Artículo de método

Estimulación de las células endoteliales vasculares mediante trampas extracelulares de neutrófilos en presencia de lipoproteínas de baja densidad

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DOI:

10.3791/68830

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12 de agosto de 2025

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1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

En este artículo

Resumen

Se describe una serie de métodos, que incluyen el aislamiento de lipoproteínas de baja densidad (LDL) del plasma humano, la diferenciación de células HL-60 en células similares a neutrófilos, la preparación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) en presencia de LDL y la estimulación de células endoteliales aórticas humanas con una mezcla de NET y LDL.

Resumen

Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) han surgido como factores causales en diversas enfermedades no infecciosas y se han implicado en trastornos cardiovasculares como la aterosclerosis y la trombosis. La formación de NET se observa en la pared vascular y existe evidencia convincente de que los marcadores plasmáticos de formación de NET aumentan con la gravedad de la enfermedad. Los componentes NET derivados de neutrófilos, incluidas las mieloperoxidasas y las proteasas, afectan las lipoproteínas plasmáticas y la homeostasis vascular. Aquí, se describe una serie de métodos para estimular las células vasculares con NET formadas en presencia de lipoproteínas de baja densidad (LDL). El LDL se fraccionó del plasma humano mediante ultracentrifugación. Las células HL-60 se trataron con ácido transretinoico para diferenciarlas en células similares a neutrófilos y luego se estimularon con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) para inducir la formación de NET. Después de la eliminación y el lavado de PMA, las células se incubaron aún más con LDL. Los sobrenadantes recolectados que contenían NET y LDL se utilizaron inmediatamente para estimular las células endoteliales aórticas humanas (HAEC). Como respuesta representativa, la alteración morfológica de los HAEC inducida por el tratamiento con NET se vio reforzada por la presencia de LDL, lo que sugiere que la formación de NET, en combinación con LDL, mejora la respuesta de los HAEC. Estos métodos son beneficiosos para explorar los efectos del LDL en las células endoteliales bajo activación de neutrófilos e inflamación asociada a NET, proporcionando así nuevos conocimientos sobre los mecanismos subyacentes a las enfermedades cardiovasculares asociadas con el aumento de LDL en plasma.

Introducción

Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET), producidas por neutrófilos activados tras la infección bacteriana, así como en condiciones fisiológicamente plausibles no infecciosas, liberan ADN y proteínas descondensadas, como histonas, mieloperoxidasa (MPO) y elastasa de neutrófilos1. Debido a que estos componentes pueden desmantelar las células y tejidos marginales, causando inflamación persistente, la formación de NET ha surgido como un factor causal en el inicio y progresión de diversas enfermedades agudas y crónicas, como la artritis reumatoide, la psoriasis, la diabetes, la enfermedad de Alzheimer, la metástasis del cáncery las enfermedades cardiovasculares. Los análisis histológicos de las lesiones vasculares humanas de aterosclerosis3 y aneurisma de aorta abdominal4 mostraron que la infiltración de neutrófilos y la formación de NET estaban colocalizadas. En la sangre circulante, los niveles de marcadores NET, como histonas citrulinadas, NET-DNA y MPO, aumentan con la gravedad de la enfermedad arterial coronaria5. En las primeras etapas de la aterosclerosis, la formación de NET a menudo precede a la acumulación de lípidos, que ocurre a través de la formación de células espumosas impulsadas por macrófagos 6,7. Estos fenómenos sugieren fuertemente que la MPO y las enzimas proteolíticas liberadas extracelularmente durante la formación de NET pueden actuar no solo sobre los tejidos vasculares sino también sobre los componentes sanguíneos, como las lipoproteínas. Las lipoproteínas son complejos lípidos-proteínas frágiles que pueden ser dañados por proteínas derivadas de NET como MPO8; por lo tanto, la formación de NET puede causar alteraciones estructurales y bioquímicas en las lipoproteínas, influyendo así en la homeostasis vascular. Sin embargo, los efectos sinérgicos de la formación de NET y las lipoproteínas sobre la desregulación inducida por las células vasculares y las respuestas inflamatorias siguen sin estar claros.

Aquí, este manuscrito proporciona un método para examinar las respuestas celulares de las células endoteliales vasculares humanas inducidas por el tratamiento con NET preparados a partir de células similares a neutrófilos derivadas de HL-60 y lipoproteínas de baja densidad (LDL) fraccionadas de plasma humano. Los resultados representativos demuestran el fraccionamiento de LDL del plasma humano por ultracentrifugación y las respuestas celulares de las células endoteliales aórticas humanas (HAEC) estimuladas con NET después de la coincubación con LDL. Este método es ampliamente aplicable al estudio de células vasculares que involucran otras lipoproteínas.

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Protocolo

El protocolo para la preparación de LDL fue aprobado por el comité de ética de la Facultad de Farmacia de la Universidad Médica de Showa (nº 231). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de acuerdo con la Declaración de Helsinki, y todos los participantes proporcionaron voluntariamente sus firmas para participar en este estudio. Las células se manipularon asépticamente utilizando una campana de flujo laminar. El criterio de inclusión fue un rango de edad de 22 a 65 años. Los criterios de exclusión incluyeron hábitos de tabaquismo, enfermedades cardiovasculares preexistentes (como enfermedades coronarias, accidentes cerebrovasculares y enfermedades arteriales periféricas), disfunción hepática grave y afecciones crónicas no controladas, como diabetes, hipertensión, dislipidemia, enfermedades inflamatorias graves y cáncer. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento de LDL del plasma humano

  1. Recolecte sangre completa de un voluntario humano sano en presencia de heparina anticoagulante (10 unidades / ml).
  2. Centrifugar 45-50 mL de sangre total humana obtenida en un tubo de heparina (700 × g durante 15 min a 4 °C). Asegúrese de reducir lentamente la velocidad de la centrífuga. Recoge la capa superior que comprende la fracción plasmática.
  3. Realice la centrifugación dos veces (700 × g, 15 min a 4 °C) con el mismo ajuste de desaceleración que en el paso 1.2 para eliminar las células sanguíneas. Agregue un volumen 1:1,000 de EDTA de 250 mM (pH 7.4) para evitar la oxidación mediada por iones metálicos divalentes de las lipoproteínas.
  4. Coloque 2,7 ml de plasma en un tubo de policarbonato (4PC) de 4 ml, superponga 900 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga 250 μM DE EDTA (PBS/EDTA) y ultracentrífuga (600.000 × g, 7 min a 4 °C).
  5. Deseche 900 μL de la capa superior para eliminar el quilomicron. Apile 900 μL de PBS/EDTA en plasma y ultracentrífuga (600.000 × g, 2,5 h a 4 °C).
  6. Deseche 900 μL de la capa superior para eliminar la lipoproteína de muy baja densidad (VLDL). Este paso es importante para prevenir la contaminación de LDL con otras fracciones de lipoproteínas.
  7. Añadir 540 μl de solución de KBr de 0,5 mg/mL para ajustar la densidad a d = 1,063, seguido de una mezcla suave con una pipeta y luego ultracentrífuga (600.000 x g, 2,5 h a 4 °C).
  8. Recoger 540 μL de la capa superior que contiene LDL. Una capa amarillo-naranja indica una separación exitosa de LDL9. Transferencia a una membrana de diálisis.
  9. Dialice la fracción de LDL tres veces contra 2 L de PBS / EDTA a 4 ° C en la oscuridad para eliminar KBr.
  10. Almacene LDL a 4 °C en la oscuridad antes de usarlo.

2. Preparación de pocillos recubiertos de poli-L-lisina o gelatina

  1. Prepare una solución de poli-L-lisina al 0,01%10 diluyendo una solución de poli-L-lisina al 0,1% con agua estéril, seguida de filtración con un filtro estéril de 0,2 μm. Conservar a 4 °C antes de usar.
  2. Agregue 152 μL/pocillo de solución de poli-L-lisina al 0,01% a cada pocillo de una placa de 12 pocillos e incube durante al menos 5 min.
  3. Retirar la solución y lavar una vez con 200 μL/pocillo de agua estéril y secar durante al menos 2 h.
  4. Almacenar a temperatura ambiente antes de usar en la preparación de NET.

3. Preparación de pocillos recubiertos de gelatina

  1. Prepare una solución de gelatina al 0,1% antes de usarla diluyendo la solución de gelatina al 2% con agua estéril.
  2. Añadir 152 μL/pocillo de la solución de gelatina al 0,1 % a cada pocillo de una placa de 12 pocillos e incubar durante al menos 5 min11.
  3. Retirar la solución y lavar una vez con 200 μL/pocillo de agua estéril y secar durante al menos 2 h.
  4. Almacenar a temperatura ambiente antes de usar.

4. Mantenimiento y preparación de células endoteliales aórticas humanas (HAEC)

  1. Cultive HAEC primarios en un matraz de cultivo no recubierto utilizando un medio completo que contenga suero fetal de ternera (FCS) al 2%, factor de crecimiento epidérmico 5 ng/ml, factor de crecimiento fibroblástico básico 10 ng/ml, factor de crecimiento similar a la insulina 20 ng/ml, factor de crecimiento endotelial vascular 0,5 ng/ml, ácido ascórbico 1 μg/ml, heparina 22,5 μg/ml y hidrocortisona 0,2 μg/ml. como se indica en las instrucciones de los fabricantes. Cambie el medio cada día alterno hasta que las células sean 70%-80% confluentes.
  2. Para la estimulación, siembre los HAEC en placas de 12 pocillos recubiertas de gelatina. Cambie el medio cada día alterno hasta que se alcance la confluencia. Realice el experimento entre los pasajes 4 y 7.

5. Preparación de células similares a neutrófilos derivadas de HL-60 seguidas de NET

  1. Mantener las células HL-60 con medio RPMI-1640 suplementado con 5 % de suero fetal bovino y 1 % de penicilina/estreptomicina, utilizando platos no tratados.
  2. Para la preparación de células similares a neutrófilos derivadas de HL-60, cultivar 2 × 106 células por 10 ml de células HL-60 durante 4 días en medio RPMI-1640 que contenga 2 μM de ácido transretinoico total (AtRA).

6. Preparación de NET con LDL

  1. Recolecte células HL-60 4 días después del tratamiento con AtRA de 2 μM. Después de la diferenciación de las células HL-60 en células similares a neutrófilos, las células se vuelven más pequeñas.
  2. Células centrífugas (220 × g, 4 min a 18-22 °C). Aspire el sobrenadante y lave las células con un volumen igual de RPMI-1640 sin suero.
  3. Centrifugar las células (220 × g, 4 min a 18-22 °C) y luego volver a suspender las células con RPMI-1640 sin suero.
  4. Cuente las células, luego vuelva a suspender las células a 2 × 106 células/ml en RPMI-1640 sin suero y siembre 0,5 ml de suspensión celular en los pocillos de una placa de 12 pocillos previamente recubierta con poli-L-lisina. Cultive durante al menos 30 min.
  5. Agregue 100 μL de RPMI-1640 sin suero con o sin 300 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) a la concentración final de 0 o 50 nM de PMA. Cultivo durante 30 min.
  6. Retire el medio y lave las células una vez con RPMI-1640 sin suero. Reemplace el medio con RPMI-1640 sin suero con o sin 20 μg / ml de LDL y luego cultive durante 2 h.
  7. Recoger el medio de cultivo y centrifugar (700 × g, 3 min a 18-22 °C) para eliminar los restos celulares.

7. Estimulación de HAEC con NET y LDL

  1. Reemplace el medio con 0,5 ml de medio de cultivo fresco. Cultive durante al menos 30 minutos antes de la estimulación.
  2. Añadir 167 μl del medio de cultivo que contiene NET y LDL (paso 6.7) y LDL a las placas de HAEC. Comprobar los cambios morfológicos en los AEAC inducidos tras la estimulación durante 12 h o más.

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Resultados

Después de la eliminación de los quilomicrones, seguida de fracciones de VLDL del plasma humano a través de la ultracentrifugación secuencial, el plasma humano se mezcló con una solución de KBr para ajustar la densidad a d = 1,063. En este paso, el precipitante restante no se disolvió completamente en la solución y se evitó la mezcla severa, que creó burbujas de gas, para mantener intacto el LDL. Después de la ultracentrifugación, el LDL se evaluó visualmente en la capa superior por su color amarillo anaranjado<...

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Discusión

Este protocolo describe la preparación de NET a partir de células dHL-60 inducidas por la coexistencia de LDL, que posteriormente se utilizan para analizar las respuestas de HAEC. La importancia de este protocolo es el uso de un medio fresco que contiene NET y LDL para la estimulación de las células, aunque muchos otros estudios utilizan una solución madre de NET congelada a -20 ° C. Como las lipoproteínas son complejos lípidos-proteicos, sus estructuras y características intactas se pi...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado en parte por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia, KAKENHI (números de subvención 23K10897 y 19K07069). Nos gustaría agradecer a Editage (www.editage.jp) por editar el idioma inglés.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,1% de poli-L-lisinaSigmaAldrichP8920-100ML
Plato de 10 cmCorning430591
Placas de cultivo de tejidos de 12 pocillosHalcón353043
Gelatina al 2%SigmaAldrichG1393-20ML
Tubo de 4 piezasHimacS404332A
Ácido retinoico totalmente transWako188-01113Se puede sustituir por cualquier proveedor
Tubo de diálisis de celurosaGrupo MISUMI Inc.0327-23-37-07 (UC18-32-100)Se puede sustituir por cualquier proveedor
EDTADojindo345-01865Se puede sustituir por cualquier proveedor
Kit de medio de crecimiento de células endoteliales 2PromoCellC-22111
Suero fetal bovinoGibco10270-106Se puede sustituir por cualquier proveedor
Heparina sódica (5,000 unidades/5 ml)Mochida Farmacéutica Co., Ltd.Se puede sustituir por cualquier proveedor
Centrífuga refrigerada de alta velocidadTOMYSRX-201Aceleración: 9, Desaceleración: 7
células endoteliales aórticas humanasLonzaCC-2535
KBrWako168-03475Se puede sustituir por cualquier proveedor
Software de microscopía KEYENCEKEYENCEAnalizador BZ-II
Micro UltracentrífugaHimacCS150GX
MicroscopiaOLIMPOCK40
MicroscopiaKEYENCEBZ-9000Para imágenes de lapso de tiempo (opcional)
Cámara de microscopíaNikonDS-Fi3
Software de cámara de microscopíaNikonDS-L4
Penicilina/EstreptomicinaGibco15140-122 100MLSe puede sustituir por cualquier proveedor
tampón de fosfato solución salina (&tiempos; 10)Disuelva 2,6 g de NaH2PO4· 2H2O, 29 g de Na2HPO4· 12H2O, 80 g de NaCl y 2,0 g de KCl en agua destilada y ajustar al volumen de 1 L. (Se puede sustituir por cualquier proveedor)
PMA (Phorbol 12-Miristato 13-Acetato)Wako162-23591Se puede sustituir por cualquier proveedor
Paquete de reactivosLonzaCC-5034(CC-5022: Solución salina tamponada HEPES, CC-5012: tripsina / EDTA, CC-5002: solución neutralizante de tripsina)
RotorHimacS100AT6-0242
RPMI-1640 (con rojo fenol)Wako189-02025Se puede sustituir por cualquier proveedor
RPMI-1640 (sin rojo fenol)Wako186-02155Se puede sustituir por cualquier proveedor
Matraz T-25Corning3275

Referencias

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