Method Article

Protocolo actualizado para el montaje y uso de la matriz de minibiorreactores (MBRA)

DOI:

10.3791/68788

⸱

September 5th, 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Alkek Center for Metagenomics & Microbiome Research, Baylor College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El Minibioreactor Array (MBRA) es un sistema de cultivo de flujo continuo, personalizable y de alto rendimiento que permite el cultivo de comunidades microbianas complejas, lo que respalda experimentos paralelos para estudiar la dinámica del microbioma, las interacciones terapéuticas y las respuestas microbianas a factores ambientales.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El microbioma humano comprende comunidades microbianas diversas y dinámicas que desempeñan un papel esencial en la salud del huésped. Comprender estas comunidades y sus respuestas a los factores ambientales es fundamental para avanzar en la terapéutica basada en el microbioma. Los modelos tradicionales in vitro para cultivar microbiota de origen humano a menudo carecen de escalabilidad y requieren una amplia experiencia técnica, lo que limita su accesibilidad y rendimiento. Para abordar estas limitaciones, desarrollamos el sistema Minibioreactor Array (MBRA), una plataforma modular, de una sola etapa y flujo continuo para el cultivo de comunidades microbianas de alto rendimiento. Este sistema permite el cultivo paralelo de hasta 48 comunidades microbianas distintas, lo que respalda la flexibilidad experimental y mantiene el crecimiento estable de ecosistemas complejos. Este protocolo proporciona orientación detallada sobre la fabricación, el ensamblaje, la esterilización y la operación de MBRA. El diseño modular del sistema permite una fácil integración en cámaras anaeróbicas y admite la personalización para una amplia gama de aplicaciones experimentales. Se ha utilizado para estudiar las respuestas microbianas a los antibióticos, los compuestos dietéticos y la invasión de patógenos, y para detectar comunidades resistentes a patógenos. Con su accesibilidad, escalabilidad y reproducibilidad, el MBRA representa un poderoso sistema modelo para investigar las interacciones microbianas y avanzar en la investigación del microbioma.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El microbioma humano es un ecosistema complejo de microorganismos que desempeña un papel fundamental en numerosos procesos fisiológicos y tiene un profundo impacto en la salud humana. El microbioma humano abarca muchos sitios anatómicos en todo nuestro cuerpo, cada uno de los cuales contiene comunidades microbianas dinámicas que interactúan activamente de formas que aún no comprendemos completamente. Ampliar nuestro conocimiento sobre la participación de las comunidades microbianas en la salud y la enfermedad depende de nuestra comprensión de las interacciones microbianas que ocurren dentro de estos entornos1. Para estudiar y manipular eficazmente estos intrincados sistemas con fines terapéuticos, es necesario un enfoque reduccionista. La exploración de las interacciones microbianas individuales utilizando sistemas modelo simplificados facilita una mejor comprensión de toda la complejidad del microbioma2.

Hay una amplia variedad de sistemas modelo disponibles para hacer crecer las comunidades microbianas derivadas de los humanos. Estos sistemas han avanzado nuestra comprensión de las comunidades microbianas asociadas a los humanos y van desde el cultivo por lotes de una sola etapa hasta sistemas de flujo continuo de múltiples etapas más complejos. Los sistemas modelo, como el Simulador del Ecosistema Microbiano Intestinal Humano3, el sistema de quimiostato de una sola etapa de doble vaso4 y el Sistema de Control Ambiental para la Microbiota Intestinal5 replican las condiciones fisiológicas de sitios anatómicos específicos y proporcionan aproximaciones in vitro cercanas de los entornos microbianos. Sin embargo, su adopción por parte de los microbiólogos es limitada porque son costosos, requieren experiencia técnica de alto nivel para funcionar y mantenerse, y tienen un rendimiento limitado.

Para abordar estos desafíos, desarrollamos el sistema Minibioreactor Array (MBRA), un sistema de cultivo de flujo continuo y una sola etapa diseñado para facilitar el crecimiento estable de comunidades microbianas de diversas fuentes en un entorno controlado 6,7,8. El sistema MBRA se destaca de otros modelos intestinales por su simplicidad de ensamblaje y operación, combinada con capacidades de alto rendimiento que permiten el cultivo simultáneo de múltiples comunidades microbianas, lo que aumenta la eficiencia experimental. Además, la naturaleza simple y compacta de este sistema permite su funcionamiento dentro de cámaras anaeróbicas y microóxicas para facilitar el crecimiento de bacterias de sitios anaeróbicos e hipóxicos, como el tracto gastrointestinal y vaginal. La naturaleza versátil de este sistema se ha aprovechado para el cribado de comunidades gastrointestinales resistentes a Clostridioides difficile 9, así como para probar los efectos de los antibióticos10,11 y los sustratos dietéticos12 en las comunidades microbianas.

Los MBRA se fabrican mediante impresión 3D o fabricación aditiva, priorizando la claridad y la resistencia al agua en nuestra elección de materiales (consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre polímeros). Cada matriz contiene seis cámaras individuales, todas equipadas con puertos para la importación de medios, la exportación de residuos y la recolección de muestras. Los medios frescos se suministran continuamente al sistema mientras se extraen los residuos simultáneamente, con caudales controlados con precisión por dos bombas peristálticas. El contenido del sistema se agita constantemente mediante barras de agitación y una placa de agitación de 60 puntos para facilitar cultivos homogéneos. El protocolo descrito aquí está optimizado para un volumen de trabajo de 15 ml por cámara, aunque cada biorreactor puede acomodar un rango de 1 a 20 ml según los requisitos experimentales. La bomba peristáltica y el tubo de la bomba pueden acomodar caudales que van de 0,016 a 2,9 ml / min, correspondientes a tasas de rotación de aproximadamente 15,63 a 0,09 h, respectivamente. Si bien el sistema es compatible con una amplia gama de formulaciones de medios y adiciones dietéticas o nutricionales, se deben tener en cuenta algunas consideraciones prácticas: los medios altamente viscosos pueden requerir la recalibración de los caudales, y la presencia de partículas no disueltas o componentes insolubles puede obstruir la tubería de la bomba o los conectores estrechos, particularmente a caudales más bajos. La modularidad del sistema permite una adaptación rápida y sencilla de los experimentos ajustando la elección de medios, la recogida de muestras, los caudales y el volumen de trabajo. Junto con cuatro bombas peristálticas de 24 canales y dos placas de agitación de 60 puntos, el sistema puede ejecutar 48 cámaras separadas por experimento en una sola cámara anaeróbica, lo que admite un cribado anaeróbico de alto rendimiento.

Este protocolo sirve como guía visual y versión actualizada de un método de ensamblaje y operación MBRA previamente publicado desarrollado por nuestro laboratorio4. Se han incorporado varias mejoras clave para mejorar la reproducibilidad, agilizar el flujo de trabajo y minimizar la contaminación. Primero, las pajitas de PTFE ahora están grabadas químicamente para evitar que se desprendan y caigan en las cámaras del biorreactor. En segundo lugar, se ha agregado una pajita de medios a las líneas de alimentación para dirigir el flujo de medios hacia el fondo de las cámaras, evitando que los medios goteen por las paredes de la cámara. Esta era una fuente conocida de formación de biopelículas. En tercer lugar, las longitudes de los tubos C-flex se han estandarizado y acortado, y se ha diseñado un soporte de tubo impreso en 3D para crear una configuración más compacta y organizada. Finalmente, los biorreactores ya no se desmontan por completo entre cada uso, lo que reduce significativamente el tiempo y los costos de material asociados con los experimentos repetidos. Estos y otros refinamientos incrementales reflejan una optimización iterativa basada en el uso extensivo del sistema en múltiples proyectos en nuestro laboratorio.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Este protocolo es para la preparación y montaje de una sola tira MBRA (Figura 1). Cada MBRA consta de un biorreactor impreso en 3D, tubos para facilitar la entrada de un medio de crecimiento y tubos para facilitar la salida de desechos de las cámaras del biorreactor. En la Tabla 1 se puede encontrar una lista completa de las partes que componen un solo MBRA, incluidas las imágenes. El equipo adicional requerido incluye dos bombas peristálticas y una placa de agitación (consulte la Tabla de materiales para conocer las especificaciones del dispositivo).

1. Preparación previa al montaje

  1. Grabado de politetrafluoroetileno (PTFE)
    NOTA: Si bien las propiedades químicas del PTFE lo hacen ideal para su uso en este sistema MBRA, su lubricidad hace que sea imposible adherirse a otras partes del biorreactor usando epoxi solo. Para asegurar el tubo de PTFE en los luers macho roscados, primero debe grabarse químicamente para permitir la unión del epoxi. Se utiliza un grabador de fluorocarbono (ver Tabla de materiales). La Figura 2A sirve como guía visual para encintar el tubo de PTFE para facilitar este proceso de grabado.
    1. Corte doce tubos de PTFE de 25 mm de longitud. Seis de estos se cortarán por la mitad después del grabado para que sirvan como pajitas para las líneas de alimentación ("pajita de medios").
      NOTA: Solo se debe grabar la sección que se está uniendo. Para evitar el grabado de la superficie interna y las áreas no deseadas, el tubo debe estar sellado y sellado en ambos extremos.
    2. Con cinta de etiquetado de laboratorio de uso general (19 mm de ancho), envuelva la cinta completamente alrededor de la parte superior, cubriendo ~ 5 mm del tubo de PTFE (Figura 2A). Aplique otra sección de cinta alrededor de la parte inferior, cubriendo ~ 10 mm del tubo de PTFE (Figura 2A).
    3. Apriete firmemente los extremos de la cinta para evitar que la solución de grabado llegue al interior del PTFE (Figura 2A). Esto debería dejar ~ 10 mm de tubería de PTFE expuesta para el grabado.
    4. Prepare cuatro soluciones: la solución de grabado de fluorocarbono calentada a 55 °C (consulte la Tabla de materiales para obtener detalles de la solución de grabado de fluorocarbono), etanol al 100% (EtOH), H2O destilado calentado a 70 °C y H2O destilado + ácido acético 2-5% calentado a 70 °C.
      PRECAUCIÓN: La solución de grabado de fluorocarbono es altamente corrosiva. Realice todos los pasos en una campana extractora con EPP. Deseche los productos químicos según las pautas institucionales.
    5. Calentar todas las soluciones a las temperaturas indicadas en el paso 1.1.4. La solución de grabador de fluorocarbono debe calentarse en un baño de agua, las otras soluciones se pueden calentar en una placa caliente. Vierta las soluciones en 4 recipientes de vidrio separados lo suficientemente profundos como para sumergir completamente el tubo con cinta adhesiva.
    6. Sumerja todos los tubos de PTFE en la solución de grabado de fluorocarbono. Gire para garantizar una exposición uniforme de la superficie. Remoje durante 1 minuto, hasta que la superficie grabada se vuelva marrón.
      NOTA: Se puede usar una cuchara coladora de espumadera de metal para transferir tubos de PTFE entre soluciones.
    7. Transfiera el tubo al baño de EtOH durante 5-20 s.
    8. Transfiera el tubo al baño de 70 °C H20 durante 15-30 s.
    9. Transfiera el tubo al baño de ácido acético a 70 °CH 20 + 2-5% durante 1 min.
    10. Retire el tubo y colóquelo sobre una almohadilla absorbente dentro de la campana extractora. Deje que el tubo grabado se seque durante la noche (al menos 16 h). Después de secar, retire la cinta del tubo grabado.
    11. El PTFE grabado está listo para pegar y permanecerá pegable durante varios meses si se almacena a temperatura ambiente. Una vez que el color marrón en las superficies de grabado se desvanece, ya no se puede adherir.
      NOTA: No exponga el PTFE grabado a la luz ultravioleta, ya que degradará el grabado.
    12. Corte 6 de los tubos de PTFE grabados por la mitad para que sirvan como pajitas para las líneas de alimentación (Figura 2A).
  2. Residuos epoxi y pajitas de medios
    1. Inserte cada una de las 6 pajitas de desecho de PTFE grabadas y las 6 pajillas de medios de PTFE grabadas en su respectiva luer macho roscada. Asegúrese de que las superficies grabadas se alineen con la parte inferior del luer macho (Figura 2).
    2. Mezcle la resina epoxi y el endurecedor en una proporción de 1:1 en un bote de pesaje o una placa de Petri. Con una punta de pipeta de 1 ml, aplique epoxi alrededor de la base del luer macho roscado donde se encuentra con el tubo de PTFE.
    3. Coloque cada pieza verticalmente y deje que el epoxi se asiente durante 24 h.
      NOTA: Una caja de puntas de pipeta vacía de 1 ml funciona bien para mantenerlos en posición vertical.

2. Ensamblaje MBRA

  1. MBRA y preparación de piezas
    1. Asegúrese de que las tiras de matriz del minibiorreactor estén impresas en 3D (consulte el archivo complementario 1) y contengan 6 cámaras de biorreactores independientes. Cada cámara contiene tres puertos de 1/4 de pulgada, que deben roscarse para insertar accesorios. Haga el enhebrado con un grifo de fracción de 1/4 de pulgada-28NF con una llave de grifo con mango en T.
      NOTA: Se recomienda el uso de una guía de grifo al enhebrar los puertos para asegurar una rosca plomada.
    2. Una vez roscado, lave cada cámara del biorreactor con agua para eliminar cualquier residuo de plástico. Agregue una barra de agitación magnética de 10 x 3 mm y 1 ml de agua destilada a cada cámara. El agua ayudará al proceso de esterilización durante el autoclave.
    3. Coloque una arandela de goma en la parte superior de cada puerto del biorreactor. Para cada cámara, atornille 1 luer macho con rosca de paja de desecho, 1 luer macho con rosca de paja de medios y 1 luer macho roscado vacío en cada uno de los puertos como se indica en la Figura 2B.
    4. Inserte 6 septos de goma en las púas luer hembra de 3/32 de pulgada. Dobla la manga superior de los septos hacia abajo para cubrir el cuello. Conéctelos a los puertos de cada cámara indicados en la Figura 2B.
    5. Corte tiras de tubería C-flex de la siguiente longitud: 2 3/8 pulgadas, 3 11/16 pulgadas, 5 1/4 pulgadas, 6 1/2 pulgadas, 7 13/16 pulgadas y 9 pulgadas, y 9 pulgadas (se necesitarán dos de cada longitud tanto para las líneas de desechos como para las líneas de alimentación). Una vez cortado, conecte una lengüeta luer hembra de 1/8 de pulgada a un extremo y un conector Luer Lock macho al extremo opuesto de cada longitud de tubo.
      NOTA: Las longitudes utilizadas aquí están optimizadas para reducir el desorden y para bombas colocadas a ~ 1 pulgada de distancia de la placa de agitación. Dependiendo de la configuración deseada, es posible que se requieran longitudes más largas.
    6. Inserte una lengüeta luer hembra de 1/16 de pulgada en cada extremo del tubo rojo de E-lab de 2 pasos (1,14 mm de diámetro interior) y el tubo naranja de 2 pasos de E-lab (0,89 mm de diámetro interior). Repita este proceso seis veces para cada tira de MBRA.
      NOTA: Para facilitar la inserción de la lengüeta luer hembra de 1/16 de pulgada, sumerja brevemente los extremos del tubo del laboratorio electrónico en agua casi hirviendo para ablandar el plástico.
    7. Conecte el tubo E-lab al tubo C-flex preparado en el paso 2.1.5. Cada una de las 6 longitudes de tubería C-flex debe conectarse a una línea de laboratorio electrónico roja y otra naranja a través de luers hembra.
    8. Corte veintiún piezas de 1 pulgada, una pieza de 2 pulgadas, tres piezas de 3 pulgadas y una pieza de 12 pulgadas de tubo C-flex. Conecte una lengüeta luer hembra de 1/8 de pulgada y un conector luer lock macho a los extremos de una pieza de 3 pulgadas y la pieza de tubo de 12 pulgadas. A la tubería restante, conecte conectores Luer Lock macho a ambos extremos. Estas piezas comprenderán los conjuntos de árboles de la línea de residuos y la línea de alimentación.
  2. Montaje de árboles de la línea de residuos
    1. Siga el diagrama 3D que se muestra en la Figura 3B para ensamblar el árbol de líneas de desecho.
    2. Conecte los extremos expuestos del tubo rojo de 2 paradas E-lab (1,14 mm de diámetro interior) a los bloqueos Luer macho terminales en el árbol de la línea de residuos ensamblado. Conéctelos en orden ascendente según la longitud del tubo C-flex conectado al tubo E-lab de 2 paradas. Conecte el tubo C-flex de 3 pulgadas con la lengüeta luer hembra de 1/8 de pulgada y el conector Luer Lock macho a la parte superior del árbol de la línea de desecho.
  3. Ensamblaje del árbol de la línea de alimentación
    1. Siga el diagrama 3D que se muestra en la Figura 3A para ensamblar el árbol de líneas de alimentación.
      NOTA: Los árboles de línea de alimentación no incorporan los conectores Luer macho a macho utilizados en el árbol de línea de desecho. Según nuestra experiencia, estos conectores son propensos a tener fugas y pueden aflojarse fácilmente, lo que aumenta el riesgo de contaminación tanto en las cámaras del biorreactor como en las botellas de medios. Para mitigar esto, el árbol de líneas de alimentación se construye sin estos componentes.
    2. Conecte los extremos expuestos del tubo naranja de 2 paradas E-lab (0,89 mm de diámetro interior) a los bloqueos Luer macho terminales en el árbol de línea de alimentación ensamblado. Conéctelos en orden ascendente según la longitud del tubo C-flex conectado al tubo E-lab de 2 paradas. Conecte el tubo C-flex de 12 pulgadas a la parte superior del árbol de la línea de alimentación.
  4. Montaje completo: Combine los componentes preparados en el sistema de cultivo MBRA.
    1. Conecte el tubo C-flex de longitud variable al final del árbol de línea de alimentación al biorreactor, en orden ascendente, con la línea más corta en el lado izquierdo de la tira del biorreactor y la más larga a la derecha.
    2. Conecte el tubo C-flex de longitud variable al final del árbol de la línea de desechos a la tira del biorreactor en orden descendente, con la línea más larga a la izquierda y la más corta a la derecha. La línea de residuos más corta se encuentra en el lado derecho de la tira del biorreactor porque está más cerca de la bomba de residuos. Por el contrario, la línea de alimentación más larga está en el lado derecho porque la bomba de alimentación está ubicada a la izquierda (Figura 1).
  5. Esterilización de matrices ensambladas: Prepare el sistema ensamblado para la esterilización.
    1. Agrupe todas las líneas de alimentación C-flex en el lado izquierdo del MBRA y asegúrelas con una brida. Haz lo mismo con las líneas de desagüe en el lado derecho de la tira.
    2. Forme un bucle con el tubo naranja de 2 paradas de E-lab entre las líneas C-flex. Asegure el lazo con cinta de autoclave. Haga lo mismo con el tubo rojo de laboratorio electrónico de 2 paradas en el lado de desechos de la tira del biorreactor. Esto ahorrará espacio durante el autoclave.
    3. Cubra la luer hembra en el extremo de la línea de desechos y el árbol de la línea de alimentación con un trozo de papel de aluminio para evitar la contaminación después de sacarlo del autoclave. Afloje los luers roscados macho con los septos en cada cámara del biorreactor para permitir que el vapor escape durante el autoclave.
      NOTA: Este paso es fundamental para garantizar que el vapor pueda escapar del biorreactor durante el autoclave. Si no se ventila adecuadamente, pueden producirse grietas en las cámaras del biorreactor.
    4. Coloque el MBRA en un contenedor de autoclave y extienda la línea de alimentación y los árboles de la línea de desechos en contenedores separados adyacentes al contenedor que contiene los MBRA. Si el tubo del laboratorio electrónico cerca de la lengüeta luer hembra de 1/16 de pulgada o cualquier sección del tubo C-flex se dobla durante el autoclave, el tubo puede obstruirse, impidiendo el flujo de medios o desechos.
    5. Autoclave a 121 °C, ≥ 15 psi durante 25 min. Utilice un programa de escape lento típico de los ciclos de líquidos. Deje que el biorreactor se enfríe a temperatura ambiente después del ciclo de autoclave. Después de que el MBRA se haya enfriado lo suficiente, vuelva a apretar los luers macho roscados con los septos.
      NOTA: Las tiras de biorreactor esterilizadas en autoclave se vuelven maleables y propensas a agrietarse si se comprimen. Deje enfriar el tiempo suficiente antes de apretar los accesorios.
      NOTA: El tubo naranja de 2 paradas de E-lab es propenso a agrietarse durante el proceso de autoclave y puede separarse de la púa luer hembra de 1/16 de pulgada. Si se produce agrietamiento, rocíe ambos extremos con etanol al 70%, luego corte el extremo agrietado con una navaja estéril y vuelva a colocar el tubo en la púa luer. Alternativamente, los tubos adicionales de E-lab con luers hembra de 1/16 de pulgada conectados se pueden esterilizar por separado en una bolsa de autoclave, y todo el tubo se puede cambiar.

3. Montaje de medios y botellas de desecho

  1. Ensamblaje de botellas de medios
    NOTA: En el presente ejemplo, todo el sistema se alimenta con una sola botella de 2L. Consulte la Figura 4A para obtener una imagen del conjunto de la tapa de la botella de medios.
    1. Atornille los adaptadores Dibafit (adaptadores de tapa de botella) en los dos puertos roscados en la parte superior de la tapa de botella de la serie Q. Agregue una sección de 3 pulgadas de tubería C-flex a uno de los adaptadores y una sección de 12 pulgadas de tubería C-flex a la otra. Al final de cada sección de tubería, agregue un conector Luer Lock macho.
      NOTA: La longitud de la tubería requerida para llegar al árbol de líneas de alimentación del MBRA puede variar y se puede ajustar en consecuencia.
    2. Corte un trozo de tubo de PTFE de 12 pulgadas para que sirva como pajita de la que extraer los medios. Corta el extremo en un ángulo de 45° con una cuchilla de afeitar para evitar que se obstruya la pared lateral de la botella. Inserte el PTFE en el pequeño orificio en la parte inferior de la tapa de la botella conectado a la sección de 12 pulgadas del tubo C-flex.
    3. Corte un trozo de tubo C-flex de 2 pulgadas y conecte una lengüeta luer hembra a un extremo y un conector Luer Lock macho al otro. Conecte este tubo a la sección de 12 pulgadas del tubo que eventualmente se conectará al árbol de la línea de alimentación. Asegure la pieza de 2 pulgadas con un Pinchcock. Coloque el lazo del Pinchcock alrededor del tubo de 3 pulgadas de la tapa de la botella. Esto servirá como un tapón temporal para evitar fugas de medios durante y después del autoclave.
    4. Prepare los medios deseados. Instale la tapa de la botella completamente ensamblada en la botella de medios. Envuelva el tubo C-flex de 12 pulgadas alrededor de la botella y asegure el extremo con el Pinchcock en el tubo de 2 pulgadas, como se describió anteriormente. No enrosque la tapa con fuerza, sino que aflójela ligeramente para evitar la acumulación de presión durante el autoclave.
    5. Use papel de aluminio para cubrir el extremo del tubo de 3 pulgadas que sale de la tapa de la botella. Autoclave durante un tiempo adecuado al protocolo del medio. Después de la esterilización, retire la lámina del tubo de 3 pulgadas y atornille un filtro de jeringa de 0,22 μm en el conector Luer Lock macho. Esto permitirá el flujo de aire hacia la botella de medios durante el bombeo, pero evitará la contaminación.
      NOTA: Antes de usar, asegúrese de que las tapas de las botellas de la serie Q estén bien selladas en las botellas, ya que un sello inadecuado puede impedir el flujo adecuado.
  2. Ensamblaje de botellas de desecho: Para evitar cambiar las botellas de desecho todos los días, el laboratorio ha creado un sistema de recolección de desechos escalonado (Figura 4B) que permite llenar varias botellas de 2 litros con desechos durante el experimento. La configuración de este sistema de residuos escalonados es la siguiente:
    1. Enrosque los adaptadores de tapa de botella en los dos puertos roscados en la parte superior de una tapa de botella de la serie Q. Repita para 2-4 tapas de botellas, dependiendo de la cantidad de botellas de almacenamiento de desechos requeridas.
    2. Corta un trozo de PTFE de 2 pulgadas para cada tapa de botella. Inserte esta pieza dentro de la tapa de la botella en el orificio designado para eliminar los desechos a la siguiente botella del sistema.
    3. Corte un trozo de tubería C-flex lo suficientemente largo como para estirarlo entre el árbol de la línea de desechos que va desde la bomba hasta la ubicación del sistema de botellas de desechos. Coloque un conector Luer Lock macho en el extremo adyacente al árbol de la línea de desechos y conecte el otro extremo al adaptador de tapa de botella sin el tubo de PTFE en la tapa de la botella.
    4. Corte un segundo tramo de tubo C-flex para conectar las tapas de las botellas en la primera y segunda botella de desecho. Conecte el tubo del adaptador de tapa de botella con la pajita de PTFE en la primera botella y en el adaptador de tapa de botella sin la pajita de PTFE en la segunda botella.
      NOTA: Cada botella en la cascada de botellas de desechos escalonadas debe colocarse por encima de la primera para permitir que la gravedad ayude al flujo de una botella a la siguiente (Figura 4B). Se recomienda colocar todas las botellas en un recipiente secundario (por ejemplo, un contenedor de almacenamiento de plástico abierto) y colocarlas en orden descendente utilizando elevadores, como recipientes para objetos punzantes invertidos.
    5. Continúe esta cadena durante tantas botellas como desee. En la botella final, conecte un segmento de tubo C-flex de 3 pulgadas con un conector Luer Lock macho al adaptador de tapa de botella libre. A continuación, conecte una jeringa de 20 ml para aplicar un vacío y facilitar la cascada de residuos.

4. Conexión, operación y desmontaje de MBRA

  1. Conexión a bombas
    1. Retire la cinta de autoclave que mantiene unidos los tubos del laboratorio electrónico para las líneas de residuos y alimentación. Desate los paquetes de tubos C-flex.
    2. Coloque el MBRA entre las dos bombas en la parte superior de la placa de agitación. Se puede sujetar a la placa utilizando los soportes impresos en 3D (consulte el archivo complementario 2). Asegúrese de que esté alineado con las posiciones de agitación indicadas en la placa de agitación.
    3. Conecte el tubo de E-lab de la línea de alimentación a los cartuchos de la bomba peristáltica. Coloque los topes del tubo de E-lab en las ranuras de los cartuchos. Haga lo mismo con la tubería de E-lab de la línea de residuos en la bomba a la derecha de la placa de agitación.
    4. Bloquee los cartuchos de la bomba peristáltica en la bomba. Asegúrese de que los cartuchos estén completamente asentados contra la bomba y que el tubo esté dentro del canal de los cartuchos.
      NOTA: Solo bloquee los cartuchos en su lugar en las bombas si tiene la intención de iniciar el flujo dentro de las 24 h. Si se deja sujeto sin flujo de medios durante más de 24 h, los tubos pueden comprimirse y obstruirse. Si esto sucede, simplemente retire la abrazadera y masajee suavemente el tubo en el punto de compresión.
    5. Ordene el tubo C-flex utilizando los soportes de tubos impresos en 3D (Archivo complementario 3).
    6. Conecte el extremo del árbol de la línea de residuos a la tubería que conduce a las botellas de residuos.
      NOTA: Al ejecutar varios MBRA, los árboles de la línea de desechos deberán bifurcarse antes de conectarlos a la tubería que conduce a las botellas de desecho. Esto se puede hacer creando un árbol de ramificación simple para cada MBRA adicional.
    7. Conecte el luer hembra en el tubo de entrada de la línea de alimentación al conector macho en el tubo de 12 pulgadas desde la tapa de la botella de medios.
      NOTA: Ambos extremos deben estar estériles en este punto. Evite tocarlos con cualquier fuente potencial de contaminación. Si se sospecha contaminación, remoje cada extremo en lejía al 10% durante 10 minutos antes de conectar.
    8. Encienda ambas bombas para comenzar el flujo de medios. Asegúrese de que las bombas fluyan en la dirección correcta (ambas configuradas en el sentido de las agujas del reloj ("CW") si los desechos están a la derecha de las bombas).
    9. Observe el tamaño y la cadencia de las gotas de medio que caen en cada cámara del biorreactor; Cualquier diferencia grande en esto puede indicar variabilidad del caudal. Si se observa variabilidad, se recomienda cambiar cualquier tubo de alimentación naranja de 2 paradas de E-lab conectado a la cámara del biorreactor infractor. Esto ayudará a limitar la variabilidad del caudal en la ejecución experimental.
      NOTA: Este es el momento de diagnosticar y reparar cualquier fuga en el sistema, así que supervise de cerca el proceso de llenado inicial.
    10. Una vez que las cámaras del biorreactor alcancen su capacidad, apague ambas bombas y deje que los biorreactores permanezcan durante 24-48 h. Este paso es esencial para verificar si hay cualquier contaminación potencial en las cámaras antes de que comience el experimento.
  2. Inoculación MBRA
    NOTA: Aquí describimos el protocolo básico para esterilizar los septos e inyectar un inóculo.
    1. Prepare el inóculo de acuerdo con las especificaciones deseadas.
    2. Aplique una solución de lejía al 10% recién hecha en la parte superior de los septos en cada cámara del biorreactor con un gotero de plástico. Deposite suficiente lejía para cubrir completamente la parte superior de los septos. Déjalo reposar durante 10 min. Seque los septos con una toallita estéril de laboratorio.
    3. Con una aguja de 22 G de 3 pulgadas de largo y una jeringa que contenga la muestra, perfore el centro de los tabiques. Asegúrese de que la aguja toque el medio dentro de la cámara, luego inyecte el inóculo en la cámara del biorreactor. Enjuague la jeringa retirando el medio y reinyectándolo nuevamente en la cámara. Retire las agujas de los septos y deséchelas en un recipiente para objetos punzantes.
    4. Deje que el inóculo crezca durante un período apropiado, según el diseño experimental, antes de comenzar el flujo. Por ejemplo, las comunidades bacterianas fecales requieren un crecimiento inicial de lotes de 4-16 h para aumentar suficiente biomasa8.
    5. Encienda ambas bombas al caudal deseado, según el tiempo de rotación requerido. Consulte el manual de la bomba peristáltica para obtener más información sobre los caudales.
      NOTA: Independientemente del caudal deseado, la bomba de residuos siempre debe funcionar a una velocidad más alta que la bomba de medios para garantizar que las cámaras del biorreactor no se desborden. Para nuestro cultivo de la comunidad bacteriana gastrointestinal, utilizamos una tasa de renovación de 1,92 ml / h, que se logra ajustando la bomba de medios a 1,0 rpm y la bomba de desechos a 2,0 rpm.
    6. Nuevamente, observe el tamaño y la cadencia de las gotas de medios que caen en cada cámara del biorreactor, cualquier diferencia grande en esto puede indicar variabilidad del caudal. Si se observa variabilidad, se recomienda cambiar cualquier tubo de alimentación naranja de 2 paradas de E-lab conectado a la cámara del biorreactor infractor. Esto ayudará a limitar la variabilidad del caudal en las ejecuciones experimentales.
  3. Muestreo MBRA
    1. Aplique una solución de lejía al 10% en la parte superior de los septos en cada cámara del biorreactor, suficiente para cubrir completamente la superficie. Déjalo reposar durante 10 min. Después de 10 min, seque los septos con una toallita de laboratorio estéril.
    2. Con una aguja y una jeringa de calibre 22 de 3 pulgadas de largo, perfore el centro de los septos e inserte la aguja completamente en la cámara del biorreactor. Mientras sostiene la jeringa, tire hacia atrás del émbolo para extraer la muestra de la cámara.
      NOTA: Evite eliminar más del 20% del volumen total de la cámara del biorreactor a la vez. Eliminar más que esto puede alterar la comunidad microbiana, ya que la salida de desechos se interrumpe hasta que los medios nuevos vuelven a llenar la cámara al nivel de la pajita de desecho de PTFE.
    3. Retire la aguja y dispense la muestra en un recipiente adecuado. Deseche la aguja en un recipiente para objetos punzantes.
  4. Desmontaje y reacondicionamiento de MBRA
    NOTA: Después de los experimentos, el MBRA deberá esterilizarse y prepararse para futuros experimentos.
    1. Cambie la entrada de medios con 1 L de lejía al 10% en agua desionizada (DI). Aumente el caudal de ambas bombas al máximo para desplazar el contenido de las cámaras del biorreactor con la solución de lejía.
    2. Una vez que las cámaras estén limpias (todos los medios han sido reemplazados con lejía), invierta el MBRA para desinfectar por encima de la línea de llenado durante 5 minutos. Después de 5 minutos, enderece la tira y espere 5 minutos más para la esterilización.
      NOTA: No permita que la lejía se asiente más allá de los 10 minutos descritos anteriormente, ya que esto provocará la decoloración del plástico y el debilitamiento de los medios y los tubos de desecho.
    3. Reemplace la solución de lejía al 10% con 1 L de agua desionizada. Enjuague el sistema con agua desionizada hasta que haya pasado toda el agua. Desconecte la tubería del laboratorio electrónico del biorreactor de las bombas y retire los MBRA.
    4. Para restaurar, retire los septos usados y todo menos 1 ml de agua de cada cámara.
    5. Vuelva a colocar los septos y el tubo naranja de 2 pasos de E-lab y siga los pasos anteriores para prepararse para el autoclave (pasos 2.5.1 a 2.5.5) hasta 3 veces. Después de la tercera reutilización, el MBRA debe desmontarse por completo, reemplazar el tubo C-flex y esterilizar cada parte individual con EtOH al 70% o reemplazarse si se rompe. El epoxi que contiene los desechos y alimenta el PTFE se volverá quebradizo después de varios ciclos de autoclave y deberá volver a aplicarse.
      NOTA: El tubo naranja de 2 paradas de E-lab se reemplaza entre cada recorrido para limitar la variabilidad del caudal causada por el desgaste y los ciclos repetidos del autoclave.

Results

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Para facilitar el crecimiento de bacterias anaeróbicas, como las que se encuentran en el tracto gastrointestinal, el MBRA se puede configurar y operar dentro de cámaras anaeróbicas. Para demostrar la capacidad de cultivar comunidades bacterianas complejas directamente desde sitios relevantes en el cuerpo humano, se preparó una muestra fecal humana y se cultivó en este sistema. Todo el trabajo se llevó a cabo en una cámara anaeróbica a 37 ° C, y los cultivos se cultivaron en nuestro medio de biorreactor, BRM37.

La suspensión fecal se preparó descongelando las heces humanas anaeróbicamente y luego mezclándolas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta una concentración final del 25% p/v. Después de confirmar la esterilidad, se inocularon nueve cámaras de biorreactores cada una con 3 ml de la misma suspensión fecal. Las comunidades microbianas se cultivaron durante la noche sin entrada de medios ni eliminación de desechos, lo que resultó en cultivos por lotes separados durante un período de 16 h. Luego, las bombas de alimentación se encendieron y se ajustaron a un caudal de 1,92 ml por h. Después de cuatro días de flujo continuo, se recolectaron muestras de los biorreactores y se analizaron para determinar la composición de la comunidad microbiana utilizando la secuenciación del gen 16S rRNA seguida de la eliminación de ruido con Deblur y la clasificación taxonómica con la base de datos SILVA 138 SSU en QIIME 213. Se detectaron un total de 65 géneros en las nueve réplicas, pero los biorreactores estaban dominados por solo 18 géneros, cada uno con al menos un 2% de abundancia en cualquiera de las nueve réplicas (Figura 5). Los biorreactores mostraron una alta reproducibilidad, de modo que 22 de los 65 géneros se detectaron en las nueve réplicas, y se detectaron 17 géneros adicionales en al menos la mitad de las réplicas. La mayoría de los géneros ausentes de al menos un reactor (37 de 43 géneros) eran especies raras, cada una con una abundancia relativa inferior al 2% en biorreactores. En resumen, los cultivos MBRA de flujo continuo apoyaron comunidades microbianas complejas y reproducibles derivadas de la misma muestra de heces, incluso después de cultivos por lotes separados durante 16 h dentro de cada cámara de biorreactor.

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Figura 1: La matriz de minibiorreactores (MBRA). MBRA completamente ensamblado, incluidas las etiquetas para el árbol de tubos de la línea de alimentación y desechos, las cámaras del biorreactor y la tira del biorreactor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Guía de grabado de PTFE y diseño del puerto MBRA. (A) Diagrama de flujo a seguir para el grabado de los medios y las pajitas de PTFE de desecho. (B) Cada cámara de biorreactor contiene un puerto para una pajita de medios + luer macho roscado, una pajita de desecho + luer macho roscado y un tabique + luer macho roscado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Árboles de líneas de alimentación y desechos MBRA. Imágenes representativas a seguir en el montaje de (A) árbol de línea de alimentación y (B) árbol de línea de desecho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Sistema de tapa de botella de medios y nivel de residuos. (A) Un ejemplo de una tapa de botella de la serie Q ensamblada utilizada para introducir medios en los MBRA. (B) Una imagen del sistema de recolección de desechos escalonado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Abundancia relativa de géneros bacterianos. (A) El gráfico de barras apiladas muestra la abundancia relativa de todos los géneros que comprenden al menos un 2% de abundancia en cualquiera de las muestras mostradas. (B) Métricas de diversidad alfa de las OTU observadas y la diversidad de Shannon entre las nueve cámaras de biorreactores. Las nueve cámaras del biorreactor fueron inoculadas con la misma suspensión fecal preparada a partir de heces humanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Componentes de MBRA. Imágenes y descripciones de todas las piezas individuales necesarias para ensamblar completamente el MBRA, junto con la cantidad necesaria para cada componente. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Guía de solución de problemas. Problemas comunes encontrados con la ejecución de MBRA, junto con sus posibles causas y soluciones recomendadas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Expediente complementario 1: Archivo Stl para imprimir en 3D las tiras de matriz de minibiorreactores. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente complementario 2: Archivo Stl para imprimir en 3D los soportes de biorreactores utilizados para anclar los biorreactores a las placas de agitación. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente complementario 3.: Archivo Stl para la impresión 3D de los portatubos utilizados para organizar los residuos C-flex y alimentar los tubos que se extienden desde los MBRA. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

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Este protocolo describe el ensamblaje completo y el funcionamiento básico de una matriz de minibiorreactores (MBRA) para el cultivo de alto rendimiento de comunidades bacterianas, incorporando varios refinamientos clave al método publicado anteriormente. El sistema MBRA sigue siendo una herramienta versátil y rentable que permite a los investigadores cultivar ecosistemas microbianos complejos al tiempo que admite numerosas réplicas experimentales en paralelo. En esta versión actualizada, introducimos mejoras que mejoran la reproducibilidad, agilizan el flujo de trabajo y reducen el riesgo de contaminación. Estos incluyen pajitas de PTFE grabadas químicamente (Figura 2) para evitar el desprendimiento, una pajita de alimentación en la línea de medios (Figura 2) para minimizar la formación de biopelícula, longitudes de tubería estandarizadas con un soporte de tubería impreso en 3D (Archivo complementario 3) para una configuración más compacta y organizada, y un protocolo de reutilización optimizado que elimina la necesidad de desmontaje completo entre experimentos. Juntos, estos refinamientos representan mejoras iterativas desarrolladas a través del uso extensivo del sistema MBRA en diversas aplicaciones experimentales en nuestro laboratorio. Al abordar tanto los pasos críticos de ensamblaje como las mejoras prácticas, esta discusión subraya la utilidad del MBRA como un sistema modelo en continua evolución para la investigación del microbioma.

El éxito del sistema MBRA depende en gran medida del ensamblaje y la esterilización precisos de los componentes para garantizar un funcionamiento libre de contaminación. Los pasos clave incluyen el ajuste adecuado de tapas, tubos y conectores de la serie Q, que facilitan el ensamblaje modular y permiten la entrada de medios y la recolección de desechos. Garantizar un sellado hermético entre las botellas de medios, los depósitos de desechos y las cámaras de biorreactores es esencial para prevenir fugas y mantener condiciones estériles. Otro paso crítico es la verificación de los caudales de la bomba peristáltica antes de la experimentación, ya que las inconsistencias pueden conducir a una entrega desigual de medios y pueden afectar la dinámica del crecimiento microbiano. La mayoría de las bombas peristálticas multicanal que utilizan casetes incluyen un mecanismo de ajuste de oclusión, que debe usarse para ajustar el caudal de cada canal. Incluso con la calibración adecuada, la tubería del laboratorio electrónico sigue siendo una fuente principal de variabilidad. Para mitigar esto, es importante monitorear visualmente la frecuencia y el tamaño de las gotas de medios que ingresan a cada cámara del biorreactor tanto durante el llenado inicial como durante el inicio de los experimentos. Estas comprobaciones visuales permiten la detección temprana de inconsistencias en el caudal que, de otro modo, podrían comprometer la reproducibilidad experimental. En la tabla 2 se proporcionan estrategias de solución de problemas comunes que se encuentran durante el ensamblaje y el uso de MBRA. Estos pasos de solución de problemas garantizan la reproducibilidad en todos los experimentos y evitan interrupciones durante el cultivo a largo plazo.

A pesar de sus fortalezas, el sistema MBRA tiene ciertas limitaciones que deben tenerse en cuenta al diseñar experimentos. A diferencia de los sistemas más avanzados, el MBRA carece de capacidades de monitoreo activo, como mediciones de densidad óptica (OD) en tiempo real, control de pH y regulación de temperatura. Esta ausencia de medición activa restringe la capacidad del sistema para monitorear los cambios dinámicos en el crecimiento microbiano y la actividad metabólica en tiempo real. Además, si bien el sistema admite el cultivo anaeróbico dentro de las cámaras, no incluye control de gas integrado, lo que puede limitar las aplicaciones que requieren entornos microaerofílicos precisos o enriquecidos conCO2. Para estudios que requieren dicho control, los sistemas alternativos con regulación de gas incorporada pueden ser más adecuados.

El sistema MBRA ofrece ventajas clave sobre los modelos de biorreactores existentes, incluido el alto rendimiento, la escalabilidad y la rentabilidad, al tiempo que conserva la capacidad de cultivar comunidades bacterianas complejas bajo flujo continuo para imitar entornos dinámicos como el tracto gastrointestinal humano 6,8,10. Su diseño compacto y modular permite el funcionamiento simultáneo de múltiples biorreactores, lo que lo hace ideal para estudios de alto rendimiento, como la detección de comunidades derivadas de heces para determinar su resistencia a la invasión de patógenos9. Este diseño modular proporciona una amplia flexibilidad experimental: cada tira puede ser suministrada por una sola botella de medios, como se demuestra en este protocolo, o por hasta seis fuentes de medios distintas, una para cada cámara de biorreactor. El volumen de trabajo se rige por la longitud de una pajita de desecho delgada de PTFE insertada en el puerto de desechos de cada cámara, que establece la altura del líquido; en este protocolo, las pajuelas de 25 mm mantienen un volumen de trabajo de 15 ml, pero se pueden lograr volúmenes entre 1 y 20 ml recortando o extendiendo la pajuela. Además, se insertan pajitas de alimentación más cortas en la entrada de medios para dirigir el flujo de entrada hacia la base de la cámara, evitando que los medios goteen por las paredes de la cámara y reduciendo la formación de biopelículas por encima de la línea de llenado. Las velocidades de la bomba o el diámetro de la tubería de la bomba también se pueden ajustar para alterar la tasa de rotación del sistema. Hasta la fecha, el sistema MBRA se ha utilizado ampliamente para estudiar los cambios funcionales y de composición de las comunidades microbianas en respuesta a una variedad de factores, incluidos los antibióticos10, los medicamentos contra el cáncer14 y varios compuestos dietéticos 12,15,16,17. El diseño simple y modular lo hace ideal para adaptarse a diversas necesidades experimentales. Por ejemplo, el MBRA ha sido modificado para estudiar biopelículas en condiciones similares a las de los quimiostatos18, lo que demuestra su versatilidad para estudios de ecología microbiana más allá de los cultivos planctónicos.

Las iteraciones futuras del sistema MBRA podrían beneficiarse de actualizaciones de ingeniería adicionales que amplíen su funcionalidad, precisión y potencial de rendimiento. Una de esas mejoras es la incorporación de puertos adicionales en cada cámara de biorreactor. Estos puertos podrían usarse para admitir el monitoreo activo de parámetros ambientales como pH, temperatura, gas o densidad óptica. Esto abordaría una de las limitaciones más importantes del modelo al permitir la retroalimentación y el monitoreo en tiempo real. Las mejoras en la geometría de la cámara o el puerto podrían facilitar una limpieza más completa y accesible, reduciendo la acumulación de residuos y la decoloración y mejorando la reutilización a largo plazo. La integración de bombas peristálticas adicionales con temporizadores programables permitiría entradas de medios pulsados o diurnos, simulando mejor los entornos asociados al huésped, como los ciclos de alimentación en el intestino humano. Finalmente, la impresión 3D con materiales alternativos, como polímeros resistentes a los productos químicos y esterilizables en autoclave, puede permitir una mayor durabilidad y compatibilidad con una gama más amplia de reactivos. Juntas, estas mejoras podrían ampliar significativamente el alcance experimental y la fidelidad de la plataforma MBRA.

En conclusión, el MBRA proporciona una plataforma poderosa y de alto rendimiento para cultivar y estudiar comunidades microbianas en condiciones controladas. Si bien tiene limitaciones en el monitoreo activo y el control del pH, su flexibilidad, escalabilidad y rentabilidad lo convierten en una herramienta invaluable para una amplia gama de estudios microbiológicos, particularmente aquellos que requieren una alta replicabilidad y rendimiento experimental. Es importante destacar que el diseño modular y el enfoque de fabricación del sistema lo hacen inherentemente adaptable; los investigadores han adaptado y pueden continuar adaptando el MBRA para adaptarse a una amplia gama de objetivos experimentales. Esta adaptabilidad garantiza que el MBRA pueda seguir evolucionando junto con las preguntas y tecnologías científicas emergentes, manteniendo su relevancia como plataforma versátil para la investigación del microbioma.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener conflictos de intereses

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la beca predoctoral NIH T32 Molecular Basis of Infectious Disease, NIH T32DK007664 y NIH U19AI157981 Microbiome Discovery and Mechanisms to Combat Antibiotic Resistance at Mucosal Surfaces.

Los autores agradecen a Hayden Curnyn por sus contribuciones al diseño y fabricación de los soportes de biorreactores y soportes de tubos utilizados en este sistema.

La Figura 2 y la Figura 3 se crearon parcialmente en https://BioRender.com

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  Guía V-Tap, tamaños estándar de 0-80 a 5/8"Herramientas Big GatorSTD500NP 
0.22 μ Filtro de jeringa MPescadorSLGVR33RS
Accionamiento de agitación 2mag MIXdrive 60 (solo accionamiento)2MAGMF 41060
Agujas hipodérmicas Air-tite, 22G x3"VWR89219-274
BD 1mL Jeringas estériles de punta deslizante estérilesPescador14-823-434
BiorreactorProto-LaboratoriosNAImpreso en 3D de DMS Somos Watershed Plastic. Consulte el archivo complementario 1 para la plantilla
Soportes para biorreactoresProto-LaboratoriosNAImpreso en 3D con PA 12 Black. Consulte el archivo complementario 2 para obtener la plantilla.
Tapa de botella de solvente Diba Omnifit Q-Series, GL38/38-430 (vidrio), 2 puertos UNF(F) sin válvulas, azulCole ParmerEW-21942-86
Tubo Diba Omnifit, PTFE, 1/8" (3,2 mm) de diámetro exterior x 1,5 mm de diámetro interiorCole ParmerEW-21942-76
Adaptador Dibafit, fondo plano de 1/4"-28 UNF(M) a 3,2 mm de diámetro interior, PEEKCole ParmerEW-21941-49
IRWIN 12001ZR Llave de grifo #0-1/4" Mango en TAmazonaB00004YOB0
Grifo de Fracción de Acero al Carbono de Alto Carbono Irwin Hanson 1/4 in. 1 piezaZoroG7695682
Loctite Botella de 8 onzas líquidas de epoxy de alta resistencia de alta resistenciaAmazonaB0044F59N0
Conector Luer Lock macho a machoMicrofluídica de DarwinDM-MM-LUER-PP Alternativa: Conector Luer macho a macho de Strategic Applications Inc - 10/pk - Fisher - NC9876577
Adaptadores Masterflex, Luer a Luer, Nylon, AvantorVWRMFLX45502-56
Adaptador de Conector Masterflex, Nylon, Recto, Hembra Luer a Manguera, 1/16" IDVWRMFLX45502-00
Adaptador de Conector Masterflex, Nylon, Recto, Hembra Luer a Manguera, 3/32" IDVWRMFLX45502-02
Adaptadores de Conector Masterflex, Nylon, Recto, Hembra Luer a Manguera, 1/8"VWRMFLX45502-04
Adaptador de Conexión Masterflex, Nylon, Recto, Macho Luer Lock a Manguera, 1/8VWRMFLX45505-04
Accesorio Masterflex, Nylon, Recto, Macho Luer x 1/4-28 UNFVWRMFLX45505-82
Accesorio Masterflex, polipropileno, codo, adaptador Luer hembra a Luer hembraVWRMFLX45508-26
Tubo de bomba Masterflex Ismatec, 2 paradas, Tygon S3 E-Lab, 0.89 mm IDVWRMFLX96460-26
Tubo de bomba Masterflex Ismatec, 2 paradas, Tygon S3 E-Lab, 1.14 mm de diámetro interiorVWRMFLX96460-30
Masterflex Tubo de transferencia, C-Flex, blanco opaco, 1/8" ID x 1/4" OD; 25 piesVWRMFLX06424-67
Mohr' s Pinchcock para tubing VWR470201-374
Arandelas de Goma de Neopreno ½ ” OD x ¼ ” ID x 1/16" Espesor AmazonaB01A29F1R0
Septos de goma con sello de precisiónSigma AldrichZ553905
Spinbar Micro Stir BarsVWR58948-375
TetragrabadoCompañía R.S. HughestTE-500
Soporte de tuberíaProto-LaboratoriosNAImpreso en 3D con PA 12 Black. Consulte el archivo complementario 3 para obtener la plantilla.
Bomba de cartucho multicanal Watson-Marlow 205SWatson-Marlow020.3724.00AAlternativa, con descuento: Bombas peristálticas digitales Ismatec IPC MFLX7800142 - FISHER - 113-200-014 o Masterflex Bomba peristáltica Ismatec IPC, 0,1 a 11,25 rpm, 24 canales, 115/230 VCA, Avantor, VWR, MFLX78006-48-CH

References

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