Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Producción y uso de moldes de agarosa personalizables para cultivo de folículos ováricos de ratón sin andamios

1.2K vistas

⸱

DOI:

10.3791/68871

⸱

24 de octubre de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Describimos métodos para cultivar folículos ováricos en un novedoso molde de agarosa sin andamios que complementan la gametogénesis in vitro .

Resumen

El folículo ovárico es la unidad funcional del ovario que produce hormonas y gametos necesarios para mantener la función reproductiva y la salud femeninas. La capacidad de recapitular la foliculogénesis, la ovulación y la luteinización in vitro tiene una amplia utilidad básica, traslacional y clínica. Los sistemas de crecimiento de folículos in vitro más avanzados mantienen la arquitectura tridimensional (3D) del folículo, que es crucial para el desarrollo de ovocitos de metafase II meióticamente competentes en humanos. Recientemente, se desarrolló y validó un método sin andamios para el crecimiento de folículos folículos in vitro de folículos secundarios multicapa de ratón. Para ello, se utilizaron moldes impresos en 3D personalizados para micromodelar la agarosa con micropocillos que se adaptan a la expansión volumétrica de los folículos. Los folículos cultivados en este entorno libre de andamios mostraron una producción hormonal y una viabilidad comparables en relación con los sistemas de crecimiento de folículos in vitro encapsulados (eIVFG) bien establecidos a base de alginato. Es importante destacar que los micropocillos de agarosa son un método escalable, menos exigente técnicamente y muestran mejores tasas de crecimiento de folículos y ovulación en relación con la eIVFG. Esta metodología produce moldes personalizables que son biocompatibles con el ovocito, una célula altamente sensible a lixiviados específicos del material y otros contaminantes ambientales. Además, los folículos de este sistema se cultivan en el mismo plano focal, lo que permite obtener imágenes y análisis de lapso de tiempo en tiempo real. Para aumentar la accesibilidad de este nuevo enfoque, este artículo detalla los métodos necesarios para diseñar e imprimir en 3D moldes maestros, crear moldes de silicona para placas de 24 o 96 pocillos y cultivar folículos ováricos secundarios multicapa aislados en los moldes de agarosa. Esta configuración también se puede integrar con un sistema de imágenes de lapso de tiempo rentable, lo que permite el análisis morfocinético. Además, los moldes pueden incluirse en parafina para análisis histológicos posteriores. En general, este método fácil de usar es una herramienta versátil para el cultivo de folículos y se puede personalizar aún más para promover la diferenciación y maduración de las células germinales dentro del contexto del folículo para mantener una gametogénesis in vitro completa.

Introducción

El ovocito, o gameto femenino, aporta la mayor parte del citoplasma y la mitad del material genético al embrión en la fecundación, lo cual es esencial para el desarrollo de la siguiente generación. La ovogénesis comienza durante el desarrollo embrionario cuando las células germinales primordiales entran en meiosis y se detienen en la profase I. Estos ovocitos residen dentro de los folículos primordiales y constituyen la reserva ovárica, un conjunto finito y no renovable del que se reclutan progresivamente. Los folículos se desarrollan en un proceso conocido como foliculogénesis, con el objetivo de producir finalmente un gameto maduro capaz de fecundación 1,2,3,4,5. El desarrollo del folículo comienza con una fase temprana, independiente de la gonadotropina, donde la señalización paracrina es esencial para la supervivencia y el crecimiento del folículo. A medida que los folículos maduran hasta la etapa secundaria, se vuelven dependientes de las gonadotropinas, lo que marca un cambio hacia la señalización endocrina. Una característica clave de los folículos secundarios es un ovocito rodeado por un mínimo de dos capas completas de células de la granulosa cuboidal, junto con la capa de teca recientemente desarrollada. Las células de la teca forman la capa más externa del folículo, proporcionando andrógenos y soporte estructural 6,7. Finalmente, se forma una cavidad antral llena de líquido y se rompe en respuesta a un aumento de la hormona luteinizante (LH) durante la ovulación, liberando un gameto competente para la fertilización detenido en la meiosis II 2,8,9.

El ovocito alcanza la competencia de desarrollo para la fertilización y la capacidad de apoyar el desarrollo embrionario preimplantacional temprano, denominado maduración nuclear y citoplasmática, durante la ovogénesis y la foliculogénesis 10,11,12. La maduración citoplasmática es aparente morfológicamente, ya que los ovocitos se expanden a lo largo de la foliculogénesis. Como resultado de la proliferación de células somáticas, incluidas las células de teca, granulosa y cúmulo, los folículos experimentan una expansión volumétrica significativa. En ratones, el diámetro del folículo se quintuplica desde los folículos secundarios tempranos hasta los preovulatorios. La comunicación bidireccional entre el ovocito y las células somáticas circundantes es esencial para la ovogénesis. En los folículos primarios, la zona pelúcida se forma a partir de proteínas secretadas por el ovocito, y la comunicación entre estos compartimentos foliculares está mediada en parte por proyecciones transzonales, que proporcionan contacto físico entre estos dos compartimentos foliculares13,14. Por lo tanto, el microambiente folicular es vital para orquestar correctamente el crecimiento y la maduración nuclear y citoplasmática del ovocito 2,5. Para comprender mejor los mecanismos discretos que apoyan estos procesos, se necesitan técnicas de cultivo in vitro avanzadas y fisiológicamente relevantes. La capacidad de cultivar folículos in vitro tiene amplias aplicaciones, incluidas las tecnologías de reproducción asistida y la preservación de la fertilidad 15,16,17,18, la conservación de especies 19,20, el desarrollo de fármacos21 y la detección toxicológica22,23.

Los sistemas de cultivo de folículos in vitro también son un paso intermedio esencial para la capacidad de generar gametos a partir de células madre pluripotentes, también conocida como gametogénesis in vitro (IVG)24. Los investigadores han utilizado células madre embrionarias, células madre mesenquimales y células madre pluripotentes inducidas para desarrollar gametos en una variedad de especies, a menudo confiando en células somáticas para recrear el microambiente del folículo nativo 25,26,27,28,29,30. Si bien se han logrado importantes hitos de prueba de concepto a través de estos métodos, todavía existe el desafío de los ovocitos de baja calidad, lo que se refleja en un bajo desarrollo embrionario y tasas de descendencia viva después de la fertilización in vitro en ratones31,32. Todavía no se han logrado nacimientos vivos en otras especies, lo que subraya la necesidad de un refinamiento continuo de los protocolos para apoyar plenamente la ovogénesis y la foliculogénesis.

Actualmente, se utilizan varias estrategias para el cultivo de folículos. Los enfoques técnicamente menos exigentes y de mayor rendimiento son los métodos sin andamios, donde los folículos se colocan en un plato de plástico o inserto de membrana33,34. Aquí, las células de la granulosa se adhieren a la superficie de cultivo, perdiendo contacto con el ovocito33,34. La ruptura de la arquitectura folicular limita la usabilidad y la relevancia biológica de estas técnicas. Sin embargo, el cultivo sin andamios en placas de baja fijación o gotas invertidas permite que el folículo mantenga la integridad estructural en varias especies de mamíferos 35,36,37. Desafortunadamente, con estas técnicas, es difícil controlar la interacción entre los folículos y la cantidad de soporte mecánico que reciben. Por lo tanto, para recapitular mejor la fisiología in vivo, se han desarrollado métodos de cultivo en los que los folículos se encapsulan en hidrogeles con composiciones químicas definidas y sintonizables y/o propiedades mecánicas 33,34,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53. Por ejemplo, el sistema de crecimiento del folículo in vitro encapsulado en alginato puede recapitular firmas transcriptómicas clave observadas in vivo21.

A pesar del éxito y el valor de los protocolos de cultivo encapsulados, existen varias desventajas. Pueden ser técnicamente desafiantes, laboriosos, de bajo rendimiento y no son compatibles con los métodos automáticos de imagen. Además, los métodos de cultivo encapsulados necesitan enfoques de varios pasos para especies de mamíferos más grandes debido a la mayor expansión volumétrica del folículo37. Además, las técnicas encapsuladas ejercen un soporte uniforme en todas las direcciones, y los folículos deben liberarse del hidrogel antes de la ovulación. Esto no ocurre in vivo, donde el folículo interactúa con el microambiente ovárico circundante, lo que proporciona soporte biomecánico dinámico54. Por ejemplo, la corteza ovárica rígida mantiene la inactividad de los folículos primordiales, mientras que los folículos grandes en crecimiento se encuentran típicamente en el compartimento medular más blando55,56. Una vez que un folículo con un ovocito competente ha alcanzado su tamaño terminal, las modificaciones de la pared del folículo y del epitelio de la superficie ovárica permiten la ovulación. Por lo tanto, las técnicas de cultivo en las que se permite que los folículos crezcan en una sola dirección con poca resistencia podrían imitar mejor la fisiología in vivo.

En un enfoque novedoso, se desarrolló un método de cultivo reproducible, escalable, técnicamente menos exigente y rentable para folículos secundarios multicapa de ratón57. Aquí, los micropocillos de agarosa de adhesión ultrabaja con geometría (forma, dimensiones) y disposición espacial (número, proximidad) controlables con precisión se fabrican utilizando métodos asequibles. Los folículos en los moldes de agarosa experimentan soporte mecánico en todas las direcciones menos una y se cultivan en el mismo plano focal, lo que permite obtener imágenes de lapso de tiempo para un análisis morfocinético avanzado. La impresión 3D de estereolitografía (SLA) se utilizó como un método accesible para fabricar un molde maestro, seguido de pasos de moldeo que crean moldes de silicona sin lixiviados para fundir la agarosa. Se lograron mejores resultados de crecimiento del folículo y ovulación utilizando el nuevo sistema en comparación con la eIVFG tradicional, sin comprometer la supervivencia general del folículo, la maduración o la luteinización57. Este documento de protocolo describe los pasos necesarios para personalizar y fabricar mohos de agarosa, cómo sembrar y cultivar folículos secundarios multicapa, procesar y finalmente realizar análisis de lapso de tiempo (Figura 1).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales relacionados con este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Northwestern y se realizaron de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Adapte el diseño del molde maestro

Esta sección describe los primeros pasos realizados durante la fase de diseño (Figura 1), donde se introducen micropocillos personalizados en un diseño asistido por computadora (CAD) de un molde maestro para placas de cultivo de 24 pocillos, llamado diseño de base de molde maestro de 24 pocillos (Archivo complementario 1). Las dimensiones de los micropocillos dictan la cantidad de soporte y el tamaño máximo de crecimiento de los folículos, mientras que el número de pocillos determina el número máximo de folículos por moho de agarosa. El diseño del molde maestro adaptado se utilizará en la siguiente sección para crear moldes de silicona biocompatibles para la fundición de agarosa.

  1. Abra el archivo .step de diseño de la base del molde maestro de 24 pocillos con el software CAD (Figura 2A).
  2. Seleccione el área de superficie interna del objeto, luego navegue a la pestaña Sólido en el espacio de trabajo Diseño y seleccione Crear boceto para insertar el diseño de micromolde deseado (Figura 2Bi).
  3. Introduzca las dimensiones xy deseadas y el número de micropocillos y seleccione el boceto de acabado en la barra de herramientas (Figura 2Bii).
    NOTA: Para folículos secundarios multicapa, anteriormente se utilizó una forma geométrica de estadio de 500 x 700 μm57. La resolución de impresión puede variar según las resinas y las impresoras SLA utilizadas; Permita un espacio mínimo de 400 μm entre micropocillos.
  4. Cree los micropocillos de 800 μm de profundidad utilizando la función de extrusión (haga clic en Sólido | Crear | Extrusión). Asegúrese de seleccionar la operación de corte , creando la cavidad del micropocillo (Figura 2Biii).
  5. Seleccione un empalme de 0,100 mm de radio (haga clic en Diseño | Sólido | Modificar | Filete) para la parte superior de los micropocillos
    NOTA: Para crear un micropocillo de fondo redondo, use la operación de filete nuevamente para el fondo del pocillo de cultivo y haga que el valor del radio sea igual al radio del diseño del micropozo. Por ejemplo, al diseñar pocillos de 500 μm x 700 μm, seleccione un valor de radio de 0,250 mm (Figura 2Biv).
  6. Exporte una copia del nuevo diseño del molde maestro en formato .step (haga clic en Archivo | exportar).

2. Creación de contenedores de moldes de silicona

NOTA: Para evitar la lixiviación de compuestos citotóxicos de las piezas impresas en 3D, se fabricarán dos moldes de silicona biocompatibles. Esta sección describe los últimos pasos en la fase de diseño (Figura 1) y dará como resultado los dos contenedores utilizados para el moldeo de silicona. Aquí, se utilizarán tres archivos CAD diferentes, a saber, el nuevo diseño de molde maestro creado a partir de la sección 1 y los contenedores de fundición de silicona de 24 pocillos 1 y 2 (Figura 2Ci-ii y Archivo complementario 2, Archivo complementario 3, respectivamente).

  1. Abra el archivo de 1.step del contenedor de fundición de silicona de 24 pocillos e inserte el nuevo diseño del molde maestro como un componente externo (vaya a Sólido | Insertar | Insertar componente).
    1. Haga clic con el botón derecho en el componente y seleccione Romper vínculo para eliminar la referencia vinculada al nuevo diseño de molde maestro.
  2. Centre el nuevo diseño del molde maestro con una superficie de contenedor de silicona fundida de 24 pocillos , asegurándose de que mire hacia adentro.
    1. Haga clic con el botón derecho en el nuevo objeto de diseño de molde maestro en el navegador y seleccione la opción mover/copiar .
    2. Seleccione la operación Movimiento libre en la sección Tipo de movimiento y gire el objeto 180° en el eje x si es necesario.
    3. Seleccione la operación Punto a punto en la sección Tipo de movimiento con el centro del nuevo objeto de diseño de molde maestro como punto de origen y el centro de la superficie 1 del contenedor de fundición de silicona de 24 pocillos como punto de destino.
    4. Seleccione Aceptar para alinear los objetos.
  3. Seleccione la operación de corte con el contenedor como cuerpo objetivo y el molde maestro como diseño del cuerpo de la herramienta (Figura 2Ciii). Esto crea el recipiente para el primer paso del moldeo de silicona (Figura 2Civ).
    NOTA: Los micropozos que se diseñaron en la primera sección ahora son micropilares que se imprimirán en 3D como se describe en la sección 3. La impresión SLA es un método de fabricación aditiva; Por lo tanto, la impresión de micropilares mejora la resolución de impresión en comparación con la impresión de micropocillos.
  4. Guarde y exporte el nuevo molde de silicona de 24 pocillos 1 resultante como un archivo .stl y .step.

3. 3D impresión de envases de silicona

NOTA: Esta sección describe los primeros pasos realizados durante la fase de fabricación (Figura 1) donde se imprimen en 3D los nuevos diseños CAD con las características de diseño de micropocillos deseadas.

  1. Abra los archivos .stl del nuevo molde de silicona de 24 pocillos 1 y del contenedor de fundición de silicona de 24 pocillos 2 con el software de preparación de impresión 3D.
  2. Oriente la impresión con los micropilares hacia arriba y utilice la función de taladro para crear una abertura de 1 mm de ancho (Figura 2D). Asegúrese de que este canal esté abierto al costado de la impresión.
    NOTA: El orificio que evita los efectos de ahuecamiento durante la impresión y se puede rellenar después de la impresión, o el exceso de material de silicona se puede eliminar después de la primera moldura de silicona.
  3. Imprima los dos diseños de contenedores con un espesor de capa de 25 μm (Figura 3A).
    NOTA: Imprima cada modelo por triplicado para tener en cuenta las imperfecciones o daños de impresión durante el procesamiento.
  4. Retire los moldes de la plataforma de impresión y lave con isopropanol al 95% de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Rocíe la sección del micropilar ampliamente con isopropanol al 95% (Figura 3B). Elimine cualquier resto de etanol con aire comprimido.
  5. Deje que el etanol restante se evapore durante al menos 30 min.
    NOTA: En esta etapa, se puede sellar el canal de perforación de 1 mm de ancho. Esto se puede hacer aplicando una pequeña gota de resina no polimerizada con una punta de pipeta p200 en el exterior de la impresión. Las fuerzas capilares llenarán el canal.
  6. Cure las impresiones 3D a 60 °C con luz ultravioleta durante 15 min.
  7. Inspeccione cada impresión con un microscopio estereoscópico y deseche cualquier impresión 3D con imperfecciones (Figura 3C-F). Inspeccione minuciosamente cada impresión visualmente, asegurándose de que todos los micropilares estén separados y sean uniformes en tamaño y apariencia (Figura 3D). Deseche los moldes maestros defectuosos con micropilares fusionados (Figura 3E).
    NOTA: Los problemas comunes son micropilares o puentes dañados por la resina sin lavar restante (Figura 3Fi, ii).
  8. Cubra el exterior de la impresión con parafilm si el canal de perforación no está lleno y guárdelo hasta que lo use más.

4. Fabricación de moldes de silicona

NOTA: Esta sección describe los pasos finales de la fase de fabricación (Figura 1), donde se llevarán a cabo dos pasos de moldeo de silicona. Esto es necesario para evitar la liberación de lixiviados tóxicos por parte de las piezas impresas en 3D.

  1. Prepare la silicona de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en resumen:
    1. Mezcle bien el contenido de los recipientes de las Partes A y B , coloque un vaso de precipitados en una balanza y vierta en el recipiente en una proporción de 1A: 1B en peso. Asegúrese de tener material sobrante.
    2. Mezcle bien durante 3 minutos, asegurándose de raspar los lados y el fondo.
    3. Colocar el material en un desecador al vacío y dejar actuar durante 5 min para eliminar las burbujas de aire atrapadas. Repita la desgasificación hasta 2 veces si quedan burbujas de aire.
  2. Vierta la mezcla con un flujo uniforme en el recipiente del molde de silicona 1. Asegúrese de que el nivel de mezcla esté al mismo nivel que la impresión 3D o ligeramente por debajo para garantizar la planitud del molde de silicona (Figura 4Ai, ii).
    1. Elimine el aire atrapado con una punta de pipeta p200 y utilice la desgasificación al vacío si es necesario.
  3. Cure la silicona a temperatura ambiente durante al menos 5 h y preferiblemente durante la noche antes de desmoldar.
  4. Retire la silicona del molde impreso en 3D y confirme visualmente la integridad de los micromoldes con un microscopio estereoscópico (Figura 4Aiii, B). Retire el exceso de material del canal de perforación si es necesario (Figura 4Aiv). Deseche los moldes con micropocillos puente o comprometidos (Figura 4C).
  5. Coloque el molde de silicona en el recipiente 2 del molde de silicona para el segundo paso de moldeo de silicona (Figura 4Av). El contenedor de silicona 2 tiene una abertura de 1 mm en la pared lateral que se cubrirá una vez colocado el molde de silicona.
  6. Rocíe ligeramente el molde de silicona con aceite mineral seguro para embriones y elimine el exceso de aceite de los micropocillos. Esto actuará como un agente desmoldante para separar ambas partes de silicona después del curado.
  7. Repita los pasos de mezcla descritos en el paso 4.1 y vierta la mezcla en el recipiente de silicona del molde 2. Asegúrese de que el nivel de mezcla esté por debajo o a la misma altura que la impresión 3D para garantizar la planitud del molde de silicona (Figura 4Avi).
  8. Deje que la silicona se cure a temperatura ambiente durante al menos 5 h, preferiblemente durante la noche, antes de desmoldar.
  9. Retire la silicona del molde impreso en 3D y separe los moldes de silicona 1 y 2 entre sí (Figura 4Avii). Confirme visualmente la integridad de los micropilares utilizando un microscopio estereoscópico (Figura 4D). Deseche el molde si había burbujas o exceso de petróleo en los micropozos (Figura 4E).
  10. Lavar el molde de silicona con etanol al 70% y dejar secar al aire durante 30 min en una campana de flujo laminar.
  11. Coloque en una bolsa de esterilización y autoclave usando un ciclo seco para esterilizar (Presión de la camisa: 20 psi, Temperatura de la cámara: 250 ° F, Tiempo de esterilización: 15 min).

5. Preparación de medios de cultivo

NOTA: La digestión del tejido ovárico para el aislamiento y cultivo de folículos, la maduración in vitro de ovocitos y la luteinización requieren seis tipos de medios: medios de disección (DM), medios enzimáticos (EM), medios de mantenimiento (MM), medios de crecimiento (GM), medios de maduración (IVM) y medios de luteinización (LM). La preparación de estos medios se puede encontrar como se describió previamente por Converse et al.38 con una explicación de la importancia de los diferentes componentes de los medios analizados por Simon et al.33, y su propósito se menciona brevemente en la Tabla 1.

  1. Preparar los medios con hasta 1 semana de antelación y almacenar a 4 °C.

6. Fundición y almacenamiento de moho de agarosa personalizado y cultivo de folículos

NOTA: Esta sección describe cómo fundir moldes de agarosa personalizados para cultivo de folículos a partir de los moldes de silicio generados en la sección 4. Los mohos de agarosa se pueden fabricar y almacenar a 4 °C hasta 2 semanas antes del cultivo de folículos.

  1. Coloque los moldes en una bolsa de esterilización y esteriliza en autoclave utilizando un ciclo de secado como se describe en la sección 4.11. Deje que los moldes se enfríen antes de usarlos.
  2. Haga una solución de agarosa disolviendo una solución estéril de agarosa al 1,5% (p/v) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un microondas o placa caliente. Utilice un tubo cónico estéril que se coloca en un vaso de precipitados con agua para permitir un calentamiento más uniforme de la agarosa y ralentizar la solidificación de la solución de agarosa líquida.
  3. Pipetear la solución estéril de agarosa en moldes de silicio en una campana de flujo laminar. Pipetea lenta y suavemente para minimizar la formación de burbujas y asegúrate de que la parte superior del molde sea plana y no convexa ni cóncava. La parte superior al fundir será la parte inferior del molde al cultivar y debe quedar plana. Utilice aproximadamente 600 μL de agarosa para un micromolde de placa de 24 pocillos y 85 μL para un micromolde que quepa en una placa de 96 pocillos.
  4. Deje enfriar los micromoldes durante ~ 3 min hasta que se solidifiquen. Invierta el moldeo de silicio para expulsar los micromoldes en una placa de Petri de 100 mm.
  5. Evalúe los micromoldes bajo un microscopio para detectar deformidades, incluidas grietas, fusión de micropocillos o bordes incompletos. Coloque los micromoldes en PBS estéril + penicilina-estreptomicina al 1% y guárdelos a 4 °C hasta 2 semanas antes de su uso.
    NOTA: Haga más moldes de los necesarios para tener en cuenta la degradación con el tiempo o el daño a los micromoldes al transferir entre placas.
  6. Equilibre los micromoldes en 750 μL de medios de mantenimiento 2 veces durante al menos 1 h (total de dos incubaciones) el día del aislamiento del folículo.
  7. Retire todos los medios de mantenimiento, agregue 750 μL de medios de crecimiento y colóquelos en la incubadora durante 1 h.
  8. Reemplace con medios de crecimiento frescos y equilibrados antes de la siembra.

7. Aislamiento y cultivo de folículos secundarios tardíos

NOTA: Esta sección explica cómo aislar y sembrar folículos en los micromoldes de agarosa para el cultivo de folículos. Las secundarias multicapa se cultivan durante 8 días, deben tener más del 80% de viabilidad y producir ovocitos maduros. El aislamiento y el cultivo de folículos secundarios se han descrito con gran detalle en otros lugares38. El aislamiento y la selección de folículos para la encapsulación establecida de alginato y para la siembra en mohos de agarosa son consistentes.

  1. Diseccionar los ovarios de los ratones y extraerlos del tejido adiposo periovárico y la bursa. Coloque los ovarios en 2,5 ml de medios enzimáticos e incube en un agitador orbitario a 37 ° C durante 20 min como se describió anteriormente57.
  2. Pipetear 2 ml de medios de mantenimiento en una placa de FIV y colocar en una incubadora (37 °C, 5% de CO2) antes del aislamiento del folículo.
  3. Reacción de enfriamiento con 250 μL de FBS. Seleccione los folículos secundarios tardíos después del aislamiento enzimático y transfiéralos a una placa de FIV con DM.
  4. Transfiera los folículos a una placa de FIV con medios de mantenimiento preequilibrados y colóquelos en una incubadora (37 °C, 5% CO2) durante 1 h.
    NOTA: El tamaño inicial de los folículos secundarios tardíos es de 150-180 μm con más de dos capas de células de la granulosa presentes.
  5. Agregue 750 μL de GM fresco a los micromoldes de agarosa y guárdelos en la incubadora para prepararlos para la siembra. Agregue PBS estéril a los pozos adyacentes que rodean los micromoldes de agarosa para mantener la humedad y minimizar la evaporación de los medios durante el período de cultivo.
  6. Sembrar folículos en moldes de agarosa que han sido preequilibrados y están sumergidos en GM. Transfiera folículos secundarios multicapa de alta calidad a micromoldes de agarosa bajo un microscopio utilizando una punta de extracción de 200 μm. Asegúrese de que se transfieran 10 folículos a cada micromolde en una placa de 24 pocillos y que cada folículo esté en un micropocillo separado pero adyacente.
    1. Dobla la punta del separador para permitir una manipulación y transferencia más precisas de los folículos a los micropocillos.
    2. Transfiera los folículos rápidamente para minimizar los cambios de temperatura y pH, ya que MM y GM están amortiguados con CO2 .
    3. Asegúrese de que los folículos dentro de un micromolde tengan un tamaño inicial similar una vez que se transfieran los 10 folículos.
  7. Vuelva a colocar los micromoldes sembrados en la incubadora durante al menos 1 h para permitir que los folículos se recuperen antes de la obtención de imágenes.
  8. Tome imágenes de los folículos con un aumento de 4x y 10x cada dos días para cuantificar la supervivencia del folículo y los resultados del crecimiento.
    NOTA: Las imágenes de lapso de tiempo también se pueden configurar para realizar mediciones morfocinéticas y se describen con más detalle en la sección 9.
  9. Cambiar el 50% de los medios de cultivo cada dos días.
  10. Congele rápidamente los medios usados con hielo seco y luego guárdelos a -80 °C. Utilice este medio condicionado para evaluar la producción de hormonas a través de ELISA de estradiol.
    NOTA: Si el GM se realiza el día de la siembra (comienzo del período de cultivo), el medio puede almacenarse a 4 °C y utilizarse durante todo el período de cultivo.
  11. Retire y congele rápidamente todos los medios de cultivo (750 μL) el día 8 de cultivo.
  12. Reemplace los medios de crecimiento con medios IVM para permitir la ovulación in vitro .
    NOTA: La ovulación también puede ocurrir bajo imágenes de lapso de tiempo para evaluar el momento y las características de ruptura.
  13. Retire los complejos cúmulo-ovocitario (AOC) 14-16 h después de que se haya agregado el medio IVM y marque el estado de maduración.
    1. Definir el estado de maduración es el siguiente: identificar MII por extrusión del primer cuerpo polar (resultado esperado para ovocitos sanos), GVBD/MI por la falta de cuerpo polar o vesícula germinal (retraso en la maduración), GV por el núcleo esférico visible en el centro del ovocito (falta de progresión meiótica) u ovocito degenerado-aplanado y/u oscurecido.
  14. Opcional: Dado que los parámetros del huso de los ovocitos MII, incluida la alineación cromosómica, la forma y el volumen, están estrechamente correlacionados con la calidad de los ovocitos y los resultados embrionarios58,59, utilícelos para evaluar el éxito de la ovogénesis in vitro. Para evaluar la morfología del huso, fijar y teñir los huevos MII a través de inmunocitoquímica de montaje completo.
    1. Fijación: Fijar los huevos en PFA al 3,8% con Triton X-100 al 0,1% a 37 °C durante 20 min. Lavar los huevos 3 veces en tampón bloqueador (PBS con calcio y magnesio (PBS +/+) con 10% Tween-20 y 0,3% BSA).
    2. Tinción del husillo:
      1. Incubar los huevos en tampón de permeabilización (PBS +/+ con 0,1% de Triton X-100 y 0,3% de BSA) durante 15 min a temperatura ambiente
      2. Enjuague 2 veces en tampón de bloqueo.
      3. Incube los huevos en anti-alfa-tubulina conjugada con Alexa Fluor 488 a una concentración de 1 μg/ml en un balancín envuelto en papel de aluminio durante 2 h a temperatura ambiente.
      4. Lave los huevos durante 3 x 20 min en tampón de bloqueo antes de montarlos en portaobjetos de microscopio con medio de montaje que contenga DAPI.
      5. Para observar el citoesqueleto del ovocito, incluya faloidina de rodamina 1:50 durante la tinción.
    3. Imágenes de muestras en un microscopio confocal utilizando un objetivo de 63x con una pila z a un ancho de 1,0 μm en todo el husillo.

8. Aplicaciones posteriores de moldes de agarosa personalizados

NOTA: Los micromoldes de agarosa se pueden utilizar para el análisis histológico, lo que permite la cuantificación y localización de diferentes genes o proteínas de interés. Los micromoldes crean una micromatriz de folículos que permite teñir varios folículos en paralelo. La tomografía de coherencia óptica (OCT) también se puede realizar sin tener que transferir folículos (Figura 1, Aplicación). La tomografía de coherencia óptica es una técnica de imagen que permite la reconstrucción 3D de muestras y tiene una mayor profundidad de penetración y resolución en comparación con la microscopía confocal, lo que permite mejorar la obtención de imágenes de muestras 3D, como folículos cultivados in vitro60.

  1. Para aplicaciones histológicas, prepare una solución de agarosa (1,5% p/v) como se describe en el paso 6.2.
    1. Retire todos los medios que rodean los micromoldes de agarosa en el pocillo y retire con cuidado los medios en la cavidad del micromolde utilizando una pipeta p200 en las esquinas de la cavidad.
    2. Pipetee con cuidado 100 μL de solución de agarosa líquida para llenar y sellar los micropocillos y la cavidad sin agitar los folículos; Asegúrese de que la parte superior sea plana. Elimine las burbujas con una punta de pipeta P10 estéril.
    3. Deje que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente durante 2 min. Asegúrese bajo un microscopio de que el micromolde esté completamente sellado.
    4. Fije los micromoldes durante la noche a 4 °C con un balanceo suave en 750 μL de fijador (solución de Davidson modificada o paraformaldehído al 3,8%).
    5. Aspire el fijador y lave los micromoldes sellados en concentraciones ascendentes de etanol, comenzando con 50% y finalmente 70% de EtOH.
    6. Procese utilizando un procesador de tejidos automatizado utilizando protocolos de procesamiento estándar (Tabla 2) e incruste en cera de parafina. Al incrustar, tome nota de la orientación de los micromoldes. Asegúrese de que haya cera antes y después de la muestra durante el proceso de inclusión para minimizar la pérdida de tejido durante el corte.
    7. Corte en serie las muestras incluidas con un grosor de 5 μm y colóquelas en portaobjetos de microscopio cargados.
    8. Realice la tinción de H&E con un tinción automática y selle con un medio de montaje antes de la obtención de imágenes.
  2. Al realizar OCT, coloque el micromolde con folículos en un plato de 50 mm que contenga medios IVM.
    1. Para seguir el procedimiento utilizado para generar las imágenes representativas de OCT, obtenga imágenes utilizando un sistema OCT personalizado que funcione dentro del rango espectral de luz visible con una resolución axial de 1,3 μm y una resolución lateral de 9,4 μm61,62.
    2. Escanee los folículos en un campo de visión de 1,58 x 1,58 mm2 , que consta de 512 líneas A y 512 B-scans, repetidos 2x por B-scan y 3x por volumen.
    3. Procese imágenes OCT usando ImageJ para visualizar la estructura 3D de los folículos y cuantificar los volúmenes.
      1. Cargue imágenes en ImageJ como una pila Z arrastrando archivos a la aplicación abierta.
      2. Visualiza la pila z como una imagen 3D yendo a Plugins|3D|Visor de volumen. Gire la imagen 3D para ver diferentes ángulos en diferentes puntos de tiempo.
      3. Vaya a Archivo| Guardar como |Tiff para guardar la imagen en la ubicación deseada.

9. Análisis de lapso de tiempo del cultivo de folículos

NOTA: Los folículos cultivados en el sistema de cultivo sin andamios residen en el mismo plano focal y son compatibles con las imágenes de lapso de tiempo en la incubadora. Las imágenes de lapso de tiempo se pueden iniciar después de sembrar folículos en el paso 7.7 (Figura 1, Aplicación).

Asegúrese de que todos los cambios sean precisos durante todo el timelapse. Por lo tanto, pase por toda la pila después de cada paso para asegurarse de que no haya discrepancias en las mediciones.

  1. Configuración de lapso de tiempo:
    1. Coloque una tapa de enfocador/concentrador de luz en el microscopio de mano.
    2. Coloque el microscopio de mano con soporte de montaje en la incubadora y conéctelo a una computadora portátil con software instalado.
    3. Coloque y alinee bien el cultivo bajo el microscopio y ajuste la altura y el enfoque del microscopio para que todos los folículos estén enfocados. Con el balance de blancos automático (AWB), elija las condiciones de iluminación óptimas con el control LED, desactive la exposición automática (AE) y seleccione el tiempo de exposición óptimo.
      NOTA: Asegúrese de que la alineación del molde sea la misma antes y después de cada cambio de medio; de lo contrario, el análisis deberá realizarse por separado por cada 2 días de cultivo.
    4. Inicie la adquisición de imágenes de lapso de tiempo, seleccionando una duración de 8 días y un intervalo de 30 min. Seleccione la foto y apague el LED cuando no esté tomando fotografías.
  2. Especifique qué mediciones se registrarán en el cuadro de diálogo Establecer medidas (haga clic en Analizar | establecer mediciones) antes del análisis de ImageJ.
    NOTA: Para obtener más información sobre las posibles mediciones incorporadas en el software ImageJ, consulte la subsección 30.763 de la guía del usuario.
  3. Coloque todas las imágenes en una carpeta de análisis separada para iniciar el análisis.
  4. Arrastre y suelte la carpeta de análisis en el software ImageJ para abrir el lapso de tiempo como una pila. Asegúrese de que los nombres de clasificación numérica estén seleccionados y, si las secuencias de imágenes no caben en la RAM del equipo, seleccione la pila virtual.
  5. Utilice la herramienta de selección rectangular para seleccionar un área donde estén presentes todos los folículos a lo largo del lapso de tiempo. Para esto, use primero la última imagen y desplácese por la pila para asegurarse de que no se corte ninguno de los folículos. Luego, recorte la selección (navegue a Imagen | Recortar o Ctrl+Mayús+X, Figura 5Ai,ii).
  6. Establezca la barra de escala para la pila de lapso de tiempo (Analizar | Establecer escala). Utilice la imagen del día 0 hecha con el generador de imágenes y mida tres características identificables, como folículos o micropocillos. Utilice la misma imagen del día 0 de la pila de timelapse y defina la escala para una de las mediciones; Utilice las otras dos medidas para confirmar que se ha ajustado la escala exacta.
  7. Alinee todas las imágenes usando el complemento SIFT (navegue a Complementos | Registro | Alineación de pila lineal con SIFT, (Figura 5Bi, ii). Utilice la siguiente configuración estándar, que se puede ajustar por caso: Alineación de pila lineal con SIFT, initial_gaussian_blur = 1,60 steps_per_scale_octave = 3 minimum_image_size = 64 maximum_image_size = 1024 feature_descriptor_size = 4 feature_descriptor_orientation_bins = 8 más cercano/next_closest_ratio = 0,92 maximal_alignment_error = 25 inlier_ratio = 0,05 expected_transformation=Interpolar rígido.
  8. Convierta la pila a escala de grises de 8 bits (Imagen | Tipo | 8 bits).
  9. Elimine el fondo utilizando la sustracción de fondo de bola rodante (haga clic en Proceso | Restar fondo, Figura 5Ci, ii) usando la siguiente configuración, que se puede ajustar por caso: Radio de bola rodante = 70.0 píxeles; Seleccione Deshabilitar suavizado.
  10. Umbral de la imagen (vaya a Imagen | Ajustar | Threshold) para dividir las imágenes de lapso de tiempo en dos clases de píxeles, utilizando los siguientes ajustes: setThreshold(35, 255, "raw"); run("Aplicar LUT", "stack"); setOption("BlackBackground", true); run("Convertir en máscara", "method=Intermodes background=Dark calculate black").
  11. Mida cada folículo individualmente utilizando la selección de rectángulo, luego seleccione la función de análisis de partículas (haga clic en Analizar | Analizar partículas). Utilice los siguientes ajustes: Analizar partículas...", "size= 8000-Infinity display exclude include summarize overlay add composite stack (Figura 5Di,ii).
    1. Antes de guardar los resultados, confirme que el ROI de cada imagen sea preciso (Figura 5Ei, ii). Guarde el resumen y los resultados en el archivo . CSV.
    2. Repita esto para todos los demás folículos.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Para determinar si la supervivencia y el crecimiento de los folículos estaban respaldados por esta novedosa tecnología como se describe en la sección 7 del protocolo, los folículos de los mismos ratones se aislaron y cultivaron en paralelo en micromoldes de agarosa o se encapsularon en alginato al 0,5%. Las imágenes representativas de los folículos de cada dos días de cultivo demostraron el desarrollo, el crecimiento y la formación normales de una cavidad antral durante todo el período d...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La gametogénesis y la maduración in vitro son tecnologías clave para la comprensión fundamental de la biología de los ovocitos, con aplicaciones potenciales en tecnología de reproducción asistida, preservación de la fertilidad y conservación de especies. Los métodos para apoyar la IVG a menudo se basan en el cocultivo con células somáticas para crear ovarios reconstruidos30. La importancia de estas células de soporte es bien conocida in vivo, don...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Infantil y Desarrollo Humano (R01HD105752 a F.E.D. y T32HD094699 a E.J.Z) y el programa SenNet del Fondo Común de los NIH (U54AG075932 y UH3CA268105 a F.E.D.) y la Beca de la Fundación Bill y Melinda Gates (INV-003385 a F.E.D.). Bajo las condiciones de subvención de la Fundación Bill y Melinda Gates, ya se ha asignado una Licencia Genérica Creative Commons Attribution 4.0 a la versión del Manuscrito Aceptado por el Autor que podría surgir de esta presentación.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Materiales y Químicos
  Tubos de centrifugación de poliestireno de 50 mLGlobe Scientific941-11017-CS
Tubos microcentrífugas de 1,5 mLFisher ScientificMCT-150Para congelar y almacenar medios
Plato de 100 mm, sin tratarFisher Scientific08-757-100D Para fabricar y almacenar micromoldes de agarosa
100% etanolMercedes Scientific1200Procesamiento de tejidos
1000 y micro; L  Puntas de pipeta, baja retenciónMIDSCIPR-1000BKConsejos culturales 
200 y micro; L  Puntas de pipeta, baja retenciónMIDSCIPR-200BKConsejos culturales 
Placa de 24 pozosCorning353047Cultura
Antenas parabólicas de 35 mmHalcón351008Aislar ovarios e incubar en medios enyzmáticos
95% etanolMercedes Scientific1210Procesamiento de tejidos
AgaroseHoeferGR140Micromoldes
Aceite mineral BioXtra, aceite ligero, adecuado para el cultivo celular de embriones de ratónSigma-AldrichM5310-500MLUtilizado como agente desmoldeante biocompatible
Albúmina sérica bovina  MP Biomedicina103700Medios de Crecimiento
Plumeras de limpieza, 10 oz., paquete de 6Office Depot 110284Aire comprimido
Resina V4 transparente 1 LFormlabs, IncRS-F2-GPCL-04Resina para impresión 3D
Vaso de precipitados de plástico reutilizable Corning de 100 mL, polipropileno graduadoCorning1000P-100Vaso para mezclar componentes de silicona y nbsp;
DNAse IQiagen79254Medios enzimáticos
Ecoflex 00-45 Casi despejadoSmooth-On, IncB09M8Y9PTVMaterial de silicona
F-12 + GlutaMAXGibco31765-035Medios de Crecimiento
Fetino bovino fetalSigmaF-3385Medios de Crecimiento
Suero fetal bovino (FBS)Suero PicoPS-FB2Disección de medios, medios enzimáticos, etc; Medios de Mantenimiento y Medios Medios de Maduración
Fisherbrand  Bolsas de esterilizaciónFisher Scientific01-812-50 Bolsas de esterilización
Hormona folículo-estimulante (FSH)EMD Serono, Inc.Solo Gonal-F Rx Medios de Crecimiento y Medios de Crecimiento Medios de Maduración
Gibco y nbsp; DPBS, calcio, magnesioFisher Scientific14-040-182 Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco
Gonadotropina coriónica humana (hCG)Sigma AldrichC1063-1VLMedios de Maduración
Insulina-transferrina-selenio (ITS)ThermoFisher41400045Medios de Crecimiento
Sondas moleculares de Invitrogen Rhodamine PhalloidinFisher ScientificR415Mancha del citoesqueleto de huevo
Platos de FIVTermo Científica150260Aislar, seleccionar y preequilibrar los folículos
Leibovit'z 15 (L15)Gibco11415-064Disección de medios y medios de disección Medios enzimáticos
LiberaseSigma Aldrich5401119001Medios enzimáticos
¿MEM? + GlutaMAXGibco32561-037Medios de Mantenimiento,   Medios de Crecimiento y Medios de Crecimiento Medios de Maduración
Factor de crecimiento epidérmico del ratón (EGF)BD Biociencias354010Medios de Maduración
Desecador de diseño clásico de policarbonato transparente NalgeneTermo Científica5311-0250Desecador de vacío  
ParafinaFisher Scientific83-30Procesamiento de tejidos y Incrustación
Penicilina-estreptomicinaGibco15140-122Medios de disección, medios enzimáticos y Medios de Mantenimiento
Puntas para stripperOrigioMXL3-200Cultura
Medio de montaje antifade VECTASHIELD PLUS con DAPILaboratorios VectorH-2000Tinción del núcleo del huevo
XilenoMercedes Scientific9840Procesamiento de tejidos
α-Tubulina (11H10) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugado)Tecnología de señalización celular5063STinción de huevo con tubulina
Equipo
Plataforma de Construcción 2Formlabs, IncBP-F3-02-01 Componente de impresora 3D
Dino-Lite Edge AF4915ZTL, USB 2.0Dino-LiteAF4915ZTLImager para configuración en timelapse
Formulario 3 Tanque de resina V2.1 Formlabs, IncRT-F3-02-01Componente de impresora 3D
Impresora 3D Formulario 3B+Formlabs, IncF3B-P-ImpresoraImpresora 3D de estereolitografía (SLA) de Formlabs
Cura de la forma Formlabs, IncFH-CU-01Plataforma de curado 
Lavado de formaFormlabs, IncFH-WA-01Plataforma de lavado
Pulverizador con vaporizador de bombaVWR0309-3005Para aplicar el agente desmoldeante
Enfocador/condensador de luz para la serie Edge (excluyendo los modelos T5 y T8)Dino-LiteN3C-RComponente de imagen para la configuración en timelapse
Paquete Soporte de Montura que combina el rack RK-10 y la extensión de brazo RK-10-EXDino-LiteRK-10AComponente de imagen para la configuración en timelapse
Embebedor de tejidoLeicaHistoCore ArcadiaPara incrustar micromoldes
Procesador de tejidosLeicaTP1020Para procesar micromoldes
Incubadora de Agitación 211DS (Vibrador Orbital)Labnet InternationalI-5211-DSIncubar ovarios en medios enzimáticos para la liberación de folículos
Software 
Autodesk FusionAutodesk, IncSoftware de diseño asistido por ordenador (CAD). Autodesk ofrece acceso educativo gratuito a través del programa educativo de Autodesk.
DinoCapture 3.0 versión 1.1.1.3 Dino-Lite
ImageJInstitutos Nacionales de SaludAnalizar imágenes OCT y medir folículos
PreFormFormlabs, IncSoftware gratuito de preparación de impresión diseñado para funcionar con impresoras de estereolitografía (SLA) de Formlabs.

Referencias

  1. Duncan, F. E., et al. Unscrambling the oocyte and the egg: clarifying terminology of the female gamete in mammals. Mol Hum Reprod. 26 (11), 797-800 (2020).
  2. Jaffe, L., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annu Rev Physiol. 79 (1), 237-260 (2016).
  3. Baerwald, A. R., Adams, G. P., Pierson, R. A. Ovarian antral folliculogenesis during the human menstrual cycle: a review. Hum Reprod Updat. 18 (1), 73-91 (2012).
  4. American Society for Reproductive Medicine. Testing and interpreting measures of ovarian reserve: a committee opinion. Fertil Steril. 114 (6), 1151-1157 (2020).
  5. Telfer, E. E., Grosbois, J., Odey, Y. L., Rosario, R., Anderson, R. A. Making a good egg: human oocyte health, aging, and in vitro development. Physiol Rev. 103 (4), 2623-2677 (2023).
  6. Young, J. M., McNeilly, A. S. Theca: the forgotten cell of the ovarian follicle. Reproduction. 140 (4), 489-504 (2010).
  7. Liu, T., Qin, Q. Y., Qu, J. X., Wang, H. Y., Yan, J. Where are the theca cells from: the mechanism of theca cells derivation and differentiation. Chin Med J. 133 (14), 1711-1718 (2020).
  8. Abbara, A., Clarke, S. A., Dhillo, W. S. Novel concepts for inducing final oocyte maturation in in vitro fertilization treatment. Endocr Rev. 39 (5), 593-628 (2018).
  9. Conti, M., Franciosi, F. Acquisition of oocyte competence to develop as an embryo: integrated nuclear and cytoplasmic events. Hum Reprod Updat. 24 (3), 245-266 (2018).
  10. Williams, C. J., Erickson, G. F. Morphology and physiology of the ovary. , (2000).
  11. Lees-Murdock, D. J., Lau, H. T., Castrillon, D. H., Felici, M. D., Walsh, C. P. DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling. Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).
  12. Jiang, Y., He, Y., Pan, X., Wang, P., Yuan, X., Ma, B. Advances in oocyte maturation in vivo and in vitro in mammals. Int J Mol Sci. 24 (10), 9059(2023).
  13. Clarke, H. J. Regulation of germ cell development by intercellular signaling in the mammalian ovarian follicle. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 7 (1), (2018).
  14. Hsueh, A. J. W., Kawamura, K., Cheng, Y., Fauser, B. C. J. M. Intraovarian control of early folliculogenesis. Endocr Rev. 36 (1), 1-24 (2015).
  15. Smitz, J., et al. Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation. Hum Reprod Updat. 16 (4), 395-414 (2010).
  16. Resetkova, N., Hayashi, M., Kolp, L. A., Christianson, M. S. Fertility preservation for prepubertal girls: update and current challenges. Curr Obstet Gynecol Rep. 2 (4), 218-225 (2013).
  17. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W., Anderson, R. A. Fertility preservation in pre-pubertal girls with cancer: the role of ovarian tissue cryopreservation. Fertil Steril. 105 (1), 6-12 (2016).
  18. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility preservation in women. Nat Rev Endocrinol. 9 (12), 735-749 (2013).
  19. Cabeza, J. P., Gambini, A. Advancements and challenges in in vitro reproductive technologies for the conservation of equine species. Theriogenology Wild. 2, 100036(2023).
  20. Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reprod Fertil. 2 (1), 35-46 (2021).
  21. Zhang, J., et al. An ex vivo ovulation system enables the discovery of novel ovulatory pathways and nonhormonal contraceptive candidates. Biol Reprod. 108 (4), 629-644 (2023).
  22. Gal, A., Gedye, K., Craig, Z. R., Ziv-Gal, A. Propylparaben inhibits mouse cultured antral follicle growth, alters steroidogenesis, and upregulates levels of cell-cycle and apoptosis regulators. Reprod Toxicol. 89, 100-106 (2019).
  23. Zhou, H., Shikanov, A. Three-dimensional hydrogel-based culture to study the effects of toxicants on ovarian follicles. Methods Mol Biol. 1758, 55-72 (2018).
  24. Silber, S. J., Goldsmith, S., Castleman, L., Hayashi, K. In vitro maturation, in vitro oogenesis, and ovarian longevity. Reprod Sci. 31 (5), 1234-1245 (2024).
  25. Tian, C., et al. Functional oocytes derived from granulosa cells. Cell Rep. 29 (13), 4256-4267 (2019).
  26. Zolfaghar, M., et al. Wharton's jelly derived mesenchymal stem cells differentiate into oocyte like cells in vitro by follicular fluid and cumulus cells conditioned medium. Heliyon. 6 (10), e04992(2020).
  27. Psathaki, O. E., et al. Ultrastructural characterization of mouse embryonic stem cell-derived oocytes and granulosa cells. Stem Cells Dev. 20 (12), 2205-2215 (2011).
  28. Malik, H. N., Singhal, D. K., Saini, S., Malakar, D. Derivation of oocyte-like cells from putative embryonic stem cells and parthenogenetically activated into blastocysts in goat. Sci Rep. 10 (1), 10086(2020).
  29. Saitou, M., Miyauchi, H. Gametogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).
  30. Saitou, M., Hayashi, K. Mammalian in vitro gametogenesis. Science. 374 (6563), eaaz6830(2021).
  31. Yoshino, T., et al. Generation of ovarian follicles from mouse pluripotent stem cells. Science. 373 (6552), (2021).
  32. Hikabe, O., et al. Reconstitution in vitro of the entire cycle of the mouse female germ line. Nature. 539 (7628), 299-303 (2016).
  33. Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: a comprehensive analysis of key protocol variables. Biol Reprod. 103 (3), 455-470 (2020).
  34. Green, L. J., Shikanov, A. In vitro culture methods of preantral follicles. Theriogenology. 86 (1), 229-238 (2016).
  35. Wycherley, G., Downey, D., Kane, M. T., Hynes, A. C. A novel follicle culture system markedly increases follicle volume, cell number and oestradiol secretion. Reproduction. 127 (6), 669-677 (2004).
  36. Nation, A., Selwood, L. The production of mature oocytes from adult ovaries following primary follicle culture in a marsupial. Reproduction. 138 (2), 247-255 (2009).
  37. Xiao, S., Zhang, J., Romero, M. M., Smith, K. N., Shea, L. D., Woodruff, T. K. In vitro follicle growth supports human oocyte meiotic maturation. Sci Rep. 5 (1), 17323(2015).
  38. Converse, A., Zaniker, E. J., Amargant, F., Duncan, F. E. Recapitulating folliculogenesis and oogenesis outside the body: encapsulated in vitro follicle growth. Biol Reprod. 108 (1), 5-22 (2022).
  39. Tomaszewski, C. E., DiLillo, K. M., Baker, B. M., Arnold, K. B., Shikanov, A. Sequestered cell-secreted extracellular matrix proteins improve murine folliculogenesis and oocyte maturation for fertility preservation. Acta Biomater. 132, 313-324 (2021).
  40. Kreeger, P. K., Deck, J. W., Woodruff, T. K., Shea, L. D. The in vitro regulation of ovarian follicle development using alginate-extracellular matrix gels. Biomaterials. 27 (5), 714-723 (2006).
  41. Xu, Y., Duncan, F. E., Xu, M., Woodruff, T. K. Use of an organotypic mammalian in vitro follicle growth assay to facilitate female reproductive toxicity screening. Reprod Fertil Dev. 28 (9), 1295-1306 (2015).
  42. West, E., Shea, L., Woodruff, T. Engineering the follicle microenvironment. Semin Reprod Med. 25 (4), 287-299 (2007).
  43. Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biol Reprod. 84 (4), 689-697 (2011).
  44. Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose. Biol Reprod. 73 (5), 942-950 (2005).
  45. Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Eng. 9 (5), 1013-1021 (2003).
  46. Parrish, E. M., Siletz, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Gene expression in mouse ovarian follicle development in vivo versus an ex vivo alginate culture system. Reproduction. 142 (2), 309-318 (2011).
  47. Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development. Biol Reprod. 75 (6), 916-923 (2006).
  48. Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Secondary follicle growth and oocyte maturation by culture in alginate hydrogel following cryopreservation of the ovary or individual follicles. Biotechnol Bioeng. 103 (2), 378-386 (2009).
  49. Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Mol Hum Reprod. 28 (10), gaac033(2022).
  50. Brito, I. R., et al. Alginate hydrogel matrix stiffness influences the in vitro development of caprine preantral follicles. Mol Reprod Dev. 81 (7), 636-645 (2014).
  51. West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28 (30), 4439-4448 (2007).
  52. Amorim, C. A., Langendonckt, A. V., David, A., Dolmans, M. M., Donnez, J. Survival of human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicular isolation and in vitro culture in a calcium alginate matrix. Hum Reprod. 24 (1), 92-99 (2009).
  53. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12 (10), 2739-2746 (2006).
  54. Thorne, J. T., Segal, T. R., Chang, S., Jorge, S., Segars, J. H., Leppert, P. C. Dynamic reciprocity between cells and their microenvironment in reproduction. Biol Reprod. 92 (1), 25(2015).
  55. Shea, L. D., Woodruff, T. K., Shikanov, A. Bioengineering the ovarian follicle microenvironment. Biomed Eng. 16 (1), 29-52 (2014).
  56. Berkholtz, C., Shea, L., Woodruff, T. Extracellular matrix functions in follicle maturation. Semin Reprod Med. 24 (4), 262-269 (2006).
  57. Zaniker, E. J., Hashim, P. H., Gauthier, S., Ankrum, J. A., Campo, H., Duncan, F. E. Three-dimensionally printed agarose micromold supports scaffold-free mouse ex vivo follicle growth, ovulation, and luteinization. Bioengineering. 11 (7), 719(2024).
  58. Fluks, M., Milewski, R., Tamborski, S., Szkulmowski, M., Ajduk, A. Spindle shape and volume differ in high- and low-quality metaphase II oocytes. Reproduction. 167 (4), (2024).
  59. Tomari, H., et al. Meiotic spindle size is a strong indicator of human oocyte quality. Reprod Med Biol. 17 (3), 268-274 (2018).
  60. Popescu, D. P., et al. Optical coherence tomography: fundamental principles, instrumental designs and biomedical applications. Biophys Rev. 3 (3), 155(2011).
  61. Fang, R., et al. Robotic visible-light optical coherence tomography visualizes segmental Schlemm's canal anatomy and segmental pilocarpine response. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (2), 47(2025).
  62. Kim, D., et al. In vivo quantification of anterior and posterior chamber volumes in mice: implications for aqueous humor dynamics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (1), 18(2025).
  63. ImageJ user guide - IJ 1.46r | Analyze menu. , https://imagej.net/ij/docs/guide/146-30.html#toc-Subsection-30.7 (2012).
  64. Takashima, T., Fujimaru, T., Obata, Y. Effect of in vitro growth on mouse oocyte competency, mitochondria and transcriptome. Reproduction. 162 (4), 307-318 (2021).
  65. Xu, J., Zelinski, M. B. Oocyte quality following in vitro follicle development. Biol Reprod. 106 (2), 291-315 (2021).
  66. Li, A., et al. Nuclear and cytoplasmic quality of oocytes derived from serum-free culture of secondary follicles in vitro. J Cell Physiol. 236 (7), 5352-5361 (2021).
  67. Jin, S. Y., Lei, L., Shikanov, A., Shea, L. D., Woodruff, T. K. A novel two-step strategy for in vitro culture of early-stage ovarian follicles in the mouse. Fertil Steril. 93 (8), 2633-2639 (2010).
  68. Xiao, S., Duncan, F. E., Bai, L., Nguyen, C. T., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Size-specific follicle selection improves mouse oocyte reproductive outcomes. Reproduction. 150 (3), 183-192 (2015).
  69. Pepling, M. E., Sundman, E. A., Patterson, N. L., Gephardt, G. W., Medico, L., Wilson, K. I. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  70. Canning, J., Takai, Y., Tilly, J. L. Evidence for genetic modifiers of ovarian follicular endowment and development from studies of five inbred mouse strains. Endocrinology. 144 (1), 9-12 (2003).
  71. Hirshfeld-Cytron, J. E., Duncan, F. E., Xu, M., Jozefik, J. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Animal age, weight and estrus cycle stage impact the quality of in vitro grown follicles. Hum Reprod. 26 (9), 2473-2485 (2011).
  72. Tingen, C. M., Bristol-Gould, S. K., Kiesewetter, S. E., Wellington, J. T., Shea, L., Woodruff, T. K. Prepubertal primordial follicle loss in mice is not due to classical apoptotic pathways. Biol Reprod. 81 (1), 16-25 (2009).
  73. Wang, H., et al. Rejuvenation of aged oocyte through exposure to young follicular microenvironment. Nat Aging. 4 (9), 1194-1210 (2024).
  74. Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
  75. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), e13259(2020).
  76. Umehara, T., Richards, J. S., Shimada, M. The stromal fibrosis in aging ovary. Aging (Albany NY). 10 (1), 9-10 (2018).
  77. Pietroforte, S., Plough, M., Amargant, F. Age-associated increased stiffness of the ovarian microenvironment impairs follicle development and oocyte quality and rapidly alters follicle gene expression. bioRxiv. , (2024).
  78. McElhinney, K. L., Rowell, E. E., Laronda, M. M. Encapsulation of bovine primordial follicles in rigid alginate does not affect growth dynamics. Bioengineering. 11 (7), 734(2024).
  79. Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. FASEB J. 21 (14), 4005-4012 (2007).
  80. Sosa, E., et al. Reconstituted ovaries self-assemble without an ovarian surface epithelium. Stem Cell Rep. 18 (11), 2190-2202 (2023).
  81. Rogers, H. B., et al. Dental resins used in 3D printing technologies release ovo-toxic leachates. Chemosphere. 270, 129003(2021).
  82. de Almeida Monteiro Melo Ferraz, M., et al. Potential health and environmental risks of three-dimensional engineered polymers. Environ Sci Technol Lett. 5 (2), 80-85 (2018).
  83. Bomba-Warczak, E. K., et al. Exceptional longevity of mammalian ovarian and oocyte macromolecules throughout the reproductive lifespan. eLife. 13, RP93172(2024).
  84. Rajendran, S., et al. Automatic ploidy prediction and quality assessment of human blastocysts using time-lapse imaging. Nat Commun. 15 (1), 7756(2024).
  85. Bori, L., Meseguer, F., Valera, M. A., Galan, A., Remohi, J., Meseguer, M. The higher the score, the better the clinical outcome: retrospective evaluation of automatic embryo grading as a support tool for embryo selection in IVF laboratories. Hum Reprod. 37 (6), 1148-1160 (2022).
  86. Merces, G. O. T., Kennedy, C., Lenoci, B., Reynaud, E. G., Burke, N., Pickering, M. The incubot: a 3D printer-based microscope for long-term live cell imaging within a tissue culture incubator. HardwareX. 9, e00189(2021).
  87. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
  88. Pernodet, N., Maaloum, M., Tinland, B. Pore size of agarose gels by atomic force microscopy. Electrophoresis. 18 (1), 55-58 (1997).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Micromoldes de agarosacultivo sin andamiosfol culos ov ricosmoldes impresos en 3Dim genes de lapso de tiempofol culos secundarios multicapafabricaci n de moldes de siliconafoliculog nesis in vitrotomograf a de coherencia ptica
Producción y uso de moldes de agarosa personalizables para cultivo de folículos ováricos de ratón sin andamios
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.