Este método visualiza la estructura nativa de las fibras de colágeno en el cuerpo vítreo mediante microscopía de reflectancia confocal.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Preparación de ojos porcinos para microscopía de reflectancia confocal para visualizar la red de fibras de colágeno vítreo
En este artículo
Resumen
Resumen
El vítreo es un gel transparente que llena el espacio entre el cristalino y la retina. Su estructura está respaldada por una red de fibras de colágeno, lo que probablemente influye en las propiedades viscoelásticas y contribuye a la enfermedad de la retina. Sin embargo, la organización de esta red de colágeno sigue estando mal caracterizada porque la obtención de imágenes del vítreo en su estado nativo es un desafío. Muchas técnicas de imagen aplicadas al vítreo causan deshidratación y distorsión, y los métodos basados en colorantes pueden introducir artefactos o etiquetado inespecífico, lo que dificulta el estudio de la red de colágeno. En este protocolo, describimos: 1) un método para diseccionar ojos porcinos para obtener imágenes; 2) una estrategia para montar los ojos en un microscopio invertido; 3) pautas para obtener imágenes de la red de colágeno vítreo en su estado nativo utilizando microscopía de reflectancia confocal; y 4) instrucciones para el análisis cuantitativo de imágenes de entidades de red. Destacamos los errores comunes y enfatizamos los puntos técnicos clave. Reportamos la aplicación de microscopía de reflectancia confocal al vítreo. En comparación con las estrategias anteriores de imágenes vítreas, este enfoque conserva la estructura, orientación y distribución nativas de las fibras de colágeno vítreo sin colorantes exógenos ni artefactos de deshidratación. La microscopía de reflectancia confocal puede sondear la base estructural de la rigidez del gel vítreo en la salud y la enfermedad.
Introducción
El vítreo es la matriz extracelular entre el cristalino y la retina en el ojo. La tracción del vítreo en la retina juega un papel importante en la pérdida de visión en enfermedades como el desprendimiento de retina, el agujero macular y la tracción vitreomacular 1,2,3,4. La capacidad del vítreo para transmitir fuerzas de tracción a la retina está determinada por la rigidez de su gel, que a su vez depende de las propiedades de sus componentes principales, colágeno y ácido hialurónico5. La rigidez del gel del vítreo probablemente esté influenciada por las características de la red de fibras de colágeno, ya que la rigidez de los geles de colágeno artificiales está impulsada por características de la red como la densidad, la alineación y el ancho de la fibra6.
La red de fibras de colágeno vítreo es difícil de visualizar debido al alto contenido de agua y la baja concentración de colágeno7, lo que conduce a una distorsión artifactual durante el procesamiento para microscopía o microscopía electrónica de transmisión. La histología tradicional y la microscopía electrónica de transmisión requieren procesamiento para endurecer el vítreo para un corte delgado. La deshidratación requerida para la inclusión histológica hace que las fibras vítreas se agreguen en una configuración de panal8, y la formación de cristales de hielo durante la congelación aumenta el tamaño de los poros en la matriz extracelular9. Se ha aplicado la incrustación de plástico8 y la congelación rápida10 al vítreo para minimizar el artefacto, aunque es probable que quede algún artefacto residual. La microscopía de contraste de fase es un método que no requiere seccionamiento y se ha aplicado en el vítreo, pero requiere la extracción de un pequeño trozo de vítreo del ojo, perdiendo así la posición y orientación original de la red11. Más recientemente, la microscopía cuantitativa de luz polarizada se ha utilizado para mapear la orientación promedio de las fibras a través de un ojo porcino macroscópicamente seccionado, pero las fibras individuales no pudieron resolverse12. Además, los enfoques de etiquetado basados en colorantes (por ejemplo, azul de tripano, rojo picrosirius, 5-(4,6-diclorotriazinil) aminofluoresceína) pueden introducir artefactos o etiquetado inespecífico y, por lo tanto, se evitaron para preservar la red de colágeno nativo.
Adoptamos el método de preparación de muestras utilizado por Filas et al. para el estudio de microscopía de luz polarizada, es decir, disección macroscópica en un bloque de agarosa12, y obtuvimos imágenes de la muestra utilizando microscopía de reflectancia confocal, que no se ha aplicado previamente al vítreo. Usando este método, hemos adquirido imágenes de la red de fibras de colágeno vítreo en un estado hidratado, casi fisiológico. Esto ofrece varias ventajas sobre los métodos anteriores, incluida la reducción de artefactos en comparación con los enfoques basados en la congelación-fractura o la deshidratación10,13. Este protocolo requiere un microscopio confocal invertido con un objetivo de inmersión de al menos 30x aumento, una apertura numérica superior a 0,9 y una distancia de trabajo superior a 200 μm. Incluimos una guía clave para la preparación de muestras y la adquisición de imágenes para facilitar una resolución clara de las fibras. Al mantener un estado casi nativo de la matriz de colágeno vítreo, este enfoque permite a los investigadores analizar cuantitativamente la orientación, la densidad y la distribución espacial de la fibra, parámetros que probablemente sean cruciales para comprender la rigidez vítrea y sus cambios patológicos. Esta técnica está especialmente indicada para investigadores interesados en la red de colágeno vítreo, su estructura y la patogénesis de las enfermedades vitreorretinianas.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación y disección de tejidos
NOTA: Esta investigación se realizó de acuerdo con las directrices institucionales. En nuestra institución, no se requirió la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales para realizar experimentos en ojos porcinos ex vivo .
- Obtener ojos porcinos ex vivo de una planta procesadora de carne. Use los ojos dentro de las 48 h posteriores a la muerte.
NOTA: Aunque la apariencia vítrea no cambia con un tiempo postmortem más largo, la retina y la coroides se degradan, lo que lleva a la dispersión de desechos celulares y pigmentados durante la disección. Estos desechos pueden interferir con las imágenes y el análisis de fibras. - Elimine el exceso de músculo y tejido conectivo del globo.
- Coloque el pedestal de tres puntas en la base de un molde de cubos, como un molde de cubitos de hielo de silicona extra grande (Figura 1A y Figura 2).
- Coloque el globo terráqueo en el pedestal de tres puntas, colocándolo de modo que el limbo descanse sobre las puntas.
- Haga un gel de agarosa al 3% agregando 3 g de agarosa de uso general a 100 ml de agua destilada y luego calentando la solución hasta que se disuelva. Una vez que la solución se haya enfriado a unos 37 °C, viértala en el molde hasta que el ojo se sumerja en agarosa.
NOTA: Esto incrustará el ojo en gel de agarosa para estabilizar el ojo para la disección. - Enfríe el cubo de agarosa durante al menos 4 h.
NOTA: Esto aumenta la adhesión del gel al ojo y asegurará que el ojo permanezca inmóvil durante la disección - Después de enfriar, retire el cubo de agarosa del molde. Luego, retire el pedestal del cubo (Figura 1B).
- Construye un marco de tres lados en las mismas dimensiones que el cubo de agarosa usando una combinación de ladrillos, placas y baldosas de Lego de 1 x 8 (Figura 3).
NOTA: Esto asegurará el cubo en su lugar y proporcionará una guía para la cuchilla durante la disección. La altura del marco de Lego determinará la ubicación en la que se cortará el ojo. Esto se puede visualizar a través del gel de agarosa semitransparente. - Coloque el cubo de agarosa enfriado en el marco de Lego. Sostenga una hoja de micrótomo de alto perfil por los bordes romos y alinee la hoja con la parte superior del marco de Lego. Aplique una suave presión hacia abajo en la parte superior del cubo y arrastre suavemente la hoja del micrótomo hacia adelante y hacia atrás a través de todo el cubo y el ojo incrustado (Figura 1C).
NOTA: Esto creará una sección de tejido ocular que está incrustada en la agarosa, que se denominará "tapa del ojo".
2. Muestra de montaje para imágenes
- Con la cuchilla del micrótomo, recorte aproximadamente 1 mm de agarosa de toda la superficie cortada del cubo (Figura 4A).
NOTA: Esto dejará una pequeña sección de la tapa del ojo que se extiende por encima de la superficie cortada del cubo de agarosa - Use una toallita de papel o una esponja de celulosa triangular pequeña para secar la superficie cortada del cubo de agarosa, especialmente cerca del borde de la tapa del ojo.
- Agregue aproximadamente una cucharadita de masilla de silicona para todo uso a una pequeña bolsa de plástico para sándwich y corte un agujero de 3 mm en una de las esquinas inferiores de la bolsa para crear una manga pastelera para la masilla.
- Con la manga pastelera, aplique una fina gota de masilla a la superficie cortada del cubo de agarosa, justo a lo largo del borde de la tapa del ojo, creando un borde impermeable alrededor de la muestra (Figura 4B). Esto evitará que el gel vítreo se escape de la tapa del ojo.
- Coloque un vidrio de cubreobjetos grande sobre la tapa del ojo y presione hacia abajo para que la superficie cortada de la tapa del ojo esté en contacto con el cubreobjetos sin aire o líquido atrapado (Figura 4C). Confirme que la perla de silicona hace un sello continuo con el cubreobjetos.
NOTA: Si la masilla de silicona no forma un sello continuo, el líquido vítreo puede filtrarse y permitir que entre aire en la muestra. La exposición al aire hará que el vítreo se encoja, lo que dará como resultado fibras más brillantes y densas, así como un área líquida sin fibras. Si el vítreo no está en contacto con el cubreobjetos, será difícil obtener imágenes. - Mientras sostiene el cubo de agarosa, invierta la muestra y colóquela en el adaptador de cubreobjetos grande para obtener imágenes en un microscopio invertido (Figura 4D y Figura 5).
3. Adquisición de imágenes
- Use un microscopio confocal invertido que no sea del tipo de disco giratorio. Utilice un objetivo de agua (con agua o gel lubricante ocular como acoplador) u objetivo de aceite con una apertura numérica de al menos 0,90, un aumento entre 30x-60x y una distancia de trabajo de al menos 200 μm.
- Ajuste la configuración de la trayectoria de la luz para el microscopio confocal para obtener imágenes de reflectancia. En lugar del espejo dicroico utilizado para redirigir la luz excitante y transmitir la luz emitida para la obtención de imágenes de fluorescencia, asegúrese de que haya un espejo divisor de haz que redirija una proporción del láser iluminador y transmita una proporción de la luz reflejada.
NOTA: La señal de reflectancia de las fibras de colágeno vítreo es algo débil, por lo que el ruido de fondo puede afectar la capacidad de obtener imágenes de las fibras. Se observó una relación señal-ruido mejorada con una longitud de onda de 473 nm, pero pudimos obtener imágenes de las fibras de colágeno vítreo con longitudes de onda que oscilan entre 405 nm y 635 nm. - Establezca las longitudes de onda de detección para incluir la longitud de onda del láser iluminador.
- Para orientar la posición Z dentro de la muestra, disminuya la potencia del láser a la configuración más baja posible e identifique el destello de luz reflejada del cubreobjetos. Esto sucederá en la parte inferior y superior del cubreobjetos (Figura 6).
NOTA: Cerca del cubreobjetos, hay una señal reflectante considerable en el fondo. Lejos del cubreobjetos, la señal de la luz reflejada de las fibras de colágeno disminuye. - Ajuste la posición z para que quede ubicada sobre la parte superior del cubreobjetos y dentro de la muestra.
- Aumente la potencia del láser a un nivel más alto que el que se usa habitualmente para una aplicación de fluorescencia.
NOTA: Hay un artefacto de anillo reflectante que estará en el centro del campo de imágenes. Una combinación de acercar y descentrar el campo de imágenes puede ayudar a excluir este artefacto (Figura 7). - Utilice el promedio de línea y aumente el tiempo de permanencia de píxeles en la configuración de adquisición de imágenes, que son métodos estándar para aumentar la relación señal-ruido en microscopios confocales.
4. Análisis de imágenes del ancho de la fibra usando CT-FIRE 14
- Instale CT Fire siguiendo las instrucciones de este sitio web: https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki/Downloads-and-Installation-(CTF).
NOTA: Las versiones utilizadas aquí fueron "CT-FIRE V3.0 BetaWindows64-2018b" y el tiempo de ejecución de MATLAB, "MCR-2018b-win64". Ambos deben descargarse para que el software funcione. - Convierta las imágenes a tif de 8 bits y abra las imágenes tif de 8 bits en CT-FIRE.
- Asegúrese de que el software esté configurado en CT-Fire en la esquina superior derecha y luego seleccione Ejecutar.
- CT-FIRE cargará automáticamente los resultados del análisis en una carpeta llamada "ctfireout" ubicada en la misma carpeta que la imagen original. Examine la calidad de la extracción comparando el archivo que comienza con el nombre "OL_ctFIRE" con la imagen original. Para seguir este protocolo, utilice la siguiente configuración predeterminada para la segmentación de imágenes (es decir, la identificación de fibras): thresh_im2: 5; s_xlinkbox: 8; thresh_ext: 70; thresh_dang_L: 15; thresh_short_L: 15; s_fiberdir: 4; thresh_linkd: 15; thresh_linka: -150; thresh_flen: 15
- Si las fibras no se identifican con precisión, ajuste los parámetros haciendo clic en el botón Actualizar en la sección de parámetros en la esquina superior derecha.
NOTA: La guía sobre cómo ajustar los parámetros se puede encontrar en la página 20 en la sección "3 Notas" del manual de CT-FIRE, que se encuentra en la carpeta de la aplicación CTFIRE. Se pueden encontrar consejos adicionales en el artículo de Liu et al. en la sección 3.5.215.
- Si las fibras no se identifican con precisión, ajuste los parámetros haciendo clic en el botón Actualizar en la sección de parámetros en la esquina superior derecha.
- Ajuste la configuración de salida si lo desea para limitar las fibras que aparecen en las imágenes de salida. Para seguir este protocolo, utilice la siguiente configuración predeterminada: Longitud mínima de fibra [píxeles]: 30; Res. de imagen [ppp]: 300; Ancho de línea de fibra [0-2]: 0,5; Ancho máximo de fibra [píxeles]: 15
- Para convertir las unidades de ancho de píxel a μm, abra la imagen original en Fiji. Utilice las dimensiones de la imagen que aparecen en píxeles y μm en la esquina superior izquierda de la ventana de visualización para calcular una proporción.
5. Análisis de imágenes de densidad de fibra, curvatura, alineación, lacunaridad, unidad de crecimiento de hifas y dimensión fractal usando TWOMBLI16
- Descarga TWOMBLI desde https://github.com/wershofe/TWOMBLI.
- Siga las instrucciones del archivo: TwombliDocumentation en "Instalación y dependencias".
- Abra la carpeta TWOMBLI_v1/programs y reemplace AnamorfProperties.xml archivo con AnamorfPropertiesEH.xml archivo (Archivo complementario 1).
- En la carpeta TWOMBLI_v1/programs, sustituya el archivo Twombli_v1.ijm por el archivo Twombli_v2.ijm (archivo complementario 2).
- Cree una carpeta con carpetas vacías llamada "test HDM", "test masks", "HDM" y "masks".
- Convierte las imágenes a tif de 8 bits.
- Coloque de 3 a 5 imágenes en una carpeta de "entrada de conjunto de prueba".
- Ponga todas las imágenes a analizar en una sola carpeta sin subcarpetas llamada "elegible".
- En Fiji, haga clic en Complementos | Macros | Ejecutar | elija Twombli_v2.ijm en twombli/Programs.
- Sigue las indicaciones para ejecutar TWOMBLI. Para seguir este protocolo, utilice los siguientes parámetros: Saturación de contraste, 0,35; Ancho mínimo de línea, 3; Ancho máximo de línea, 3; Ventana de curvatura mínima, 40; Ventana de curvatura máxima, 40; Longitud mínima de la rama, 10; HDM máximo de pantalla, 100; Diámetro mínimo del espacio, 0
NOTA: Es posible que sea necesario ajustar los parámetros de las imágenes. El software guiará al usuario a través de la elección de los parámetros, y se pueden encontrar instrucciones adicionales en el archivo TwombliDocumentation.docx, que vino con el programa.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Se tomó una imagen de un ojo de cada uno de los tres cerdos adultos jóvenes (una hembra de 4 meses, un macho de 5 meses y una hembra de 6 meses) después de seccionar el ojo en un plano axial a través del limbo inferior. Se adquirieron seis ubicaciones de imágenes en el plano de sección X-Y, espaciadas a 4 mm de distancia. En cada ubicación de imagen, se obtuvo una cuadrícula contigua de 4 x 4 de imágenes de 70 μm x 70 μm (Figura 8). Para cada cerdo, cada imagen se analizó por separado para v...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Los métodos previos de imágenes vítreas mostraron agregación de fibras artefactuales13, pérdida de organización, orientación y ubicación de las fibras17, o se basaron en una resolución mucho más alta con un campo de visión más pequeño, lo que limitó la información sobre la distribución de las fibras10. La microscopía de reflectancia confocal de tejido fresco ex vivo y macroscópicamente seccionado proporciona imágenes...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Todos los autores informan que no hay conflictos de intereses relevantes.
Agradecimientos
Subvención básica de los Institutos Nacionales de Salud EY014800; Subvención sin restricciones de Investigación para Prevenir la Ceguera, Nueva York, NY, al Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales, Universidad de Utah; NIH NEI K08 EY034549; Fundación del Hospital Infantil Primario; Fundación E. Matilda Ziegler; Agradecemos a los Dres. Guillaume L. Hoareau y M. Austin Johnson por los ojos porcinos.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agarose I | VWR | 0710-500G | |
| Silicona multiusos 1 masilla, transparente | GE | 2795576 | |
| Esponja de celulosa (Weck-Cel Eye Spear) | Beaver -Visitec | 000865 | |
| Pedestal personalizado de 3 clavijas | NA | NA | |
| Adaptador personalizado para montar un gran vidrio de cubierta | NA | NA | |
| Vidrio grande de cubierta, 1,42" x 2,36" Nº 1 | Ted Pella | 260460-100 | |
| Lego (base clásica, 1 x 8 baldosas, 1 x 8 ladrillos, 1 x 6 placas) | Lego | 11023, 3008, 3666, 4162 | |
| Láminas Microtome (alto perfil) y nbsp; | Lieca Biosystems | 14035838926 | |
| Objetivo de silicona Olympus UPlanSApo 30x | Olimpo | UPLSAPO30XS | |
| Bandeja grande de cubitos de hielo de silicona (Samuelworld) | Amazona | 713243280060 | |
| Toallitas de pañuelo (Kimwipes) y nbsp; | Kimberly Clark | 34120 |
Referencias
- Sebag, J. Vitreous and vision degrading myodesopsia. Prog Retin Eye Res. 79, 100847(2020).
- Phillips, J. D., Hwang, E. S., Morgan, D. J., Creveling, C. J., Coats, B. Structure and mechanics of the vitreoretinal interface. J Mech Behav Biomed Mater. 134, 105399(2022).
- Seider, M. I., Conell, C., Melles, R. B. Complications of acute posterior vitreous detachment. Ophthalmology. 129 (1), 67-72 (2022).
- Ketkar, M., et al. Vitreomacular traction - a review. Eye. 39 (4), 710-717 (2025).
- Filas, B. A., Zhang, Q., Okamoto, R. J., Shui, Y. -B., Beebe, D. C. Enzymatic degradation identifies components responsible for the structural properties of the vitreous body. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 55(2014).
- Taufalele, P. V., VanderBurgh, J. A., Muñoz, A., Zanotelli, M. R., Reinhart-King, C. A. Fiber alignment drives changes in architectural and mechanical features in collagen matrices. PLoS One. 14 (5), e0216537(2019).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog Retin Eye Res. 19 (3), 323-344 (2000).
- Los, L. I., van Luyn, M. J. A., Nieuwenhuis, P. Organization of the rabbit vitreous body: Lamellae, Cloquet's channel and a novel structure, the 'Alae canalis Cloqueti'. Exp Eye Res. 69 (3), 343-350 (1999).
- Voytik-Harbin, S. L., Brightman, A. O., Waisner, B. Z., Robinson, J. P., Lamar, C. H. Small intestinal submucosa: A tissue-derived extracellular matrix that promotes tissue-specific growth and differentiation of cells in vitro. Tissue Eng. 4 (2), 157-174 (1998).
- Bos, K. J., et al. Collagen fibril organisation in mammalian vitreous by freeze etch/rotary shadowing electron microscopy. Micron. 32 (3), 301-306 (2001).
- Bembridge, B. A., Crawford, G. N. C., Pirie, A. Phase-contrast microscopy of the animal vitreous body. Br J Ophthalmol. 36 (3), 131-142 (1952).
- Filas, B. A., et al. Quantitative imaging of enzymatic vitreolysis-induced fiber remodeling. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (12), 8626-8637 (2014).
- Los, L. I. The rabbit as an animal model for post-natal vitreous matrix differentiation and degeneration. Eye. 22 (10), 1223-1232 (2008).
- Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. J Biomed Opt. 19 (1), 016007(2014).
- Liu, Y., Keikhosravi, A., Mehta, G. S., Drifka, C. R., Eliceiri, K. W. Methods for quantifying fibrillar collagen alignment. Methods Mol Biol. 1627, 429-451 (2017).
- Wershof, E., et al. A FIJI macro for quantifying pattern in extracellular matrix. Life Sci Alliance. 4 (3), e202000880(2021).
- François, J., Victoria-Troncoso, V., Albarran, E. The histochemical structure of the vitreous fibers studied by phase-contrast microscopy. Am J Ophthalmol. 69 (5), 763-773 (1970).
- Hwang, E. S., Morgan, D. J., Sun, J., Hartnett, M. E., Toussaint, K. C., Coats, B. Confocal reflectance microscopy for mapping collagen fiber organization in the vitreous gel of the eye. Biomed Opt Express. 14 (2), 932(2023).
- Harris, J. R. Visualizing in vitro type I collagen fibrillogenesis by transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 1627, 367-383 (2017).
- Arevalo, R. C., Urbach, J. S., Blair, D. L. Size-dependent rheology of type I collagen networks. Biophys J. 99 (8), L65-L67 (2010).
- Raub, C. B., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
