En este protocolo, se ilustra un ensayo combinado de amplificación de polimerasa recombinasa CRISPR / Cas12a para la detección del patógeno vegetal invasor , Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza tropical 4.
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Artículo de método
Ensayo combinado de amplificación de polimerasa recombinasa CRISPR/Cas12a para detectar Fusarium oxysporum f. sp. cubense Raza tropical 4
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Resumen
Resumen
La vigilancia regular y precisa es fundamental para el manejo eficiente de las enfermedades de las plantas. Puede indicar qué curso de acción es el más apropiado y si se requiere prevención, erradicación o ninguna acción. La vigilancia basada únicamente en la sintomatología en las plantas hospedadoras a menudo no es confiable debido a las similitudes en los síntomas causados por el estrés biótico y abiótico. Los métodos moleculares basados en laboratorio, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la (q)PCR cuantitativa, son los más utilizados y fiables para la detección de patógenos vegetales, pero dependen de equipos costosos y operadores cualificados. Aquí, describimos un protocolo que combina una extracción de ADN simplificada, amplificación de polimerasa recombinasa (RPA) y repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) / Cas12a (RPA-Cas12a) para la detección del patógeno invasivo, Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza tropical 4 (Foc TR4). La técnica proporciona una alternativa de detección simple de un solo tubo que es analíticamente robusta con una especificidad mejorada en comparación con los ensayos de detección molecular disponibles y elimina la necesidad de equipos de laboratorio costosos y sofisticados.
Introducción
La marchitez por Fusarium, causada por el patógeno fúngico transmitido por el suelo Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc), se considera mundialmente como uno de los patógenos transfronterizos de plantas más devastadores de la historia1. Una vez introducido en una nueva área, Foc permanece invisible hasta que las plantas infectadas desarrollan síntomas. Esto puede llevar meses, lo que permite que el hongo se establezca y se propague sin saberlo. Una vez establecido, es casi imposible de erradicar económicamente debido a la producción de clamidosporas resistentes y la naturaleza perenne de la producción de banano. La importancia de la prevención y la detección temprana, por lo tanto, es primordial para proteger a los productores vulnerables1. La epidemia actual de la enfermedad, causada por la raza tropical Foc 4 (TR4), requiere detección mediante vigilancia periódica para identificar plantas de banano sintomáticas en áreas de alto riesgo. Las limitaciones abióticas, como el estrés hídrico y ciertas deficiencias de nutrientes, producen un amarilleo externo, que es similar a los síntomas producidos por la infección por Foc TR4. Además, no se pueden distinguir los síntomas resultantes de la infección por diferentes razas Foc. Por lo tanto, la purificación en laboratorio y la posterior detección fenotípica y molecular son necesarias para una detección fiable de Foc TR42. Hay varios ensayos moleculares disponibles para la detección de Foc TR4, incluidos los ensayos de PCR, PCR cuantitativa (q) y amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) 3,4,5,6,7. Sin embargo, la mayoría de estos protocolos aún requieren habilidades y equipos costosos y especializados, que deben realizarse en entornos de laboratorio. La amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) se puede realizar isotérmicamente y, por lo tanto, elimina la necesidad de dicho equipo y puede considerarse para protocolos de detección en campo8.
Los sistemas de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)-Cas se han utilizado cada vez más para mejorar el diagnóstico molecular9. Estos sistemas se emplean porque son económicos, simples y no requieren el uso de instrumentación especial y, por lo tanto, pueden considerarse para la detección en el campo. Los diagnósticos basados en CRISPR generalmente implican la amplificación isotérmica de una secuencia objetivo, seguida del reconocimiento del objetivo a través de proteínas CRISPR-Cas y la escisión colateral de un colorante indicador fluorescente de ADN o ARN para indicar la presencia del objetivo10,11. En los sistemas CRISPR-Cas12a, específicamente, el ARN CRISPR (ARNcr) guía a Cas12a para reconocer y escindir objetivos de ácidos nucleicos. Este ARNcr se puede diseñar para dirigirse a una región específica de ADN o ARN de interés mediante la hibridación con una secuencia complementaria. Una vez unido, da como resultado que Cas12a escinda el objetivo con especificidad de un solo nucleótido, seguido de una escisión colateral de las moléculas reporteras12. Recientemente, se emplearon sistemas CRISPR-Cas12a para detectar varios patógenos fúngicos de plantas económicamente importantes 13,14,15,16,17,18,19,20.
En este protocolo se describe el desarrollo de una técnica de detección de un solo tubo, que combina una extracción simplificada de ADN, amplificación de polimerasa recombinasa (RPA) y tecnología CRISPR/Cas12a (RPA-Cas12a) para la detección de Foc TR4, que se visualizó tanto en un fluorómetro portátil como a simple vista bajo un transiluminador de luz azul de diodo emisor de luz (LED) de bajo costo21. El método se puede optimizar aún más para la detección en el campo para mejorar las estrategias de prevención y contención. También se puede utilizar un enfoque similar para diseñar ensayos de detección basados en Cas12a para otros patógenos de plantas.
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Protocolo
1. Extracción simplificada de ADN a partir de material vegetal
NOTA: Consulte la Figura 1 para obtener una descripción general.
- Realizar extracción de ADN.
- Transfiera 250 mg de cada pieza de pseudotallo sintomático a una bolsa de extracción separada (consulte la tabla de materiales).
- Agregue 2 ml de NaOH-PVP (Tabla de materiales) 0.5 M a las bolsas con material vegetal. Muela los recipientes infectados en una bolsa de extracción usando un molinillo manual como un mortero.
NOTA: Agregue 1-2 ml de NaOH-PVP suplementario de 0,5 M si es necesario para obtener suficiente extracto líquido de la bolsa. - Agregue 195 μL de 100 mM Tris-HCL (pH 8.0) (Tabla de materiales) en tubos de 1.5 mL.
- Pipetear 5 μL de extracto de la bolsa en el tubo de 1,5 mL con 195 μL de 100 mM Tris-HCL (pH 8,0), diluyendo el extracto 40 veces.
- Agite los tubos durante 15-30 s y guárdelos a -20 °C hasta su uso.
2. Síntesis y control de calidad del ARNcr
- Realice la transcripción.
- Usando el kit de transcripción de ARN (Tabla de materiales), agregue lo siguiente a un tubo de PCR de 0,2 ml: 1,5 μl de tampón de reacción T7 10x, 1,5 μl de cada dNTP, 1,5 μl de mezcla de ADN polimerasa T7, 1 μl de agua libre de nucleasas y 10 μl de ADN molde T7 de 100 μM para un volumen total de 20 μl.
- Incubar el tubo a 37 °C en un baño de agua o en una máquina de PCR durante al menos 4 h.
- Utilice un espectrofotómetro (Tabla de materiales) para determinar la cantidad de ARN transcrito. Diluir el ARN a 250 ng/μL (10 μg) en un volumen de 40 μL utilizando agua libre de nucleasas o tampón TE (Archivo complementario 1).
NOTA: El ARN transcrito se puede almacenar a -80 °C hasta continuar con los tratamientos con ADNasa y los pasos de limpieza.
- Realice el tratamiento con ADNasa y la limpieza de ARNcr.
NOTA: Realice todos los pasos a temperatura ambiente. Mantenga la enzima ARN y ADNasa I en hielo.- Tratar la muestra de ARN con la ADNasa I incluida en el kit de limpieza de ARN (Tabla de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante22.
- Limpie la muestra de ARN con el kit de limpieza de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante, siguiendo el Protocolo II22.
- Nanodrop el ARNcr limpio para determinar la cantidad y calidad presente. Diluir el ARN a 100 ng/μL con agua libre de nucleasas y almacenar a -80 °C hasta su uso.
- Caliente el ARNcr con colorante de carga de ARN (Tabla de materiales) a 70 °C durante 10 min en un baño de agua y someta el ARNcr a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% para visualizar el ARNcr sintetizado (Figura 2).
3. Reacción de un tubo de amplificación de polimerasa recombinasa (RPA)-Cas12a para la detección in vitro de Foc TR4
NOTA: Consulte la Figura 3 para obtener una descripción general.
- Prepare las mezclas de reacción RPA y Cas12a.
NOTA: Asegúrese de que estos pasos se lleven a cabo en un espacio libre de ADN sobre hielo, con los reactivos y materiales preenfriados. Limpie la superficie de trabajo y las pipetas con lejía y etanol al 70% antes del experimento. Consulte la Tabla 1 para obtener información sobre todos los oligonucleótidos utilizados en este estudio.- Preparar una mezcla de reacción Cas12a de 20 μL en un tubo separado de 0,5 mL (Tabla de materiales) con los siguientes volúmenes de reactivos: 2 μL de 10x NEBuffer r2.1 (50 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, 10 mM de MgCl2, 100 μg/mL de albúmina recombinante, pH 7,9), 0,4 μL de 10 μM de proteína LbCas12a, 0,6 μL de 100 ng/μL de ARNcr, 0,4 μL de reportero de 10 μM y 16,6 μL de agua desionizada.
NOTA: Las concentraciones finales de la proteína LbCas12a, el ARNcr y el reportero son de 200 nM, respectivamente. - Prepare una mezcla de reacción RPA de 9,5 μl en un tubo separado de 0,5 ml con los siguientes volúmenes de reactivos: 5 μl de tampón de reacción 2x (concentración final 1x según las directrices del fabricante), 1,6 μl de mezcla dNTP (concentración final 1,6 mM), 1 μl de 10x E-Mix básico (concentración final 1x según las directrices del fabricante), 0,5 μl de cada cebador RPA a 10 μM (concentración final 0,5 μM cada uno), 0,5 μl de mezcla de reacción de núcleo 20x (concentración final 1x según las pautas del fabricante) y 0,4 μl de agua desionizada.
- Coloque una tira de 8 tubos en una rejilla para tubos (Tabla de materiales) sobre hielo.
- Transfiera la mezcla de reacción Cas12a de 20 μl a la base del tubo.
- Transfiera la mezcla de reacción RPA de 9,5 μl a la tapa de la tira del tubo. Agregue 0,5 μL de MgOAc de 280 nM (concentración final de 14 nM) a la mezcla de reacción RPA en la tapa de la tira del tubo y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Agregue 0,5 μl de agua desionizada a la tapa del tubo de control sin plantilla (NTC) y ciérrela con cuidado para asegurarse de que las mezclas de reacción RPA y Cas12a no se combinen.
NOTA: Se incluye un control sin plantilla (NTC) para garantizar la fiabilidad de los resultados.
- Preparar una mezcla de reacción Cas12a de 20 μL en un tubo separado de 0,5 mL (Tabla de materiales) con los siguientes volúmenes de reactivos: 2 μL de 10x NEBuffer r2.1 (50 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, 10 mM de MgCl2, 100 μg/mL de albúmina recombinante, pH 7,9), 0,4 μL de 10 μM de proteína LbCas12a, 0,6 μL de 100 ng/μL de ARNcr, 0,4 μL de reportero de 10 μM y 16,6 μL de agua desionizada.
- Agregue ADN molde y comience la reacción.
- Agregue 0,5 μl de ADN molde a la mezcla de reacción RPA de 10 μl que contiene MgOAc en la tapa de la tira del tubo, excepto el NTC, con agua desionizada en lugar de ADN. Agregue siempre un ADN Foc TR4 de control positivo conocido en un pocillo para asegurarse de que el ensayo funcionó según lo previsto. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Cierre con cuidado las tapas de las tiras de tubos para asegurarse de que la reacción RPA y Cas12a no se mezcle.
- Encienda el fluorómetro portátil (Tabla de materiales) y cree un perfil de ejecución para el ensayo RPA-Cas12a (Archivo complementario 2). Abra el perfil de ejecución guardado y coloque la tira de tubo en el fluorómetro portátil para incubar durante 30 min a 37 °C.
NOTA: Tenga cuidado de no tocar la parte inferior de los tubos cuando manipule la tira de tubos; en su lugar, sostenga los bordes exteriores en el extremo superior izquierdo y derecho. - Retire la tira del tubo del fluorómetro portátil después de 30 min. Invierta los tubos seis veces para mezclar las reacciones RPA y Cas12a y gire hacia abajo en una mini centrífuga (consulte la tabla de materiales) durante 5 s.
- Vuelva a colocar la tira de tubo en el fluorómetro portátil e incube durante 30 minutos más a 37 °C utilizando el perfil de ejecución guardado.
- Visualiza los resultados.
- Interpretar las unidades de fluorescencia relativa (RFU) promedio medidas en el fluorómetro portátil (Archivo complementario 2 y manual de usuario23).
- Visualice los tubos bajo luz azul LED a una longitud de onda de excitación de 465 nm utilizando un transiluminador de luz azul (Archivo complementario 3). Captura imágenes con la cámara de un teléfono.
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Resultados
La detección exitosa de Foc TR4 a partir de material vegetal infectado mediante extracción de ADN simplificada seguida del ensayo combinado RPA-Cas12a cuando se realiza en el fluorómetro portátil Genie III se ilustra en la Figura 4A. Las muestras positivas muestran fluorescencia visible (carril 6-8), mientras que las muestras negativas muestran fluorescencia de punto final bajo (carril 1-5). Cuando los tubos de muestra se vieron bajo luz azul LED, las muestr...
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Discusión
La vigilancia regular es una estrategia importante para los esfuerzos efectivos de prevención y contención de Foc TR4 y otras plagas invasoras importantes. Los protocolos de detección que se pueden aplicar en el campo e identificar patógenos de manera rápida y precisa pueden acelerar la toma de decisiones y limitar los costos asociados con los esfuerzos de vigilancia. Para ello, el protocolo aquí presentado combinó una extracción de ADN simplificada, realizada directamente sobre material...
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses financieros o intelectuales contrapuestos.
Agradecimientos
Reconocemos la financiación de la Fundación Nacional de Investigación de Sudáfrica, Número de subvención: 138109, en el marco del programa de apoyo competitivo para investigadores no calificados. También reconocemos la financiación de la beca Marie Sklodowska-Curie del programa de investigación e innovación Marie Sklodowska-Curie de la Unión Europea en el marco del número de subvención del proyecto INDICANTS: 890856.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Proteína EnGen Lba Cas12a (Cfp1) | New England Biolabs | M0653T | |
| Diluyente EnGen Lba Cas12a | New England Biolabs | B0653A | |
| Tubos de PCR de Eppendorf | Merck | EP0030124332 | |
| Tubos de ensayo micro con bloqueo Eppendorf | Merck | EP0030121708 | |
| Bolsas de extracción universales | BIOREBA | 430100 | |
| GeneRuler 100 pb Escalera de ADN | Thermo Fischer Scientific | SM0241 / SM0242 | |
| Mini-6KO Genie Centrifugadora | OptiGene | OP-FUGE | |
| Genie III | OptiGene | https://www.optigene.co.uk/instruments/genie-iii/ | |
| Portatiras Genie | OptiGene | GBLOCK-01 / GBLOCK-02 / GBLOCK-03 | |
| Tiras Genie | OptiGene | OP-0008-50 / OP-0008-500 | |
| Kit de síntesis de ARN de alto rendimiento HiScribe T7 | New England Biolabs | E2040S | |
| Espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 UV/Vis | Thermo Fischer Scientific | https://caeonline.com/buy/spectrometers/nanodrop-nd-1000/293669253 | |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | |
| NEBuffer r2.1 | New England Biolabs | B6002S | |
| Polvo de polivinilipirrolidona (PVP) | Sigma-Aldrich | 9003-39-8 | |
| Kit de limpieza y concentrador de ARN 5 | Zymo Research | R1013 | |
| Tinte de carga de ARN | Thermo Fischer Scientific | R0641 | |
| Transiluminador SmartBlue Blue Light | Instrumentos Accuris | E4000-E | |
| Pellets de hidróxido de sodio (NaOH) | Merck, EMPARTA | K277 | |
| Tris (hidroximetil) aminometano | Merck | 77-86-1 | |
| Kit Básico de Líquido TwistAmp | TwistDx | TALQBAS01 |
Referencias
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