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Artículo de método

Evaluación de la aterosclerosis en la aorta de ratones inyectados con AAV8-PCSK9 mediante tinción de rojo de aceite O

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DOI:

10.3791/68795

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8 de agosto de 2025

 , 
1Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Anhui Provincial Key Laboratory of Metabolic Health and Panvascular Diseases

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método paso a paso para diseccionar, perfundir, teñir, obtener imágenes y cuantificar lesiones ateroscleróticas en la cara en aortas de ratón mediante tinción con rojo de aceite.

Resumen

Los modelos de ratón han sido durante mucho tiempo herramientas fundamentales en el estudio de la aterosclerosis, proporcionando información crítica sobre los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la formación de placa, el metabolismo de los lípidos y la inflamación cardiovascular. Más allá de los ratones Apoe-/- o Ldlr-/-, la inyección de AAV8-PCSK9D377Y en ratones C57BL/6J normales con alimentación dietética concurrente de tipo occidental emerge como un modelo comúnmente utilizado para la investigación traslacional en aterosclerosis. La tinción con rojo de aceite O es una técnica fundamental para visualizar la acumulación de lípidos neutros en los tejidos vasculares. Su simplicidad, rentabilidad y alta sensibilidad para detectar lesiones cargadas de lípidos lo convierten en el estándar de oro para evaluar la carga de placa aterosclerótica en estudios preclínicos. En este estudio, proporcionamos un protocolo detallado y reproducible para la disección, perfusión, apertura longitudinal, tinción de O rojo de aceite, imágenes y cuantificación semiautomatizada de la carga aterosclerótica en la aorta en la cara, sin necesidad de clavos ni pasos de montaje complejos. Nuestros resultados demuestran que la combinación de la inyección de AAV8-PCSK9D377Y y la alimentación con dieta de tipo occidental induce eficazmente la formación significativa de lesiones ateroscleróticas en ratones, y que la tinción con O rojo de aceite en la cara es una técnica confiable y eficiente para evaluar la deposición de lípidos y la carga de placa. Además, aunque este protocolo está optimizado para el modelo inducido por AAV8-PCSK9 en ratones C57BL / 6J, se puede adaptar fácilmente para su uso en otros modelos y especies, como ratones Apoe / -, ratones Ldlr / - y hámsteres sirios dorados Ldlr - / -.

Introducción

La aterosclerosis, marcada por el depósito de lípidos y la inflamación dentro de la íntima arterial, representa la base patológica de la enfermedad arterial coronaria y una amplia gama de enfermedades cardiovasculares (ECV), incluido el infarto de miocardio y el accidente cerebrovascular 1,2,3,4. Las ECV siguen siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, lo que representa una importante carga sanitaria y económica mundial 3,5. Como base patológica principal de la ECV, la aterosclerosis ha atraído una amplia atención de investigación destinada a descubrir sus mecanismos subyacentes y desarrollar estrategias terapéuticas efectivas. Los modelos de ratón juegan un papel central en la dilucidación de los mecanismos subyacentes a la aterogénesis y en la evaluación de posibles intervenciones terapéuticas6. El desarrollo de modelos animales ha sido fundamental para avanzar en nuestra comprensión de la aterogénesis, lo que ha permitido a los investigadores diseccionar los mecanismos celulares y moleculares involucrados y evaluar estrategias terapéuticas emergentes 6,7. Los modelos murinos clásicos de aterosclerosis, como los ratones deficientes en apolipoproteína E (Apoe-/-) y los ratones deficientes en receptores de lipoproteínas de baja densidad (Ldlr-/-), se han empleado durante mucho tiempo para inducir hiperlipidemia y formación de placa robusta. Sin embargo, la generación y el mantenimiento de estas líneas modificadas genéticamente requieren una cría extensiva, lo que puede llevar mucho tiempo y limitar la flexibilidad experimental 8,9,10. Para superar estas limitaciones, ha ganado prominencia un enfoque alternativo que utiliza el serotipo 8 del virus adenoasociado que codifica una mutación de ganancia de función en la proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (AAV8-PCSK9D377Y). Cuando se administra a ratones C57BL/6J de tipo salvaje en combinación con una dieta alta en grasas y colesterol de tipo occidental, este método induce eficientemente la hipercolesterolemia y las lesiones ateroscleróticas en un período de tiempo relativamente corto, sin la necesidad de cruces genéticos complejos o retrocruzamientos en fondos propensos a la aterosclerosis 9,11. A pesar de sus ventajas, el modelo AAV8-PCSK9 tiene ciertas limitaciones que merecen consideración. En particular, el grado de hipercolesterolemia y el desarrollo de lesiones ateroscleróticas puede verse influenciado por variables como la dosis viral y los medios de administración, que pueden introducir variabilidad entre animales y afectar la reproducibilidad de los resultados experimentales11.

Para evaluar la carga de enfermedad en tales modelos, la tinción de Rojo Aceite O de la aorta proporciona una técnica sensible y bien establecida para visualizar y cuantificar lesiones ateroscleróticas ricas en lípidos a lo largo de la superficie luminal de la vasculatura12,13. Este enfoque ofrece datos cualitativos y cuantitativos y es ampliamente utilizado en estudios preclínicos para evaluar los efectos de la manipulación genética, la intervención farmacológica o la modulación dietética14.

En este estudio, presentamos un protocolo práctico y reproducible para el aislamiento, la perfusión, la apertura longitudinal, la tinción con O rojo de aceite, la obtención de imágenes y la cuantificación semiautomática de lesiones ateroscleróticas en aortas de ratón de montaje completo. En este protocolo, AAV8-PCSK9D377Y se administra a una dosis de 5 ×10 11 genomas vectoriales (vg) por ratón mediante inyección en la vena de la cola. Cuando se combina con una dieta de tipo occidental (WD) que contiene 40% de kcal de grasa y 1,25% de colesterol, se puede observar un desarrollo robusto de lesiones ateroscleróticas en 12-16 semanas. El protocolo aquí agiliza cada paso del proceso, eliminando la necesidad de fijar tejidos en las superficies de cera y, en su lugar, empleando una técnica de aplanamiento simplificada que reduce la variabilidad y la demanda técnica. El método no solo está optimizado para el modelo inducido por AAV8-PCSK9D377Y en ratones C57BL / 6J, sino que también es fácilmente aplicable a otros modelos de aterosclerosis ampliamente utilizados, incluidos los ratones Apoe / - y Ldlr / / -, así como los hámsteres dorados sirios Ldlr - / - 15,16,17,18,19, que se han convertido en un modelo prometedor debido a su metabolismo lipídico similar al humano.

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Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas descritas en los NIH y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Ciencia y Tecnología de China (Aprobación de Ética No. USTCACUC27120124102).

NOTA: Todos los procedimientos que involucran AAV8-PCSK9 deben realizarse en un gabinete de seguridad biológica certificado de Clase II bajo condiciones de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). El personal debe usar equipo de protección personal (EPP) adecuado, incluida una bata de laboratorio, guantes desechables y gafas de seguridad.

1. Inducción de aterosclerosis en ratones

  1. Inyecte un ratón C57BL/6J de 8 semanas de edad por vía intravenosa con AAV8-PCSK9D377Y (5 × 1011 vg/ratón a través de la vena de la cola).
  2. Coloque el mouse sobre WD (que contiene 40% de kcal de grasa y 1,25% de colesterol) inmediatamente después de la inyección.
  3. Alimente al ratón WD durante 12-16 semanas para inducir la formación de lesiones ateroscleróticas.
    NOTA: Un período de alimentación de 12 semanas se usa comúnmente y se ha demostrado que induce una evidente formación de placa aterosclerótica, particularmente en modelos inducidos por AAV8-PCSK9. Las duraciones más largas (por ejemplo, 16 semanas) pueden producir lesiones más avanzadas, y se debe seleccionar el momento óptimo en función de los objetivos experimentales específicos.
  4. Controle regularmente el peso corporal, la salud general y los niveles de lípidos plasmáticos durante todo el período de alimentación. Para el perfil lipídico, recolecte muestras de sangre al inicio y en momentos seleccionados (p. ej., cada 4 semanas) mediante sangrado submandibular o de la vena de la cola bajo anestesia breve con isoflurano.

2. Eutanasia y perfusión

  1. Administrar pentobarbital sódico (200 mg/kg, inyección intraperitoneal) para sacrificar al ratón.
  2. Abra la cavidad torácica para exponer el corazón.
  3. Haga una incisión en la orejuela auricular derecha y perfunda solución salina tamponada con fosfato fría (PBS, aproximadamente 10 ml) a través del ventrículo izquierdo con una aguja de 21 G para eliminar la sangre.

3. Disección de la aorta

  1. Eliminar el exceso de tejidos, como los pulmones y el timo, para exponer la aorta torácica desde el corazón hasta el diafragma.
  2. Use tijeras de disección finas y fórceps de precisión para eliminar el tejido adiposo circundante alrededor del arco aórtico. Eleve suavemente el tejido adiposo que rodea la base de la aorta torácica cerca del diafragma. Extirpar a lo largo de la raíz del tejido adiposo con unas tijeras de disección finas (asegurándose de que la estructura vascular no se dañe), continuando la disección hacia arriba hasta el arco aórtico para exponer completamente el vaso aórtico.
    NOTA: La disociación del tejido graso perivascular de la aorta es crítica, y se sugiere que este paso se realice con la aorta in situ (antes de cortarla del ratón) ya que la disección de la grasa perivascular de la aorta es técnicamente difícil una vez que la aorta se disecciona y se coloca en PBS.
  3. Seccionar el vaso en la base de la aorta torácica con unas tijeras de precisión. Eleve el extremo cortado con fórceps y diseccione hacia arriba a lo largo del vaso hacia el arco aórtico. Corta las tres ramas primarias de la aorta a una distancia adecuada.
  4. Transecto en la raíz aórtica para separar la aorta torácica del corazón, aislando el segmento completo para su posterior análisis.
  5. Transfiera el recipiente extirpado a una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% preenfriada e incube a 4 °C durante la noche (12-16 h). Para estandarizar el manejo y facilitar el procesamiento por lotes, coloque aortas individuales en pocillos de una placa de 24 o 48 pocillos durante la fijación.
    NOTA: Evite la fijación prolongada (más de 24 h), ya que la incubación excesiva en PFA puede causar el endurecimiento de los vasos, lo que dificulta el corte longitudinal y el análisis posterior.
    PRECAUCIÓN: El PFA al 4% es un fijador tóxico y volátil que presenta riesgos de exposición respiratoria y dérmica. Todos los pasos relacionados con la fijación de PFA deben llevarse a cabo en una campana extractora mientras se usa el EPP, incluidos guantes de nitrilo, bata de laboratorio y gafas de seguridad. Evite la inhalación y el contacto con la piel. La solución de PFA usada debe recolectarse en contenedores designados para desechos de formaldehído, claramente etiquetados y desechados como desechos químicos peligrosos por un servicio institucional o autorizado de eliminación de desechos químicos.

4. Tinción de aceite rojo O

  1. Lave las aortas fijas tres veces con PBS para eliminar el PFA residual.
  2. Como se muestra en la Figura 1, abra la aorta longitudinalmente bajo un microscopio de disección con unas tijeras finas, comenzando desde la raíz aórtica a lo largo de la curvatura interna. Alternativamente, abra la aorta antes de la fijación, lo que puede facilitar el despliegue y la alineación del vaso durante el montaje. Si es necesario, abra longitudinalmente las ramas principales del arco aórtico, como la arteria braquiocefálica (BCA), la arteria carótida derecha (RCA) y la arteria subclavia izquierda, para exponer regiones adicionales11. Tenga cuidado durante este paso, ya que las placas en estas áreas pueden desprenderse o dañarse.
    NOTA: Cualquiera de los enfoques se puede seleccionar según la preferencia del operador y la condición del tejido.
  3. Prepare la solución de trabajo Oil Red O diluyendo el stock al 0,5% en isopropanol con agua desionizada en una proporción de 3:2 (v/v, concentración final 0,3%). Incubar en un baño de agua a 37 °C durante 5 min para disolver el tinte por completo.
  4. Filtre a través de una membrana de 0,22-0,45 μm para eliminar los precipitados. Mantener la solución en el baño maría a 37 °C hasta su uso.
  5. Retire PBS de cada pocillo. Agregue la solución de trabajo Oil Red O para sumergir completamente las aortas. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 10 min.
  6. Después de la incubación, aspire la solución e inmediatamente agregue 1 ml de isopropanol al 60% a cada pocillo. Coloque el plato en una coctelera y agite suavemente para lavar.
  7. Después de aproximadamente 30 s, cuando las áreas no lesionadas del vaso parezcan translúcidas, detenga el lavado aspirando el isopropanol. Enjuague las muestras dos veces con PBS.
  8. Después de la tinción de Rojo Aceite, recorte aún más el tejido adiposo perivascular residual, si es necesario. En esta etapa, el tejido adiposo suele estar bien teñido y se distingue visualmente, lo que permite una identificación y eliminación más precisas sin comprometer la integridad de la pared vascular.
  9. Después de la tinción de Rojo Aceite O, abra la aorta longitudinalmente y móntela con cuidado en un portaobjetos de vidrio para obtener imágenes inmediatas bajo un microscopio estereoscópico.
  10. Alternativamente, almacene las muestras a corto plazo en PBS a 4 °C antes de la obtención de imágenes. Para las arterias que son difíciles de aplanar, fije los vasos en una placa de cera negra con agujas finas para garantizar un posicionamiento y claridad óptimos. Para una conservación a largo plazo, monte los recipientes manchados en portaobjetos de vidrio, séllelos con gelatina de glicerol y luego visualícelos directamente.
    NOTA: Transfiera las aortas teñidas a una placa nueva para lavarlas y evitar la contaminación por aceite residual Red O.
    PRECAUCIÓN: Oil Red O es un colorante lipofílico que normalmente se prepara en isopropanol, que es inflamable e irritante. Manipule las soluciones ORO en una campana extractora química para evitar la inhalación de humos. Evite el contacto con la piel y los ojos. Las soluciones para teñir de Rojo Aceite O deben recogerse por separado en contenedores de residuos químicos inflamables. Deseche de acuerdo con las regulaciones locales de eliminación de desechos peligrosos.

5. Imágenes

  1. Monte las aortas teñidas sobre un fondo blanco para mejorar el contraste. Mantenga la flexibilidad de la embarcación.
    NOTA: Un fondo de alto contraste facilita un reconocimiento más eficiente de la placa mediante un software de análisis de imágenes. También se pueden usar otros colores de fondo según las preferencias del usuario.
  2. Obtén imágenes de toda la aorta con un escáner plano o un microscopio de disección con una cámara de alta resolución.
  3. Garantice una iluminación uniforme y un aumento uniforme en todas las muestras (por ejemplo, un aumento de 6 a 8 veces). Si la aorta se seca durante las imágenes, rehidrátese con toallitas de kiwi bañadas en solución salina o PBS.

6. Cuantificación de lesiones ateroscleróticas

  1. Abre la imagen en ImageJ. Los siguientes pasos describen el procedimiento de análisis utilizando ImageJ como ejemplo.
    NOTA: También se puede utilizar otro software de análisis de imágenes (por ejemplo, Zeiss Zen, Fiji) según las preferencias y disponibilidad del usuario.
  2. Establezca la escala usando una referencia conocida (por ejemplo, barra de escala o regla). Usa la herramienta Línea recta para dibujar sobre la distancia conocida. Vaya a Analizar > Establecer escala, introduzca la distancia y las unidades, seleccione Global y haga clic en Aceptar.
  3. Usa la herramienta de selección de polígonos o a mano alzada para delinear toda la región aórtica.
  4. Mida el área usando Analizar > Medir.
  5. Identifique las áreas de placa aterosclerótica utilizando Imagen > Ajustar > umbral de color. Ajuste la saturación y el brillo para aislar las regiones Oil Red O-positive.
  6. Haga clic en Seleccionar para generar una selección binaria de áreas teñidas. Mida las regiones seleccionadas mediante Analizar > Medir. Aplique la misma configuración de umbral en todas las imágenes de un lote.
    NOTA: Dado que la grasa residual o los artefactos pueden dar lugar a una tinción falsa positiva, los usuarios pueden optar por definir manual o semiautomáticamente las regiones de la placa en función de sus necesidades experimentales específicas y la calidad de la imagen. El rastreo manual del área de la placa se puede realizar utilizando el mismo método que para definir el área total del vaso.
  7. Exporte los resultados (Archivo > Guardar como > resultados) como .csv para su posterior análisis.
  8. Exprese el área de la placa como área de placa/área aórtica total × 100%. Para obtener una evaluación más precisa de la carga de placa aterosclerótica, cuantifique el área de la placa por regiones anatómicas (p. ej., arco aórtico, especialmente la curvatura menor, y aorta total) y exprese los resultados como el porcentaje del área de placa en relación con el área de superficie total de cada región respectiva: área de placa (%) = (área de placa / área total de la región) × 100%.
    NOTA: Para minimizar el posible sesgo, se recomienda el análisis ciego. Si se analiza un gran número de imágenes, todo el flujo de trabajo, desde el umbral hasta la medición, puede automatizarse utilizando el Macro Recorder (Plugins > Macros > Record) y procesarse de forma masiva utilizando Process > Batch > Macro. Esto permite un análisis de alto rendimiento eficiente y reproducible.

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Resultados

Para evaluar el grado de depósito de lípidos en la pared aórtica, se realizó una tinción de O rojo de aceite en aortas aisladas de ratones machos C57BL / 6J inyectados con AAV8-PCSK9D377Y y alimentados con una dieta occidental durante 12 semanas, junto con ratones de control de la misma edad. Después de la perfusión sistémica con PBS y una disección cuidadosa, todas las aortas se disecaron longitudinalmente cuidadosamente y se tiñeron con Oil Red O para visualizar lesiones ateroscleróticas cargadas de lípidos....

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Discusión

El método de tinción en cara de Oil Red O descrito en este estudio ofrece un enfoque robusto, reproducible y eficiente en el tiempo para evaluar la carga de lesiones ateroscleróticas en toda la aorta. En este estudio, seleccionamos específicamente el arco aórtico y la aorta torácica como las regiones de interés para el análisis de placa, en lugar de toda la aorta. Esta decisión fue guiada por la naturaleza del modelo AAV8-PCSK9D377Y 20, que generalmente...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant Nos. 82370444).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ratones C57BL/6JGemPharmatech Nº N000013
  4% de paraformaldehídoBeyotimeP0099Para fijar tejidos
AAV8-PCSK9D377Y partículas virales WzbiopAV208001Para inducir la aterosclerosis
Pinzas finasde ciencia finaNo. 11254-20Para la disección de la aorta
ImageJNIH1.47
IsopropanolSangon biotechA600918Para limpiar el exceso de aceite rojo
Aceite rojo O 0.5% Solución en isopropanolPoly Scientific R& D CorpS1849-32OZPara tinción de aceite rojo O
Solución salina tamponada con fosfatoServicebioG4202Para perfusión y limpieza de aortas
Tijeras de resorteciencia finaNo. 15003-08Para disección de aorta
Microscopio estereoscópicoMshotMZ62Para disección de aorta e imágenes
Dieta occidental Investigación DietaD12108CPara inducir la aterosclerosis
Herramientas Herramientas de

Referencias

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