunción metabólica (MASLD), lo que permite investigaciones relevantes para la enfermedad de esteatosis y disfunción metabólica sin carga lipídica artificial. El método produce hepatocitos de alto rendimiento y alta viabilidad, adecuados para estudios mecánicos y terapéuticos.
Artículo de método
Un Protocolo Sencillo para el Aislamiento y Cultivo de Hepatocitos de Ratones MASLD
En este artículo
Resumen
Resumen
La enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica (MASLD), caracterizada por la acumulación patológica de lípidos (esteatosis) dentro de los hepatocitos, representa una carga sanitaria mundial significativa y creciente. Los cultivos primarios de hepatocitos de ratón sirven como modelos ex vivo indispensables para dilucidar la patogénesis de MASLD y las intervenciones terapéuticas. Sin embargo, el aislamiento fiable de hepatocitos de alta calidad de hígados esteatóticos sigue siendo un reto técnico. En este trabajo se presenta un protocolo sencillo para el aislamiento eficiente de hepatocitos primarios de ratones MASLD mediante la técnica de perfusión de colagenasa. Este protocolo genera hepatocitos que exhiben esteatosis inherente sin requerir inducción artificial a través de la suplementación con palmitato y ácido oleico, preservando así un fenotipo fisiológicamente más relevante. El protocolo produce hepatocitos altamente viables y de alta pureza y es universalmente aplicable para aislar grandes cantidades de hepatocitos de ratones MASLD. Además, es adecuado para la evaluación farmacológica o estudios de intervención genética. En resumen, proporcionamos un protocolo reproducible para aislar hepatocitos de alto rendimiento, alta pureza y altamente viables para estudios biológicos celulares posteriores para facilitar el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas y fármacos para MASLD.
Introducción
La enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica (MASLD) se caracteriza por la acumulación patológica de lípidos en los hepatocitos y representa el trastorno hepático crónico más prevalente a nivel mundial1. Se estima que la MASLD afecta al 38% de la población adulta mundial y se ha convertido en una amenaza significativa para la salud humana2. Los mecanismos de la MASLD no se han dilucidado completamente y las opciones de tratamiento son muy limitadas. El descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas y el desarrollo de agentes dirigidos para la MASLD se ha convertido en una necesidad clínica crítica. Los hepatocitos, como el tipo de célula predominante que compone el hígado, son el sitio principal del metabolismo hepático de la glucosa-lípidos-fármaco. Los hepatocitos primarios conservan una función más completa de los hepatocitos que las líneas celulares de hepatocitos y son una herramienta útil para estudiar los mecanismos de la enfermedad hepática y el desarrollo de fármacos3. El aislamiento y cultivo de hepatocitos primarios de ratones con hígado graso es una técnica fundamental para estudiar la fisiopatología del hígado, incluido el metabolismo de los lípidos, la resistencia a la insulina y las respuestas inflamatorias. Un protocolo previo establecido para el aislamiento de hepatocitos a partir de modelos murinos de enfermedad del hígado graso empleó la centrifugación en gradiente para permitir específicamente la separación de las poblaciones de hepatocitos normales y acumuladoras de lípidos. Por lo tanto, estos hepatocitos aislados cargados de lípidos constituyen un sistema modelo in vitro crítico para investigar la patobiología de la enfermedad del hígado graso3. El objetivo principal de este enfoque es obtener de manera fácil y económica hepatocitos altamente viables y de alto rendimiento que conserven características fenotípicas específicas de la enfermedad y, por lo tanto, sean capaces de imitar MASLD in vitro.
El procedimiento general para el aislamiento de hepatocitos en ratones consiste en un proceso de dos pasos que comienza con el lavado de la sangre del hígado con una solución de perfusión isotónica, como la solución salina equilibrada de Hank (HBSS), y luego digestión del hígado con una solución de digestión que contiene colagenasa. Los avances recientes en las técnicas de perfusión hepática y digestión enzimática han mejorado el rendimiento y la viabilidad de los hepatocitos primarios en ratones hembra4. Las mejoras en los métodos tradicionales de perfusión de colagenasa en dos pasos, como la optimización de la composición del tampón y el acortamiento de los tiempos de digestión, han sido fundamentales para adaptar los protocolos experimentales a las muestras de hígado graso. Los hepatocitos primarios sirven como modelos indispensables para dilucidar los mecanismos fisiopatológicos subyacentes a la MASLD y sus complicaciones cardiometabólicas, particularmente a través de su papel en la mediación de la diafonía corazón-hígado y las interacciones del eje hígado-vascular a través de mediadores endoteliales y factores angiogénicos 5,6. Estas células proporcionan información crítica sobre las redes de comunicación multiorgánicas que impulsan la progresión de la enfermedad, como lo demuestran las asociaciones clínicas entre MASLD, enfermedad renal crónica y cardiopatía isquémica7, al tiempo que ofrecen una plataforma fisiológicamente relevante para desarrollar terapias dirigidas que aborden las manifestaciones hepáticas y cardiovasculares del síndrome metabólico. La investigación in vitro actual de MASLD se basa predominantemente en hepatocitos normales estimulados por ácido palmítico/oleico (PA/OA) o en líneas celulares de hepatocitos humanos (por ejemplo, HepG2 y Huh7), que replican inadecuadamente las características fisiopatológicas de los hepatocitos esteatóticos en condiciones enfermas, lo que limita su relevancia traslacional para el estudio de las interacciones corazón-hígado-vascular. Este enfoque no logra capturar la disfunción metabólica crónica, el microambiente inflamatorio y la diafonía interorgánica específica de la enfermedad característica de la progresión de MASLD.
Este protocolo se puede utilizar para aislar hepatocitos de ratones MASLD, sin necesidad de añadir artificialmente tratamientos con ácido palmítico y oleico. En conclusión, presentamos un método simple y reproducible para la obtención de hepatocitos de alto rendimiento con una excelente viabilidad que es adecuado para la investigación en biología celular posterior para apoyar el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas y el desarrollo de fármacos para MASLD.
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Protocolo
Todos los pasos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Ciencia y Tecnología de China. En este estudio, los ratones machos C57BL/6J fueron alimentados con una dieta alta en grasas (HFD, #12492, Research Diet) durante más de 12 semanas.
1. Preparación de una placa o plato de cultivo recubierto de colágeno
- Añadir 15 mL de EtOH al 100% a 35 mL de H2O (ddH2O) bidestilado. Preparar una solución de colágeno tipo I 50 μg/mL en EtOH al 30%. Filtro con una punta de filtro estéril de 0,22 μm.
- Cubrir una placa o plato de cultivo celular con 30 μL de solución de colágeno porcm2. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
- Retire el exceso de líquido con una pipeta y seque la placa o plato de cultivo. Irradiar los platos recubiertos con luz ultravioleta durante 0,5 h para su esterilización. Conservar a 4 °C durante menos de 1 mes.
NOTA: La longitud de onda de la lámpara UV es de 254 nm y la intensidad UV no es inferior a 400 mw / m2. La distancia de la fuente de la lámpara UV a los platos recubiertos de colágeno es de 1 m.
2. Preparación de la solución de perfusión
- Unos días antes de aislar los hepatocitos, prepare los reactivos de aislamiento de hepatocitos y los medios de cultivo especificados en la Tabla 1. Filtre la solución de perfusión A y B con una punta de filtro estéril de 0,22 μm. Conservar a 4 °C durante menos de 1 mes. Prepare un baño de agua y ajuste la temperatura a 37 °C.
- Precalentar las soluciones de perfusión A y B en un baño de agua a 37 °C. Añadir 40 mg de colagenasa tipo IV a 80 mL de solución de perfusión B antes de la cirugía.
- Bombee EtOH al 75% a una velocidad de 4 mL/min durante 5 min utilizando una bomba peristáltica en RT. Cambie el tubo de la bomba de EtOH al 75% a la solución de perfusión A precalentada.
NOTA: Ensamble la unidad de llenado de circulación calentada de acuerdo con la configuración ilustrada en la Figura 1A.
3. Procedimiento quirúrgico
- Anestesiar al ratón con un método aprobado. Inyectar pentobarbital sódico (50 mg/kg) por vía intraperitoneal. Verifique la pérdida del reflejo de giro antes de continuar.
- Asegura las extremidades superiores e inferiores del ratón en una tabla de disección. Esterilizar el área quirúrgica con alcohol al 75%.
- Cortar a través de las membranas abdominales internas y externas usando instrumentos de disección. Gire los órganos viscerales hacia el lado izquierdo del ratón con un hisopo de algodón para exponer la vena cava inferior (VCI) y la vena porta hepática (VP).
- Presione la vena cava inferior con un hisopo de algodón para abultarla. Inserte una aguja permanente de 22-G paralela a la vena cava inferior.
- Retire la parte de hierro de la aguja permanente. Deje el catéter en la vena cava inferior. Conecte la aguja a una línea de perfusión con una punta de filtro de 0,22 μm.
NOTA: Una aguja permanente consta de una parte de aguja de hierro y una parte de catéter de plástico. Asegúrese de que la inserción sea precisa en la vena cava inferior y espere hasta que la aguja permanente se llene de sangre. Deshazte de todas las burbujas de aire de la aguja permanente. Complete todo el procedimiento rápidamente para evitar trombosis. - Ajuste la velocidad de perfusión a 5 mL/min de líquido de perfusión A. Comience la perfusión y observe el hígado hasta que parezca hinchado. Corta la vena portal inmediatamente.
- Masajee suavemente el hígado con un hisopo de algodón para asegurar un lavado completo de la sangre. Continúe la perfusión hasta que el hígado se vuelva de color amarillo terroso.
- Cambiar al líquido de perfusión B que contiene 0,05% de colagenasa tipo IV. Continúe la perfusión hasta que el hígado esté completamente digerido.
NOTA: El hígado tarda al menos 10 minutos por ratón en digerirse. Un volumen de 80 mL de solución de perfusión B que contiene colagenasa es suficiente para que un ratón digiera su hígado. El tejido hepático se somete a una digestión enzimática completa hasta lograr el máximo ablandamiento, alcanzando el parénquima capsular un estado de extrema fragilidad susceptible de disrupción mecánica. - Extrae el hígado del abdomen del ratón. Coloque el hígado en un plato de 10 cm que contenga DMEM.
- Proceda en un gabinete de bioseguridad. Triture el hígado hasta convertirlo en polvo con pinzas (el hígado bien digerido libera hepatocitos fácilmente).
- Filtre la suspensión a través de un filtro de malla de 70 μm en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL. Ajuste el volumen a 45 mL (por ratón) con medio DMEM.
- Centrifugar a 50 × g durante 4 min. Vierta el sobrenadante por completo.
- Vuelva a suspender el pellet con medio DMEM hasta un volumen final de 25 mL (por ratón). Vuelva a centrifugar a 50 × g durante 2 min.
- Vierta el sobrenadante por completo. Vuelva a suspender el pellet en 25 mL de medio de cultivo suplementado con 10% de FBS.
- Mezcle bien la suspensión. Tiñe las celdas con azul de tripano para contar. Proceda a inocular para el cultivo inmediatamente.
NOTA: Coloque 2 ml de medio que contenga 2 × 105 células por pocillo en platos de 6 pocillos recubiertos de colágeno. Reemplace el medio DMEM después de 2 h de la inoculación celular.
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Resultados
El protocolo actual se implementó en ratones machos C57BL/6J alimentados con HFD durante más de 12 semanas. Los hepatocitos primarios aislados fueron examinados para determinar su morfología y función. Obtuvimos un rendimiento promedio de 2 × 107 células por aislamiento a partir de aproximadamente 40 g de hígado de ratón. Se determinó que la viabilidad celular estaba entre el 85% y el 86% mediante la tinción con calceína AM de células vivas. El rendimiento de cada aislado de ra...
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Discusión
El aislamiento de hepatocitos viables de ratón implica un procedimiento crítico de dos pasos, comenzando con una perfusión vascular completa utilizando una solución isotónica para eliminar los componentes sanguíneos, seguida de una digestión enzimática controlada con solución de colagenasa activa 9,10. El éxito del aislamiento depende de mantener condiciones fisiológicas óptimas durante todo el proceso, en particular la estabilid...
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Divulgaciones
Los autores no informaron de ningún posible conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [No. 82373967].
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de centrífuga estériles de 50 ml | Nest | 602052 | |
| anticuerpo anti-HNF4&alfa; | Anticuerpo anti-IgG Immunoway | YM8517 | |
| Proteintech | 30000-0-AP | ||
| BODIPY | Thermo Fisher Scientific | D3922 | |
| CaCl2 | Merck (SigmaAldrich) | C5670 | |
| Termo de centrífuga | Sorvall ST16R | ||
| Colágeno Tipo I | Corning | 354236 | |
| Colgenasa, Tipo 4 | Sangon Biotech | A004186-0001 | |
| Aguja de retención | BRAUN | 4254074B | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| EGTA | Yeasen | 60339ES10 | |
| Etanol | Merck (SigmaAldrich) | 493511 | |
| Suero fetal bovino | Sigma | F2442 | |
| Glucosa | Merck (SigmaAldrich) | G7021 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| Isoginkgetin | MedChemExpress | HY-N2117 | |
| K2HPO4 | Merck (Supelco) | PHR2900 | |
| KCl | Merck (SigmaAldrich) | P3911 | |
| Na2HPO4 · 12H2O | Merck (SigmaAldrich) | 04273 | |
| NaCl | Merck (SigmaAldrich) | S9888 | |
| NaHCO3 | Merck (SigmaAldrich) | S6014 | |
| Filtro de aguja 0.22µ M | Millex-GP | SLGV033RB | |
| Nilo Red | Invitrogen | N1142 | |
| Penicilina/estreptomicina (100X) | Gibco | 15140122 | |
| Adenovirus recombinante | Obio Technology Corp., ltd. | Los adenovirus recombinantes que codifican el ratón marcado con bandera IER2 (Ad-Ier2, NM_010499.4) y el adenovirus de control (Ad-NC) fueron construidos por Obio Technology Corp., ltd. | |
| Pentobarbital sódico | Merck (SigmaAldrich) | P3761 | |
| Filtros de células estériles, 100 μ m | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Trypan Blue | Beyotime | ST2780-5g | |
| Bomba peristáltica de flujo variable | Longer | BT100-1F |
Referencias
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