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Artículo de método

Medición de la permeabilidad de la barrera intestinal mediante la detección del flujo de trazadores fluorescentes a través de monocapas de colonoides humanos

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DOI:

10.3791/68857

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17 de octubre de 2025

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1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Children's Hospital Colorado, 2Department of Medicine, Mucosal Inflammation Program, Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Colorado, 3Rocky Mountain Veterans Hospital

En este artículo

Resumen

Describimos una técnica para medir la integridad de la barrera intestinal, mediante la cual la tasa de translocación de un azúcar marcado con fluorescencia de tamaño conocido refleja la permeabilidad de los colonoides intestinales humanos derivados de tejidos.

Resumen

La barrera intestinal es un sitio crítico de regulación entre los antígenos luminales y el sistema inmunológico del huésped, y su desregulación está implicada en múltiples enfermedades gastrointestinales. Los organoides intestinales pueden ser una herramienta útil para comprender y modelar las diferencias en la integridad de la barrera intestinal. Aquí, describimos un protocolo que utiliza colonoides humanos para cuantificar las diferencias funcionales de la barrera intestinal midiendo el flujo de trazadores fluorescentes a través de monocapas de organoides. Después de cultivar monocapas hasta la confluencia, agregamos un marcador fluorescente, como FITC-dextrano, a la cámara apical y detectamos su translocación a la cámara basolateral con el tiempo. El aumento de la translocación del marcador fluorescente refleja una barrera epitelial más permeable o más débil. Este protocolo es una plataforma adaptable que permite evaluar las diferencias funcionales de la barrera intestinal en múltiples afecciones en paralelo. Usando variaciones de este protocolo, se puede evaluar la permeabilidad transepitelial a moléculas de varios tamaños, formas y estructuras químicas, así como las diferencias de permeabilidad en el contexto de tratamientos aislados o cambios microambientales en los lados apical o basolateral de las células epiteliales. Esto permite una comprensión más profunda del mecanismo y el tratamiento de la interrupción de la barrera en los estados de enfermedad.

Introducción

La mucosa intestinal es una estructura compleja que juega un papel importante en la regulación del contacto entre los metabolitos, antígenos y microbios en la luz intestinal y el sistema inmunológico y la circulación entérica. Las células epiteliales intestinales son un componente clave de este sistema y, en condiciones saludables, forman una barrera altamente selectiva. El transporte a través del epitelio puede ocurrir a través de múltiples mecanismos: transporte activo o pasivo transcelular, poros paracelulares o vías de fuga reguladas por uniones estrechas y uniones adherentes. Si alguna de estas vías puede ser utilizada por una molécula para trasladarse a través del epitelio está determinado por la hidrofobicidad, el tamaño y la estructura química. Una vez atravesadas por el epitelio, estas moléculas pueden interactuar más fácilmente con las células inmunitarias de la mucosa y entrar en la circulación sanguínea o linfática del intestino 1,2 La alteración de la barrera intestinal es un sello distintivo de varias enfermedades inflamatorias gastrointestinales, como la enfermedad inflamatoria intestinal y la enfermedad celíaca 1,3,4,5,6,7. Se cree que esta barrera intestinal debilitada desempeña un papel en la fisiopatología de estos procesos patológicos a través de la translocación desregulada de antígenos patógenos, que luego puede crear una respuesta inflamatoria local o sistémica.

Existen varios protocolos establecidos para medir la barrera intestinal. Los estudios in vitro utilizan tradicionalmente líneas celulares cancerosas, como las células T84 o Caco-2, para medir la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y para cuantificar los componentes de la unión estrecha y la unión adherente8. Ex vivo, se pueden tomar mediciones de la corriente transepitelial utilizando cámaras de Ussing en biopsias o muestras de intestino resecado9. Los estudios in vivo generalmente implican administrar marcadores inertes por vía oral y luego medir la absorción de sangre u orina de estos marcadores10,11. Aunque estas técnicas han demostrado ser útiles en el estudio de la barrera intestinal, presentan varias limitaciones: las líneas celulares inmortales transformadas tienen inherentemente cambios metabólicos y citoesqueléticos que afectan la barrera intestinal de maneras mal definidas; el acceso a pacientes, muestras de pacientes u organismos modelo puede ser limitado; Los estudios in vivo son difíciles de controlar para detectar factores de confusión o sacar conclusiones a nivel molecular. Por lo tanto, aunque se ha informado evidencia de esta ruptura de la barrera en múltiples modelos de enfermedades, la comprensión del mecanismo de estos defectos de la barrera intestinal sigue siendo limitada, y nuestra capacidad para atacar y tratar este aspecto de la enfermedad gastrointestinal ha seguido siendo difícil de alcanzar.

Los organoides intestinales humanos ofrecen una capacidad única y emocionante para dilucidar la causa y el tratamiento de los defectos de la barrera intestinal. Los organoides intestinales humanos derivados de tejidos son cultivos celulares primarios derivados de células madre adultas ubicadas en la base de las criptas intestinales12. Estas células pueden aislarse de biopsias o muestras quirúrgicas y cultivarse para mantener los cambios genéticos y epigenéticos observados en los pacientes de los que se derivaron 13,14,15. Sirven como un modelo fisiológicamente más relevante que las líneas celulares inmortales tradicionales porque no tienen los cambios metabólicos de las líneas celulares cancerosas y se pueden diferenciar en los diversos tipos de células presentes en el epitelio intestinal maduro 16,17,18. Además, debido a que se pueden expandir in vitro, son más accesibles y útiles para estudios controlados del efecto celular de diversos tratamientos y condiciones de crecimiento en paralelo. Aunque también existen limitaciones inherentes a los modelos de organoides intestinales, sobre todo la ausencia de otros tipos de células no epiteliales y el contexto del sistema de todo el cuerpo, se ha demostrado que los organoides intestinales humanos proporcionan un modelo confiable para múltiples aspectos de la enfermedad gastrointestinal13.

Entre estos, se ha demostrado que los organoides intestinales modelan de cerca los defectos de la barrera intestinal, lo que demuestra los cambios esperados en la organización de las uniones estrechas y TEER en el contexto de las agresiones de barrera 19,20,21. Aquí, adaptamos una técnica para evaluar la integridad de la barrera en colonoides humanos, en la que se detecta el flujo de moléculas marcadas con fluorescencia a través de monocapas de organoides22. En este protocolo, los organoides se cultivan y maduran en monocapas bidimensionales polarizadas sobre membranas semipermeables. El ensayo implica la adición de un trazador fluorescente a la superficie apical de la monocapa epitelial, y su presencia en el lado opuesto se cuantifica con el tiempo. El aumento del flujo del marcador refleja un epitelio más permeable o con fugas. Este ensayo proporciona una lectura de barrera funcional, que puede ser aditiva a las evaluaciones de la estructura de las uniones estrechas y adherentes. Además, aunque las mediciones TEER se utilizan a menudo para proporcionar una evaluación básica de la integridad de la barrera, el ensayo de flujo descrito aquí se puede adaptar para detectar la permeabilidad de moléculas de varias clases, cargas y tamaños, caracterizando así la barrera con mucho más detalle. Para este propósito se pueden utilizar varios trazadores fluorescentes disponibles en el mercado. Además, mediante el uso de espectros fluorescentes no superpuestos, se puede evaluar simultáneamente la permeabilidad a múltiples trazadores. Además, la configuración monocapa de este ensayo permite evaluar la respuesta de barrera a las condiciones de crecimiento aplicadas específicamente a la superficie apical o basolateral de las células solamente. Con esto, es posible una evaluación controlada del efecto de las terapias, los cambios microambientales y las condiciones de cocultivo.

Se sabe que los defectos de la barrera intestinal desempeñan un papel patogénico importante en el desarrollo de varias enfermedades gastrointestinales, pero el término "intestino permeable" se usa cada vez más en los medios populares sin precisión23, y los esfuerzos para atacar la barrera intestinal defectuosa han tenido un éxito limitado. Esto destaca la necesidad de modelos mejorados para evaluar y caracterizar la barrera intestinal. El sistema descrito utiliza monocapas de organoides intestinales derivados de tejido humano fisiológico para evaluar la integridad de la barrera funcional en condiciones controladas.

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Protocolo

Todas las muestras fueron adquiridas y utilizadas de acuerdo con un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Colorado, número de protocolo 14-2012.

NOTA: Todos los procedimientos de los pasos 1 a 3 deben realizarse en un gabinete de bioseguridad estéril con técnica estéril. En la Figura 1 se presenta un esquema del protocolo.

1. Establecimiento de colonoides humanos a partir de cultivos congelados

NOTA: Asegúrese de que todos los materiales estén listos en el gabinete de bioseguridad antes de descongelar las células para minimizar la exposición de los organoides descongelados al medio de congelación. El protocolo comienza con colonoides humanos derivados de tejidos criopreservados. Los protocolos para derivar y criopreservar colonoides humanos se han descrito previamente24.

  1. Preparación del medio del tallo organoide intestinal humano
    1. Preparar medios acondicionados Wnt-3A/Noggin/R-Spondin 3 (L-WRN) de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente 25,26.
    2. Complemente los medios L-WRN con los siguientes factores de crecimiento: factor de crecimiento epidérmico [50 ng/mL], nicotinamida [10 mM], A83-01 [500 nM], SB202190 [10 μM], CHIR99021 [3 μM], tiazovivina [4 μM], SB431542 [4 μM], gastrina I [10 nM].
    3. Mezcle los medios L-WRN suplementados 1:1 con medios organoides intestinales comerciales.
    4. Justo antes de su uso, suplementar con Y-27632 [10 μM].
      NOTA: La composición óptima del medio del tallo organoide intestinal puede variar según el laboratorio y la línea colonoide. También puede ser posible el uso de medios L-WRN suplementados solos o el uso de medios organoides intestinales comerciales solos. El uso de este protocolo de partes iguales de medios acondicionados L-WRN y medios comerciales es más resistente a la variabilidad de lote a lote en comparación con el uso de medios acondicionados solos y es más rentable en comparación con el uso de medios comerciales solos.
  2. Preparación del medio de diferenciación
    1. Suplementar DMEM/F12 con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina y 2 mM de L-alanil-L-glutamina dipéptido.
    2. Mezclar DMEM/F12 1:1 suplementado con medio de tallo organoide intestinal del paso 1.1
  3. Preparación de la matriz extracelular (ECM)
    1. Descongele la ECM durante la noche en hielo, luego prepare alícuotas de 100 μL.
      NOTA: Las alícuotas se pueden volver a congelar a -20 °C. Consulte las instrucciones del fabricante para obtener más detalles.
    2. Incube las alícuotas en hielo hasta el momento de las celdas.
  4. Descongelación y recubrimiento de organoides
    1. Descongele el contenido de criovial en un baño de agua a 37 °C, asegurándose de que el vial permanezca sumergido, pero la tapa esté por encima del agua, hasta que se descongele.
    2. Transfiera el contenido del vial a un tubo cónico de 15 ml que contenga 13 ml de medio DMEM/F12 suplementado con hielo frío (a partir del paso 1.2.1).
    3. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C.
    4. Aspire el sobrenadante, dejando aproximadamente 1 ml de volumen residual por encima del sedimento celular.
    5. Coloque el tubo sobre hielo. Añadir 1 ml de DMEM/F12 suplementado con frío helado (a partir del paso 1.2.1) y pipetear la suspensión de 10 a 15 veces para volver a suspender el gránulo.
    6. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C.
    7. Retire el sobrenadante con una pipeta, dejando la menor cantidad posible de medios de lavado residuales sobre el sedimento celular.
    8. Agregue 100 μL de ECM descongelado al gránulo. Vuelva a suspender completamente, asegurándose de que los organoides se dispersen uniformemente sin grumos. Pipetea lentamente para evitar introducir burbujas de aire.
    9. Placa ECM pipeteando aproximadamente 10 cúpulas o gotas tridimensionales de ECM, aproximadamente 10 μL cada una, en un pocillo de una placa de 6 pocillos.
    10. Invierta la placa rápidamente e incube a 37 °C durante 5-10 min o hasta que las cúpulas se solidifiquen.
    11. Una vez que las cúpulas estén colocadas, agregue 2 ml de medios de tallo organoide intestinal (del paso 1.1) al pozo.
    12. Incubar a 37 °C, en una incubadora humidificada con 5% de CO2. Reemplace el medio cada 2 días.
    13. Continúe con el paso 2 una vez que los organoides estén ocupando más del 75% del área del domo ECM o estén acumulando desechos centrales.

2. Paso y expansión de colonoides humanos

  1. Para cada pozo, aspire los medios de crecimiento de los pocillos sin interrumpir las cúpulas de ECM.
  2. Lave las cúpulas suavemente con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada, luego retire PBS.
  3. Agregue 1 ml de tripsina helada a cada pocillo. Utilice una pipeta para romper las cúpulas de ECM pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Pipetea la mezcla de 10 a 15 veces para disociar completamente la ECM.
  4. Incubar la placa a 37 °C durante 3-5 min.
  5. Agregue 1 ml de DMEM / F12 suplementado con hielo frío (del paso 1.2.1) al pocillo para neutralizar la tripsina. Pipetea la mezcla vigorosamente 20-30 veces hasta que las células se disocien en grupos de 2-3 células cada uno.
  6. Transfiera la suspensión celular a un cónico de 15 ml.
  7. Use 1 ml adicional de DMEM/F12 suplementado (del paso 1.2.1) para lavar bien y agregue la solución de lavado al cónico de 15 ml.
  8. Agregue DMEM / F12 suplementado (desde el paso 1.2.1) para alcanzar un volumen total de 13 ml en el cónico de 15 ml.
  9. Continúe con los pasos 1.4.3-1.4.12 del paso 1 utilizando una cantidad adecuada de ECM para expandirse a pozos adicionales.
    NOTA: Un pocillo confluente de organoides en 100 μL de ECM generalmente se puede pasar a 2-3 pocillos (200-300 μL de ECM). Un pocillo confluente de organoides es suficiente para aproximadamente 3-6 monocapas en el paso 3.

3. Generación de monocapas de colonoides humanos

  1. Insertos de cultivo celular con recubrimiento de colágeno
    1. Coloque insertos de cultivo celular de poliestireno (tamaño de poro de 0,4 μm) en una placa de 24 pocillos y agregue 100 μL de solución de recubrimiento de colágeno a la cámara apical de cada inserto.
    2. Selle la placa con una película de sellado para evitar la evaporación.
    3. Incubar a 4 °C durante 4-24 h.
      NOTA: No hay diferencia en los resultados dentro de este tiempo de incubación, pero se puede elegir un tiempo de incubación más corto o más largo para adaptarse a un punto de pausa conveniente.
  2. Recubrimiento de monocapas de organoides
    1. Siga los pasos 2.1-2.5 para disociar los organoides.
    2. Pasar la suspensión celular a través de un colador celular de 70 μm en un tubo cónico de 50 ml.
    3. Enjuague los pocillos con 1 ml de DMEM/F12 suplementado (a partir del paso 1.2.1). Recoja este medio de lavado y páselo por el filtro celular.
    4. Lave el colador celular con DMEM/F12 suplementado (a partir del paso 1.2.1) hasta que el volumen total en el tubo cónico de 50 ml alcance los 15 ml.
    5. Transfiera el filtrado a un cónico de 15 ml.
    6. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C.
    7. Aspire el sobrenadante, dejando 1 ml por encima del sedimento.
    8. Agregue 1 ml adicional de medio DMEM/F12 suplementado (del paso 1.2.1) y vuelva a suspender.
    9. Examine la suspensión bajo un microscopio para confirmar la disociación completa. Si es necesario, pipetee las células vigorosamente hasta que en su mayoría sean células individuales.
    10. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante con una pipeta, dejando la menor cantidad posible de medios de lavado residuales sobre el sedimento celular.
    11. Vuelva a suspender en un pequeño volumen (200-1000 μL) de medio de tallo organoide intestinal (a partir del paso 1.1). Mantener en hielo.
    12. Tome una alícuota de la suspensión celular para usar para contar células viables utilizando el método preferido. Utilice el recuento de células viables para determinar el volumen de suspensión celular necesario para colocar 100.000 células viables por inserto.
    13. Aspire la solución de recubrimiento de colágeno de cada inserto sin tocar la membrana del inserto.
    14. Añadir el volumen adecuado de medios madre organoides intestinales (desde el paso 1.1) a la cámara apical de cada inserto para llevar el volumen final a 200 μL una vez añadida la suspensión celular.
      NOTA: Si se prefiere, la suspensión celular en el paso 3.2.12 se puede ajustar a una concentración final de 100,000 células/200 μL, luego se pueden sembrar 200 μL en la cámara apical. Sin embargo, si no se utiliza toda la suspensión celular para el recubrimiento monocapa, esto puede provocar un desperdicio excesivo de medios.
    15. Agregue el volumen apropiado de suspensión celular a la cámara apical.
    16. Agregue 500-1000 μL de medios de tallo organoide intestinal a la cámara basolateral.
      NOTA: 500 μL es suficiente para los colonoides típicos. Si las células son más activas metabólicamente o sensibles a la acumulación de productos de desecho, el uso de un volumen mayor en la cámara basolateral puede ser útil para mantener el crecimiento.
    17. Repita para todos los insertos / pocillos.
    18. Incubar a 37 °C, en una incubadora humidificada con 5% de CO2.
    19. Reemplace el medio una vez por semana.
      NOTA: Los tratamientos de interés se pueden aplicar a las cámaras apicales y / o basolaterales de los insertos en cualquier momento antes o después de la siembra.

4. Medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y la maduración de la monocapa

  1. Medir la resistencia
    1. Use un voltímetro epitelial / ohmio en la configuración de ohmios. Limpie la sonda limpiándola con una toallita de trabajo empapada en etanol al 70%. Coloque el brazo más largo del electrodo en el compartimento basolateral y el brazo más corto en el compartimento apical del inserto. Registrar la medición.
      NOTA: Si las mediciones de TEER también son un punto final de interés, también tome medidas de resistencia de un inserto recubierto de colágeno sin células como fondo. Luego, TEER se calcula como (resistencia - resistencia de inserción de fondo) x área de superficie de la inserción. El área de superficie del inserto en este protocolo es de 0,33 cm2. Este cálculo dará TEER en ohmios · cm2. Si usa un voltímetro epitelial / ohmio diferente al que se indica en la Tabla de materiales, use las instrucciones del fabricante para usar el medidor para medir la resistencia.
    2. Repita diariamente hasta que las mediciones se estabilicen.
      NOTA: La meseta generalmente ocurre después de 2 a 3 semanas con TEER superior a 200 ohmios · cm2, pero varía según la línea colonoide y las condiciones de crecimiento.
  2. Una vez que la resistencia se haya estabilizado, inicie la maduración de los organoides reemplazando los medios del tallo con medios de diferenciación (desde el paso 1.2).
  3. Continúe con las mediciones diarias de TEER. Espere un aumento en TEER y una segunda meseta.
    NOTA: La segunda meseta generalmente ocurre alrededor de los 7 días con TEER de 1500-2500 ohm · cm2, pero esto varía según la línea colonoide y las condiciones de crecimiento.
  4. Una vez que las mediciones de TEER se hayan estabilizado por segunda vez, continúe con el paso 5.

5. Ensayo de fundente FITC-dextrano

NOTA: Este protocolo utiliza FITC-dextrano 4 kDa (radio de Stokes 14 Å). Sin embargo, dependiendo de las necesidades experimentales, se pueden utilizar trazadores fluorescentes de diferentes tamaños, cargas y fluoróforos22. También se pueden usar múltiples trazadores al mismo tiempo, en cuyo caso, se deben confirmar los espectros de excitación y fluorescencia de emisión no superpuestos. Se sugiere que los pasos 5.1-5.3 se realicen en una cabina de calentamiento (incubadora no humidificada y sin CO2 ) a 37 °C. Si no se dispone de esto, los reactivos deben calentarse a 37 °C antes de su uso, y las células, los tampones y las muestras recogidas deben mantenerse a 37 °C durante los tiempos de incubación.

  1. Preparación de reactivos
    1. Prepare la solución salina tamponada (HBSS) de Hank con HEPES 10 mM y ajuste el pH a 7,4. Caliente a 37 °C.
      NOTA: Si es necesario, prepare HBSS + HEPES con tratamientos de interés. Prepare lo suficiente para 80 μl/pocillo en la cámara apical y 1 ml/pocillo en la cámara basolateral.
    2. Vierta aproximadamente 50 ml de HBSS + HEPES tibio en un vaso de precipitados pequeño para enjuagar los insertos. Tenga un vaso de precipitados más grande cerca para los desechos líquidos.
    3. Descongele completamente FITC-dextrano 4 kDa. Prepare una solución de 1,25 mg/ml en HBSS con HEPES. Prepare un volumen adecuado de solución de FITC-dextrano para asignar 80 μL por pocillo y 1 μL para la curva estándar.
      NOTA: La concentración inicial se puede ajustar en función del tamaño y la permeabilidad esperada del trazador. Por ejemplo, se pueden agregar trazadores más pequeños o más permeables a una concentración más baja para conservar los reactivos. Si es necesario aplicar tratamientos a la cámara apical, prepare la solución de FITC-dextrano en HBSS+HEPES tratados adecuadamente.
  2. Aplicación de FITC-dextrano a monocapas
    1. Prepare una placa nueva de 24 pocillos agregando 1 ml de HBSS+HEPES (con tratamiento si lo desea) en los pocillos apropiados.
    2. Lave las monocapas de organoides agarrando el inserto con fórceps, sacándolo del pozo, sumergiéndolo en el vaso de precipitados que contiene HBSS+HEPES tibio (desde el paso 5.1.2) para llenar la cámara apical, luego invirtiéndolo sobre el vaso de precipitados de desecho para vaciar la solución de lavado.
    3. Repita este lavado 2 veces más.
    4. Coloque el inserto en el pocillo apropiado de la placa nueva preparada en el paso 5.2.1.
    5. Pipetee suavemente 80 μl de solución de FITC-dextrano en la cámara apical. Pipetear en el lateral del inserto para evitar perturbar la monocapa.
    6. Repita el paso 5.2.5 para todas las monocapas.
    7. Agregue HBSS o PBS a cualquier pozo vacío para mantener la humedad.
  3. Recolección de muestras de fundente
    1. Inmediatamente después del paso 5.2.7, recoja 70 μl de la cámara basolateral de cada pocillo en un pocillo de una placa plana de 96 pocillos negra de fondo transparente y manténgala protegida de la luz a 37 °C. Este será el punto de tiempo 0.
    2. Incubar la placa, protegida de la luz, a 37 °C.
    3. Cada 30 min durante 2 h, mezcle el tampón en el pocillo basolateral y, a continuación, recoja 70 μl adicionales en pocillos vacíos de la placa de 96 pocillos de fondo transparente del paso 5.3.1.
  4. Preparación de la curva estándar
    1. Agregue 1 μL de la solución de FITC-dextrano reservada (1,25 mg/mL; paso 5.1.3) en 999 μL de HBSS+HEPES. Esta será la dilución de 1:1000 o 1,25 μg/ml para la curva estándar.
    2. Diluya en serie esta solución 1:1 tomando 150 μL de la solución y añadiéndola a 150 μL de HBSS+HEPES, luego mezclando bien. Repita esto en serie diez veces más para un total de una dilución de 12 pasos.
      NOTA: Esto creará una curva estándar de: 1250, 625, 312.5, 156.25, 78.13, 39.06, 19.53, 9.77, 4.88, 2.44, 1.22 y 0.61 ng/mL. Dependiendo de la permeabilidad de las líneas celulares, la curva estándar puede necesitar estar más o menos concentrada. La primera vez que se ejecute el experimento, reserve una solución adicional de FITC-dextrano 1,25 mg/ml en caso de que sea necesario rehacer la curva estándar a una concentración diferente.
    3. Pipetee 70 μL de cada dilución de la curva estándar en pocillos vacíos de la placa inferior transparente de 96 pocillos de los pasos 5.3.1 y 5.3.3. Repita para la segunda réplica.
  5. Mida la fluorescencia en un lector de placas fluorescentes con los siguientes ajustes: excitación 490 nm, emisión a 520 nm, lectura desde la parte inferior de la placa, con una ganancia de 100 y altura de lectura de 7 mm.
    NOTA: Ajuste las longitudes de onda de excitación/emisión según corresponda para el fluoróforo de su elección.
  6. Análisis de datos
    1. Grafique la curva estándar con concentración en el eje x y fluorescencia en el eje y. Utilice esto para determinar la ecuación de regresión lineal.
    2. Utilice esta ecuación de regresión lineal y las lecturas fluorescentes de las muestras para calcular la concentración de FITC-dextrano en cada punto de tiempo para cada muestra.
    3. Grafique la concentración a lo largo del tiempo para cada muestra y calcule la pendiente de una ecuación de regresión lineal, que representa microgramos/min (μg/min). Divida esto por el área de superficie del inserto de cultivo celular (0,33 cm) para determinar la tasa de flujo como microgramos por minuto por centímetro cuadrado (μg / min / cm2).

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Resultados

Utilizando este protocolo, se analizó la permeabilidad de colonoides humanos sanos en presencia y ausencia de señalización inflamatoria. Se ha demostrado previamente que la adición de una mezcla de citocinas inflamatorias, denominada citomix, que incluye IFNγ, TNFα e IL-1β (cada una a 10 ng/ml), induce la disfunción de la barrera intestinal medida por TEER en modelos de células epiteliales intestinales20,27. Nuestro objetivo fue determinar si esta disfunción de l...

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Discusión

Este es un protocolo para evaluar la barrera intestinal en el modelo fisiológicamente representativo de monocapas de colonoides humanos. El ensayo de flujo de trazador fluorescente descrito aquí proporciona información sobre la integridad funcional de la barrera más allá de lo que se obtiene con otros tipos de ensayos de barrera, como TEER, mediciones de cámara de Ussing o evaluación de la expresión de proteínas de unión estrecha. Además, el uso de modelos de organoides intestinales deri...

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Divulgaciones

No hay divulgaciones ni conflictos de intereses.

Agradecimientos

El Dr. Sean Colgan está financiado por las subvenciones de los NIH DK1047893, DK50189, DK095491, DK103639 y VA Merit BX002182.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de centrífuga cónicos de 15 mlCelltreat229411
Vial criogénico roscado interno de 2 mlCorning430488
Tubos de centrífuga cónicos de 50 mlCelltreat229421
placa de 6 pocillos, tratada con cultivo de tejidosCelltreat229106
70 μ Filtro de células MHalcón352350
Placa inferior negra/transparente de 96 pocillosThermo Scientific165305
A83-01 R& D2939
Lector de placas BioTek SynergyAgilentSinergia H1
Contador de celdas Cellometer Auto T4 BrightfieldNexcelcomCMT-AT4P
Cámaras de recuento de celdas con celómetroNexcelcomNC1531583
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046-5MG
Solución de recubrimiento de colágenoAplicaciones celulares125-50
DMEM/F-12Gibco11330057
DMSOSigma-AldrichD2650-100ML
Etanol 100%Fisher ScientificA4094
EVOM2 Voltohm Meter con electrodo Stx2Instrumentos de precisión del mundoNC9792051
Suero fetal bovino (FBS)CytivaSH30396.03HI
Puntas de pipeta de filtroFisher Scientific02-707-000, 02-707-002, 02-707-006, 02-707-008
Isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano, 4kDaSigma-Aldrich46944
Gastrin I (Humano)R& D3006
GlutaMAX Fisher Scientific35050061200 mM de dipéptido de L-alanil-L-glutamina
Solución salina tamponada Hanks 10xThermo Scientific14065056
HEPES 1MThermo Scientific15630080
Interferón gamma recombinante humanoBioLeyenda575308
Interleucina 1 beta recombinante humanaTermocientífico200-01B-500UG
IntestiCult Medio de crecimiento de organoides intestinales (humano)Tecnologías STEMCELL06010 Medios organoides intestinales comerciales
Microscopio invertido en vivoOlimpoIX85
MatrigelCorning354234Matriz extracelular (ECM)
Incubadora microbiológicaFisher Scientific151030515
Placa multipocillo para cultivo en suspensión, 24 pocillosGreiner Bio-one662102
NicotinamidaR& D4106
ParafilmMillipore SigmaHS234526BPelícula de sellado
Pipetas Pasteur (vidrio de borosilicato)Fisher Scientific13-678-20B
PBS Gibco10010-023
Penicilina Estreptomicina (10,000 U/mL)Gibco15140122
Factor de crecimiento epidérmico de moouse recombinanteR& D2028-EG
Centrífuga refrigeradaBeckman CoulterBE-AX15R
SB202190 R& D1264
TiazovivinaR& D3845
Inserto de cultivo celular ThinCert para placa de 24 pocillos, 0,4 μ mGreiner Bio-one662641
Tripsina-EDTA (0,25%)Fisher Scientific25200114
Factor de necrosis tumoral alfa recombinante humanoR& D10291-TA-100
Y-27632 diclorhidratoTocrisTB1254-GMP

Referencias

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