Este estudio examina las variaciones circadianas en la liberación del factor de crecimiento de la fibrina rica en plaquetas (PRF) y explora las correlaciones con los niveles de cortisol, con el objetivo de optimizar el momento de los procedimientos regenerativos basados en PRF.
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Artículo de investigación
Evaluación de la variación circadiana en los factores de crecimiento de la fibrina rica en plaquetas: un estudio piloto
En este artículo
Resumen
Resumen
La fibrina rica en plaquetas (PRF) tiene amplias aplicaciones clínicas en odontología, particularmente en la regeneración de tejidos blandos y duros, la cicatrización del alveolo de extracción, el tratamiento de defectos periodontales, el aumento de senos paranasales y los procedimientos mucogingivales. PRF es un biomaterial rico en factores de crecimiento derivado de plaquetas preparado mediante un protocolo de centrifugación de un solo paso. Este estudio tuvo como objetivo evaluar si los factores de crecimiento derivados de PRF exhiben variación circadiana entre las horas de la mañana y la tarde. Participaron veinte voluntarios sanos, cada uno de los cuales proporcionó seis muestras de sangre venosa, tres a las 08:00 y tres a las 20:00. A partir de cada punto de tiempo, se utilizó un tubo para el hemograma completo, uno para el análisis de cortisol sérico y otro para la preparación de PRF (centrifugado a 708 x gdurante 12 min). Los factores de crecimiento (IGF-1, PDGF, FGFR, VEGF, TGFβ-1) en PRF se midieron a las 24 h y 72 h mediante ELISA. Sus niveles se compararon entre puntos de tiempo y se correlacionaron con los niveles séricos de cortisol. Los niveles de FGFR fueron significativamente más altos a las 72 h que a las 24 h en las muestras nocturnas. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas para IGF-1, PDGF, VEGF o TGFβ-1 entre la mañana y la noche. Los niveles de cortisol se correlacionaron negativamente con PDGF a las 72 h en las muestras de la mañana y con IGF-1 a las 72 h en las muestras de la tarde; sin embargo, no se observaron otras correlaciones significativas. Estos hallazgos sugieren que el momento de la recolección de sangre no influye significativamente en el contenido del factor de crecimiento PRF, lo que indica flexibilidad en los protocolos clínicos con respecto al momento de la muestra.
Introducción
La fibrina rica en plaquetas (PRF) es un concentrado de plaquetas de segunda generación comúnmente utilizado en odontología regenerativa debido a su origen autólogo, facilidad de preparación y contenido biológicamente activo1. Formado por centrifugación de sangre total sin anticoagulantes, PRF proporciona una matriz de fibrina rica en plaquetas y leucocitos que secretan factores de crecimiento como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento transformante-beta 1 (TGF-β1), el factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFr). Estas biomoléculas desempeñan un papel central en la proliferación celular, la angiogénesis, la remodelación de la matriz extracelular y la regeneración de tejidos2. En comparación con el plasma rico en plaquetas (PRP), que requiere anticoagulantes y activación exógena, el PRF se produce a través de un proceso libre de anticoagulantes de un solo paso que produce un andamio fisiológico de fibrina con leucocitos y plaquetas atrapados. Esta arquitectura admite una liberación más lenta y sostenida de factores de crecimiento y citocinas, lo que puede mejorar la estabilidad de la herida y la reparación temprana del tejido al tiempo que reduce la complejidad y el costode manejo 1,2. Además, la ausencia de anticoagulantes y activadores minimiza la variabilidad relacionada con la manipulación y puede preservar mejor el comportamiento plaquetario nativo, ofreciendo ventajas prácticas para el uso en el consultorio y la estandarización entre los operadores2.
A pesar de su uso clínico generalizado, la dinámica temporal de los componentes bioactivos de PRF sigue siendo poco conocida. El ritmo circadiano, un ciclo biológico intrínseco de 24 horas, influye en varios sistemas fisiológicos, incluida la función inmune, la secreción de hormonas y los parámetros hematológicos 3,4. El cortisol, la principal hormona circadiana, alcanza su punto máximo temprano en la mañana y disminuye gradualmente a lo largo del día5. Es importante destacar que los estudios han demostrado que la actividad plaquetaria, la capacidad de agregación y el recuento también pueden ser modulados por mecanismos circadianos, con implicaciones para la coagulación y la cicatrización de heridas6.
Dado que la PRF se deriva directamente de la sangre periférica, el momento circadiano de la recolección de sangre podría afectar potencialmente el estado de activación plaquetaria y la posterior liberación de factores de crecimiento durante la polimerización de la fibrina. Aunque las variaciones diurnas en los recuentos de plaquetas y los factores de crecimiento en el plasma rico en plaquetas fueron analizadas previamente por Aoto et al.7, no existen estudios que examinen sistemáticamente si el PRF preparado en diferentes momentos del día exhibe diferencias medibles en la composición de su factor de crecimiento. Por lo tanto, este estudio piloto tiene como objetivo investigar la variación circadiana de los factores de crecimiento derivados de PRF comparando muestras recolectadas por la mañana y por la noche de individuos sanos. Además, evaluamos los niveles séricos de cortisol en cada punto de tiempo y exploramos sus correlaciones con la liberación del factor de crecimiento PRF. Comprender dicha variabilidad temporal puede ayudar a optimizar los protocolos clínicos y contribuir a la estandarización de los tratamientos regenerativos basados en PRF. La hipótesis nula de este estudio fue que el momento circadiano de la recolección de sangre no influye significativamente en la concentración de factores de crecimiento liberados por la fibrina rica en plaquetas (PRF); sin embargo, con base en la regulación circadiana conocida de la actividad plaquetaria y la secreción hormonal, inicialmente se planteó la hipótesis de que el momento de la recolección de sangre (mañana versus noche) puede alterar el contenido del factor de crecimiento PRF. Desde una perspectiva clínica, aclarar si el contenido del factor de crecimiento PRF es sensible a la variación circadiana es importante para la estandarización de los protocolos regenerativos. Si la liberación del factor de crecimiento se mantiene en gran medida estable a lo largo del día, los médicos pueden estar seguros de que el momento de la venopunción puede no afectar sustancialmente los resultados del tratamiento, lo que permite flexibilidad en la programación de los procedimientos. Por el contrario, si surgen diferencias sutiles en factores seleccionados, como los involucrados en la angiogénesis o la reparación de tejidos, el momento de la recolección de sangre podría optimizarse en los casos en que se desea el máximo potencial regenerativo, por ejemplo, en condiciones de curación comprometidas.
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Protocolo
Este estudio se realizó en el Departamento de Periodoncia de la Facultad de Odontología de la Universidad de Çukurova, Adana, Turquía, con la participación de 20 voluntarios sanos. Antes de la inclusión, todos los participantes fueron informados sobre el objetivo, la metodología y los procedimientos del estudio, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito. La aprobación ética fue otorgada por el Comité de Ética de Investigación Clínica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Çukurova (Aprobación No: 125/55, Fecha: 16.09.2022). Todos los procedimientos, incluidas las directrices esenciales de bioseguridad para el manejo de sangre humana y las instrucciones de eliminación de desechos para materiales biopeligrosos y reactivos químicos, se realizaron de acuerdo con las directrices de los NIH-CDC8. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Selección de participantes
Los participantes incluidos en el estudio fueron individuos sanos entre 18 y 25 años de edad, sin ninguna enfermedad sistémica conocida, y que demostraron una cooperación adecuada durante los procedimientos. Se excluyeron los individuos que tenían alguna afección sistémica, estaban embarazadas o amamantando, o estaban usando algún medicamento o agente hormonal que pudiera afectar los parámetros hematológicos u hormonales.
2. Extracción de sangre y asignación de grupos
Se recogieron un total de seis muestras de sangre venosa de 10 ml de cada participante, tres por la mañana (08:00) y tres por la tarde (20:00). En el estudio se utilizaron tubos estériles de PRF de vidrio sin aditivos (10 ml). En la sesión de la mañana, se utilizó el tubo 1 para el hemograma completo (CBC), el tubo 2 para el análisis de cortisol sérico y el tubo 3 para la preparación de PRF seguido de un análisis del factor de crecimiento. En la sesión de la noche, se utilizó el tubo 4 para el hemograma, el tubo 5 para el análisis de cortisol sérico y el tubo 6 para la preparación de PRF y el análisis del factor de crecimiento. Según el momento de la extracción de sangre, las muestras se asignaron en dos grupos: el grupo 1 consistió en PRF puro preparado a partir de sangre de la mañana (08:00) y el grupo 2 consistió en PRF puro preparado a partir de sangre de la tarde (20:00).
3. PRF preparación
Las muestras de sangre se centrifugaron a 708 x g durante 12 min a temperatura ambiente utilizando una centrífuga equipada con un rotor de ángulo fijo de 40° y tubos de vidrio de 10 ml. El dispositivo utilizado tenía un radio de rotor ajustable entre 88 mm y 110 mm; En este estudio, se seleccionó un radio de 88 mm para estandarizar el protocolo. No se utilizaron anticoagulantes durante el procedimiento. Después de la centrifugación, los PRF resultantes se evaluaron macroscópicamente para garantizar una formación adecuada, que se caracteriza por una superficie lisa y homogénea, una forma elástica y cilíndrica y una consistencia compacta y firme.
4. Análisis ELISA del factor de crecimiento
Los coágulos de PRF se separaron cuidadosamente de la capa de glóbulos rojos con tijeras estériles. Se pesó cada coágulo y se agregó medio de cultivo RPMI-1640 en una proporción de 1:1 basada en el peso (g = ml) para estandarizar el entorno de incubación en todas las muestras y garantizar una difusión constante de los factores de crecimiento solubles de la matriz PRF. Esta relación permite una extracción proporcional basada en el tamaño del coágulo, minimizando la variabilidad en las concentraciones del factor de crecimiento debido a masas desiguales del coágulo. Las muestras se incubaron en un agitador orbital a 100 rpm y 3 °C durante 24 h y 72 h para promover la difusión uniforme de los factores de crecimiento de la matriz PRF al medio de cultivo. Después de la incubación, los sobrenadantes se recolectaron y almacenaron a -8 ° C hasta el análisis. Las concentraciones de factores de crecimiento se cuantificaron utilizando kits comerciales de ELISA, incluidos FGFR, VEGF, IGF-1, PDGF y TGF-β1, siguiendo el protocolo de preparación del fabricante 9,10.
5. Pasos de ELISA
Se agregaron estándares y muestras (100 μL cada una) a los pocillos y se incubaron a 3 °C durante 90 min. Luego, los pozos se lavaron tres veces con tampón de lavado. A continuación, se añadieron 100 μL de anticuerpo marcado con biotina a cada pocillo y se incubaron a 3 °C durante 60 min, seguidos de tres lavados adicionales. Luego, se agregaron 100 μL de solución de peroxidasa de rábano picante (HRP) y se incubaron a 3 °C durante 30 min. Después de otros tres lavados, se agregaron 100 μL de reactivo de sustrato y se incubaron durante 15 min. Finalmente, se agregaron 50 μL de solución de parada a cada pocillo y se midió la absorbancia a 450 nm.
6. Análisis estadístico
Las variables categóricas se expresaron como frecuencias y porcentajes, mientras que los datos numéricos se presentaron como media ± desviación estándar o mediana (mínimo-máximo), según correspondiera. La normalidad de las variables numéricas se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Las variables que no cumplían con el supuesto de normalidad, específicamente las concentraciones de factores de crecimiento y los niveles de cortisol, se analizaron mediante pruebas no paramétricas, incluida la prueba de rango con signo de Wilcoxon para comparaciones pareadas y el coeficiente de correlación de rango de Spearman para asociaciones. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software IBM SPSS Statistics. Un valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo. Todas las comparaciones se realizaron dentro del sujeto al control para la variabilidad interindividual.
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Resultados
Los 20 participantes voluntarios (10 mujeres y 10 hombres, con edades comprendidas entre los 18 y los 25 años) completaron el estudio sin pérdida de muestra. Los resultados del hemograma completo confirmaron que los parámetros plaquetarios y hematológicos estaban dentro de los rangos normales de referencia en todas las muestras, validando la confiabilidad de las preparaciones de PRF.
Comparación de parámetros sanguíneos entre la mañana y la noche
Los niveles de cortisol fue...
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Discusión
Con base en la regulación circadiana conocida de la actividad plaquetaria y la secreción hormonal, inicialmente se planteó la hipótesis de que el momento de la recolección de sangre (mañana o noche) puede alterar el contenido del factor de crecimiento PRF. Este estudio tuvo como objetivo probar si existe tal variación temporal y, de ser así, si se correlaciona con los niveles séricos de cortisol y los parámetros hematológicos. El estudio fue diseñado como una investigación pilot...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| MÁQUINA CENTRÍFUGA | DÚO | 913023410238 | |
| ELISA KITS | Prueba fina, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | IGF-1 (Nº de catálogo:EH0165) | |
| ELISA KITS | Prueba fina, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | PDGF (Nº de catálogo:EH3531) | |
| ELISA KITS | Prueba fina, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | FGFR (Nº de catálogo:EH0715) | |
| ELISA KITS | Prueba fina, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | VEGF (Nº de catálogo:EH0327) | |
| ELISA KITS | Prueba fina, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | TGF-β 1 (Número de catálogo: EH0287) | |
| Tubos PRF |  | 6370 |
Referencias
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