Describimos métodos para cultivar folículos ováricos en un novedoso molde de agarosa sin andamios que complementan la gametogénesis in vitro .
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Producción y uso de moldes de agarosa personalizables para cultivo de folículos ováricos de ratón sin andamios
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El folículo ovárico es la unidad funcional del ovario que produce hormonas y gametos necesarios para mantener la función reproductiva y la salud femeninas. La capacidad de recapitular la foliculogénesis, la ovulación y la luteinización in vitro tiene una amplia utilidad básica, traslacional y clínica. Los sistemas de crecimiento de folículos in vitro más avanzados mantienen la arquitectura tridimensional (3D) del folículo, que es crucial para el desarrollo de ovocitos de metafase II meióticamente competentes en humanos. Recientemente, se desarrolló y validó un método sin andamios para el crecimiento de folículos folículos in vitro de folículos secundarios multicapa de ratón. Para ello, se utilizaron moldes impresos en 3D personalizados para micromodelar la agarosa con micropocillos que se adaptan a la expansión volumétrica de los folículos. Los folículos cultivados en este entorno libre de andamios mostraron una producción hormonal y una viabilidad comparables en relación con los sistemas de crecimiento de folículos in vitro encapsulados (eIVFG) bien establecidos a base de alginato. Es importante destacar que los micropocillos de agarosa son un método escalable, menos exigente técnicamente y muestran mejores tasas de crecimiento de folículos y ovulación en relación con la eIVFG. Esta metodología produce moldes personalizables que son biocompatibles con el ovocito, una célula altamente sensible a lixiviados específicos del material y otros contaminantes ambientales. Además, los folículos de este sistema se cultivan en el mismo plano focal, lo que permite obtener imágenes y análisis de lapso de tiempo en tiempo real. Para aumentar la accesibilidad de este nuevo enfoque, este artículo detalla los métodos necesarios para diseñar e imprimir en 3D moldes maestros, crear moldes de silicona para placas de 24 o 96 pocillos y cultivar folículos ováricos secundarios multicapa aislados en los moldes de agarosa. Esta configuración también se puede integrar con un sistema de imágenes de lapso de tiempo rentable, lo que permite el análisis morfocinético. Además, los moldes pueden incluirse en parafina para análisis histológicos posteriores. En general, este método fácil de usar es una herramienta versátil para el cultivo de folículos y se puede personalizar aún más para promover la diferenciación y maduración de las células germinales dentro del contexto del folículo para mantener una gametogénesis in vitro completa.
Introducción
El ovocito, o gameto femenino, aporta la mayor parte del citoplasma y la mitad del material genético al embrión en la fecundación, lo cual es esencial para el desarrollo de la siguiente generación. La ovogénesis comienza durante el desarrollo embrionario cuando las células germinales primordiales entran en meiosis y se detienen en la profase I. Estos ovocitos residen dentro de los folículos primordiales y constituyen la reserva ovárica, un conjunto finito y no renovable del que se reclutan progresivamente. Los folículos se desarrollan en un proceso conocido como foliculogénesis, con el objetivo de producir finalmente un gameto maduro ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los procedimientos con animales relacionados con este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Northwestern y se realizaron de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Adapte el diseño del molde maestro
Esta sección describe los primeros pasos realizados durante la fase de diseño (Figura 1), donde se introducen micropocillos personalizados en un diseño asistido por computadora....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Para determinar si la supervivencia y el crecimiento de los folículos estaban respaldados por esta novedosa tecnología como se describe en la sección 7 del protocolo, los folículos de los mismos ratones se aislaron y cultivaron en paralelo en micromoldes de agarosa o se encapsularon en alginato al 0,5%. Las imágenes representativas de los folículos de cada dos días de cultivo demostraron el desarrollo, el crecimiento y la formación normales de una cavidad antral durante todo el período d.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La gametogénesis y la maduración in vitro son tecnologías clave para la comprensión fundamental de la biología de los ovocitos, con aplicaciones potenciales en tecnología de reproducción asistida, preservación de la fertilidad y conservación de especies. Los métodos para apoyar la IVG a menudo se basan en el cocultivo con células somáticas para crear ovarios reconstruidos30. La importancia de estas células de soporte es bien conocida in vivo, don.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Infantil y Desarrollo Humano (R01HD105752 a F.E.D. y T32HD094699 a E.J.Z) y el programa SenNet del Fondo Común de los NIH (U54AG075932 y UH3CA268105 a F.E.D.) y la Beca de la Fundación Bill y Melinda Gates (INV-003385 a F.E.D.). Bajo las condiciones de subvención de la Fundación Bill y Melinda Gates, ya se ha asignado una Licencia Genérica Creative Commons Attribution 4.0 a la versión del Manuscrito Aceptado por el Autor que podría surgir de esta presentación.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Materiales y Químicos | |||
| Tubos de centrifugación de poliestireno de 50 mL | Globe Scientific | 941-11017-CS | |
| Tubos microcentrífugas de 1,5 mL | Fisher Scientific | MCT-150 | Para congelar y almacenar medios |
| Plato de 100 mm, sin tratar | Fisher Scientific | 08-757-100D | Para fabricar y almacenar micromoldes de agarosa |
| 100% etanol | Mercedes Scientific | 1200 | Procesamiento de tejidos |
| 1000 y micro; L Puntas de pipeta, baja retención | MIDSCI | PR-1000BK | Consejos culturales |
| 200 y micro; L Puntas de pipeta, baja retención | MIDSCI | PR-200BK | Consejos culturales |
| Placa de 24 pozos | Corning | 353047 | Cultura |
| Antenas parabólicas de 35 mm | Halcón | 351008 | Aislar ovarios e incubar en medios enyzmáticos |
| 95% etanol | Mercedes Scientific | 1210 | Procesamiento de tejidos |
| Agarose | Hoefer | GR140 | Micromoldes |
| Aceite mineral BioXtra, aceite ligero, adecuado para el cultivo celular de embriones de ratón | Sigma-Aldrich | M5310-500ML | Utilizado como agente desmoldeante biocompatible |
| Albúmina sérica bovina | MP Biomedicina | 103700 | Medios de Crecimiento |
| Plumeras de limpieza, 10 oz., paquete de 6 | Office Depot | 110284 | Aire comprimido |
| Resina V4 transparente 1 L | Formlabs, Inc | RS-F2-GPCL-04 | Resina para impresión 3D |
| Vaso de precipitados de plástico reutilizable Corning de 100 mL, polipropileno graduado | Corning | 1000P-100 | Vaso para mezclar componentes de silicona y nbsp; |
| DNAse I | Qiagen | 79254 | Medios enzimáticos |
| Ecoflex 00-45 Casi despejado | Smooth-On, Inc | B09M8Y9PTV | Material de silicona |
| F-12 + GlutaMAX | Gibco | 31765-035 | Medios de Crecimiento |
| Fetino bovino fetal | Sigma | F-3385 | Medios de Crecimiento |
| Suero fetal bovino (FBS) | Suero Pico | PS-FB2 | Disección de medios, medios enzimáticos, etc; Medios de Mantenimiento y Medios Medios de Maduración |
| Fisherbrand Bolsas de esterilización | Fisher Scientific | 01-812-50 | Bolsas de esterilización |
| Hormona folículo-estimulante (FSH) | EMD Serono, Inc. | Solo Gonal-F Rx | Medios de Crecimiento y Medios de Crecimiento Medios de Maduración |
| Gibco y nbsp; DPBS, calcio, magnesio | Fisher Scientific | 14-040-182 | Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco |
| Gonadotropina coriónica humana (hCG) | Sigma Aldrich | C1063-1VL | Medios de Maduración |
| Insulina-transferrina-selenio (ITS) | ThermoFisher | 41400045 | Medios de Crecimiento |
| Sondas moleculares de Invitrogen Rhodamine Phalloidin | Fisher Scientific | R415 | Mancha del citoesqueleto de huevo |
| Platos de FIV | Termo Científica | 150260 | Aislar, seleccionar y preequilibrar los folículos |
| Leibovit'z 15 (L15) | Gibco | 11415-064 | Disección de medios y medios de disección Medios enzimáticos |
| Liberase | Sigma Aldrich | 5401119001 | Medios enzimáticos |
| ¿MEM? + GlutaMAX | Gibco | 32561-037 | Medios de Mantenimiento, Medios de Crecimiento y Medios de Crecimiento Medios de Maduración |
| Factor de crecimiento epidérmico del ratón (EGF) | BD Biociencias | 354010 | Medios de Maduración |
| Desecador de diseño clásico de policarbonato transparente Nalgene | Termo Científica | 5311-0250 | Desecador de vacío |
| Parafina | Fisher Scientific | 83-30 | Procesamiento de tejidos y Incrustación |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140-122 | Medios de disección, medios enzimáticos y Medios de Mantenimiento |
| Puntas para stripper | Origio | MXL3-200 | Cultura |
| Medio de montaje antifade VECTASHIELD PLUS con DAPI | Laboratorios Vector | H-2000 | Tinción del núcleo del huevo |
| Xileno | Mercedes Scientific | 9840 | Procesamiento de tejidos |
| α-Tubulina (11H10) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugado) | Tecnología de señalización celular | 5063S | Tinción de huevo con tubulina |
| Equipo | |||
| Plataforma de Construcción 2 | Formlabs, Inc | BP-F3-02-01 | Componente de impresora 3D |
| Dino-Lite Edge AF4915ZTL, USB 2.0 | Dino-Lite | AF4915ZTL | Imager para configuración en timelapse |
| Formulario 3 Tanque de resina V2.1 | Formlabs, Inc | RT-F3-02-01 | Componente de impresora 3D |
| Impresora 3D Formulario 3B+ | Formlabs, Inc | F3B-P-Impresora | Impresora 3D de estereolitografía (SLA) de Formlabs |
| Cura de la forma | Formlabs, Inc | FH-CU-01 | Plataforma de curado |
| Lavado de forma | Formlabs, Inc | FH-WA-01 | Plataforma de lavado |
| Pulverizador con vaporizador de bomba | VWR | 0309-3005 | Para aplicar el agente desmoldeante |
| Enfocador/condensador de luz para la serie Edge (excluyendo los modelos T5 y T8) | Dino-Lite | N3C-R | Componente de imagen para la configuración en timelapse |
| Paquete Soporte de Montura que combina el rack RK-10 y la extensión de brazo RK-10-EX | Dino-Lite | RK-10A | Componente de imagen para la configuración en timelapse |
| Embebedor de tejido | Leica | HistoCore Arcadia | Para incrustar micromoldes |
| Procesador de tejidos | Leica | TP1020 | Para procesar micromoldes |
| Incubadora de Agitación 211DS (Vibrador Orbital) | Labnet International | I-5211-DS | Incubar ovarios en medios enzimáticos para la liberación de folículos |
| Software | |||
| Autodesk Fusion | Autodesk, Inc | Software de diseño asistido por ordenador (CAD). Autodesk ofrece acceso educativo gratuito a través del programa educativo de Autodesk. | |
| DinoCapture 3.0 versión 1.1.1.3 | Dino-Lite | ||
| ImageJ | Institutos Nacionales de Salud | Analizar imágenes OCT y medir folículos | |
| PreForm | Formlabs, Inc | Software gratuito de preparación de impresión diseñado para funcionar con impresoras de estereolitografía (SLA) de Formlabs. |
Referencias
- Duncan, F. E., et al. Unscrambling the oocyte and the egg: clarifying terminology of the female gamete in mammals. Mol Hum Reprod. 26 (11), 797-800 (2020).
- Jaffe, L., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
