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Artículo de método

Modelo de glioma circulante para investigaciones de terapia de células T con receptor de antígeno quimérico

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DOI:

10.3791/68881

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17 de octubre de 2025

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1School of Chemistry and Chemical Engineering, Southeast University, 2Department of Immunology, Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province, Gusu School, Nanjing Medical University, 3Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Neurosurgery, The Affiliated Brain Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Clinical Laboratory Medicine, Children's Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El presente protocolo establece un modelo de glioma circulante por inyección de ventrículo lateral para investigar el efecto terapéutico de la terapia de células T con receptores de antígeno quimérico in vivo.

Resumen

Las células tumorales circulantes en el líquido cefalorraquídeo (LCR) son un factor importante en la recurrencia tumoral y la metástasis intracraneal en el glioma. Muchos estudios intentan identificar estrategias efectivas para atacar y eliminar el tumor circulante en el LCR. La terapia de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) se ha utilizado con frecuencia para varios tumores circulantes. Sin embargo, la investigación es limitada debido a la falta de un modelo adecuado de glioma circulante. Aquí, se desarrolló un modelo de glioma circulante y se aplicó en investigaciones de terapia de células T con CAR. Este modelo se construyó utilizando la inyección de ventrículo lateral, que se usa ampliamente en el tratamiento local de la enfermedad intracraneal. Las células de glioma se inyectaron en el ventrículo lateral para formar el tumor primario intracraneal. Los tumores que se desprendieron del ventrículo lateral se usaron para indicar el tumor circulante en el LCR. El modelo es fácil de construir y se puede aplicar en varios estudios sobre la terapia de células T con CAR del glioma circulante. Como resultado, el modelo de glioma circulante proporciona un modelo único de metástasis de glioma para estudios efectivos de terapia de células T con CAR del tumor circulante.

Introducción

El glioma es el tumor cerebral maligno primario más común en adultos 1,2. Los tratamientos actuales, que incluyen cirugía, radioterapia y quimioterapia, muestran una eficacia limitada, con una mediana de supervivencia de solo 14-15 meses 3,4,5. Las células de glioma circulantes en el LCR juegan un papel crucial en la recurrencia tumoral y la metástasis intracraneal 6,7. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar estrategias de tratamiento más efectivas para eliminar las células de glioma circulantes.

Las investigaciones recientes sobre el glioma se han centrado principalmente en los tumores primarios intracraneales 8,9. Sin embargo, el problema más importante que debe abordarse en la clínica es cómo atacar y eliminar las células de glioma circulantes. Por lo tanto, los estudios sobre el glioma circulante antes o después de la cirugía necesitan más atención. La terapia de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) es la estrategia más común utilizada en estudios sobre células tumorales circulantes10,11. Sin embargo, debido a la estructura anatómica especial de los tumores intracraneales, es difícil desarrollar un modelo de glioma circulante adecuado, que es fundamental para el estudio del glioma circulante 12,13,14,15,16.

Este estudio ha generado un modelo único de glioma circulante basado en la inyección de ventrículo lateral. En este modelo, las células de glioma se inyectan en el ventrículo lateral, y el tumor primario intracraneal y el tumor circulante en el LCR se detectan mediante imágenes bioluminiscentes in vivo y análisis de citometría de flujo en el día 10. La terapia CAR-T se inició cuando la carga tumoral en los ratones modelo de glioma circulante alcanzó aproximadamente 6,5 × 105p/s. La carga tumoral se controló cada 5 días para evaluar el efecto terapéutico de las células CAR-T. Este modelo imita el estado de descamación de células tumorales de los pacientes con glioma y se puede utilizar en varios estudios sobre el glioma circulante.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales en este estudio fueron aprobados y supervisados por la Junta de Revisión Institucional y el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Nanjing (IACUC-1905048). Para el presente estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6J, de 6 a 8 semanas de edad. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de animales

  1. Aloja a los ratones en una barrera, ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h, temperatura ambiente de 24 °C y humedad relativa del 50% en jaula.
  2. Pesar los ratones y anestesiarlos (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente) con una inyección intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódico y 10 mg/kg de xilacina17.
    NOTA: La combinación de pentobarbital sódico y xilacina se usa ampliamente en los procedimientos de inyección estereotáxica de ratón. La anestesia adecuada se confirmó por la falta de respuesta a un pellizco en el dedo del pie, lo que aseguró que el animal estuviera completamente inconsciente antes de la cirugía. Para prevenir la sequedad y el daño de la córnea, se aplicó ungüento oftálmico veterinario en los ojos durante la anestesia.
  3. Retire el pelo de la cabeza de un ratón con una afeitadora de animales de laboratorio y fije la cabeza y las extremidades del ratón en el aparato estereotáxico.
  4. Esterilice la cabeza del ratón con el yodóforo con un hisopo de algodón y cubra el resto del cuerpo del ratón con la toalla quirúrgica estéril.
  5. Corta el cuero cabelludo aproximadamente 1 cm a lo largo de la línea media en la parte superior de la frente derecha con un bisturí.
    NOTA: Todos los instrumentos quirúrgicos deben esterilizarse adecuadamente antes de su uso para prevenir infecciones. Se debe tener cuidado de manipular los instrumentos con precaución para evitar lesiones, y todos los procedimientos deben realizarse en un ambiente estéril.
  6. Ajuste la pinza nasal y la varilla para los oídos, asegurándose de que la diferencia de altura del eje Z entre la sutura lambda y el bregma sea menor o igual a 0,05 mm.

2. Construcción del modelo de glioma circulante

  1. Marque el punto 1,5 mm al lado derecho de la línea media y 1,1 mm al lado posterior del bregma con un hisopo de algodón humedecido con violeta de genciana (coordenadas: AP -1,1 mm, ML -1,5 mm del bregma).
  2. Usando un taladro craneal en miniatura con un diámetro de 0,5 mm, taladre agujeros en las coordenadas objetivo para exponer la duramadre.
  3. Enjuague con solución salina para eliminar los restos óseos.
  4. Extraiga 5 μL de suspensión de células tumorales con una microjeringa con tapón limitante de profundidad (GL261-Luc-Gfp, 1×105 células/μL en PBS que contiene 0,1% de BSA).
  5. Inserte la aguja a una velocidad de 0,2 mm/s a una profundidad de 3,0 mm y vuelva a colocar la aguja 0,5 mm, haga una pausa de 10 s para estabilizar la presión del tejido.
  6. Inyecte células a 1 μL/min utilizando una bomba de microinyección calibrada, con un tiempo de permanencia de 10 min después de la inyección para minimizar el reflujo.
  7. Retire la microjeringa lentamente, aplique presión en el lugar de la inyección con un hisopo de algodón estéril durante 30-60 s.
  8. Suturar el cuero cabelludo con sutura quirúrgica absorbible (6-0) y volver a desinfectar la incisión con yodóforo.
  9. Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica a 37 °C controlada con precisión para recalentarlo y controlar su estado de salud.
  10. Regrese al ratón a una jaula limpia después de demostrar un reflejo de enderezamiento sostenido y locomoción espontánea.
  11. Obtener imágenes del ratón con un sistema de imágenes bioluminiscentes in vivo (IVIS Spectrum) para detectar el tumor trasplantado en el décimo día después de la portadora del tumor.
  12. Inyectar al ratón por vía intraperitoneal con sal de D-luciferina potásica (150 mg/kg).
    NOTA: Diluya la sal de potasio D-Luciferina usando D-PBS estéril.
  13. Induzca la anestesia con isoflurano al 2% en 1 L / min O2 durante el período de espera de 10 minutos.
    NOTA: El isoflurano debe usarse en una campana química ventilada para minimizar la exposición a los vapores anestésicos. Esto es para garantizar la seguridad tanto de los animales como de los investigadores durante el procedimiento.
  14. Mantenga la anestesia al 1,5% de isoflurano a través del cono de la nariz.
  15. Realice imágenes bioluminiscentes utilizando el IVIS Spectrum.
  16. Realice la recolección de LCR perforando la cisterna cerebelomedular en el ratón.
    NOTA: El LCR se recolectó mediante punción de la cisterna cerebelomerebelosa en ratones bajo anestesia con isoflurano. Todos los procedimientos, incluida la anestesia, la exposición quirúrgica y la recolección de muestras, se realizaron en condiciones de SPF para minimizar la contaminación y el riesgo de infección. Los ratones se colocaron en posición prona sobre un marco estereotáxico y la cisterna magna se expuso cuidadosamente bajo un microscopio de disección. Se utilizó una aguja de jeringa Hamilton de 27 G para perforar la cisterna y recoger el LCR mediante una técnica a mano alzada. Se obtuvieron aproximadamente 5-10 μL de LCR claro de cada ratón. Para reducir aún más el riesgo de infección, el sitio quirúrgico se esterilizó con yodóforo antes de la punción y todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizaron en autoclave. Después de la recolección del LCR, el sitio de punción se comprimió suavemente con algodón estéril para detener cualquier fuga de líquido. Luego, los ratones se colocaron en una almohadilla térmica y se monitorearon continuamente hasta que se recuperaron por completo de la anestesia. Se administraron analgésicos postoperatorios para aliviar las molestias. Los animales fueron observados diariamente durante al menos tres días consecutivos para garantizar la ausencia de síntomas neurológicos o signos de infección.
  17. Realizar citometría de flujo para detectar células tumorales en LCR. La población de GFP+ representa células tumorales.
    NOTA: La línea celular de glioma murino GL261 ha sido diseñada para transportar la luciferasa (Luc). Cuando el valor de fluorescencia alcanza ~5 × 105células tumorales p/sand en el LCR, el procedimiento es exitoso. El software de imágenes utilizado fue Living Image 4.5.2 y los parámetros de imagen se establecieron en luminiscente.
  18. Seleccione los ratones con tumores exitosos para evaluar la eficacia terapéutica de las células CAR-T.

3. Tratamiento del glioma circulante mediante inyección de células CAR-T en el ventrículo lateral

  1. Cuando el tamaño del tumor en los ratones modelo de glioma circulante se convierte en ~ 6.5 × 105 p / s, seleccione estos ratones para el tratamiento con CAR-T.
  2. Pese los ratones modelo de glioma circulante y anestesia a los ratones con una inyección intraperitoneal de 50 mg / kg de pentobarbital sódico y 50 mg / kg de xilacina.
  3. Repita el proceso de los pasos 1.3 a 1.5.
  4. Separe el cuero cabelludo y el cráneo, y señale con precisión el orificio de perforación realizado durante la construcción del modelo de glioma circulante y siga el procedimiento mencionado en los pasos 2.2-2.3.
  5. Aspire 10 μL de suspensión de células CAR-T con una microjeringa, inserte con cuidado la aguja en el ventrículo lateral del ratón, ajuste la profundidad de inyección con el aparato estereotáctico y administre lentamente la solución de células CAR-T.
    NOTA: De acuerdo con la inyección de células GL261, las células CAR-T se inyectaron en el ventrículo lateral derecho (coordenadas: AP -1,1 mm, ML -1,5 mm del bregma), con una profundidad de inyección de 2,5 mm.
  6. Mantenga la aguja durante 10 minutos, luego retire lentamente la aguja y presione ligeramente el punto de inyección con una gasa estéril para evitar cualquier sangrado después de completar la inyección. Suturar el cuero cabelludo con sutura quirúrgica absorbible (6-0) y desinfectar la incisión.
  7. Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica a 37 °C controlada con precisión para recalentarlo y controlar su estado de salud.
  8. Regrese al ratón a una jaula limpia después de demostrar un reflejo de enderezamiento sostenido y locomoción espontánea.
  9. Realizar imágenes bioluminiscentes in vivo para monitorear el crecimiento de tumores en ratones. Las imágenes ópticas permiten evaluar la eficacia terapéutica de las células CAR-T.
  10. Pese los ratones cada dos días y realice imágenes BLI cada 5 días para realizar un seguimiento más preciso del crecimiento del tumor hasta que se alcance el punto final terminal.
  11. Eutanasia al ratón y fije el tejido cerebral en paraformaldehído al 4% durante 24-48 h.
  12. Incruste los tejidos en parafina y seccionarlos en rodajas de 5 μm de grosor.
  13. Desparafinar las secciones, rehidratar a través de alcoholes graduados, teñir con hematoxilina, contrateñir con eosina y montar las secciones con un cubreobjetos.
    NOTA: Para el presente estudio, el punto final terminal fue el día 30, y los ratones fueron sacrificados por una sobredosis de pentobarbital sódico con una inyección intraperitoneal. Los cadáveres de ratones fueron entregados al Centro Médico de Animales Experimentales de la Universidad Médica de Nanjing para su eliminación. Las agujas desechadas se colocaron en un recipiente para objetos punzantes y se entregaron al Departamento de Gestión de Equipos y Laboratorios de la Universidad Médica de Nanjing para su eliminación centralizada.

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Resultados

El diagrama esquemático del modelo de glioma circulante para la terapia CAR-T se muestra en la Figura 1. Las células CAR-T se inyectaron en el ventrículo lateral con una microjeringa para demostrar su efecto terapéutico. Este método permite la entrega directa de las células CAR-T al cerebro, dirigiéndose a las células de glioma circulantes. El procedimiento de inyección se realizó el día 11, luego de la implantación de células GL261 en el ventrículo lateral d...

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Discusión

El modelo de glioma circulante establecido en este estudio mediante inyección de ventrículo lateral proporciona un avance significativo, ofreciendo varias ventajas sobre los modelos existentes. La técnica de inyección de ventrículo lateral es altamente reproducible, lo que permite un modelado tumoral consistente en un período de tiempo relativamente corto. Esto lo convierte en una herramienta valiosa para los investigadores que buscan investigar la diseminación de células tumorales en el...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82230059), el Programa Provincial de Desarrollo de Investigación Clave de Jiangsu de China (BE2022770).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sutura quirúrgica absorbibleShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdR611
CAR-TLaboratorios Creativos de Biolabs
D-Luciferina sal de potasioMCEHY-12591B
GL261-Luc-GFPShanghái Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd.ZQ0932
Sistema de imágenes bioluminiscentes in vivoTanonTanon ABL X6
Afeitadora para animales de laboratorioBiotecnología BeyotimeFS600
RatónInstalación Animal Core de la Universidad Médica de Nanjing
Bomba de microinyecciónRWDReferencia R462
MicrojeringaHamilton87943
Mini taladro cranealRWD78001
Pentobarbital sódico ChemSrc57-33-0
Aparato estereotáxicoRWD68043
XilacinaChemSrc7361-61-7

Referencias

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