Una evaluación cuantitativa de la fagocitosis de eritrocitos alogénicos y xenogénicos por macrófagos de rata in vitro

Resumen

Este trabajo describe un protocolo estandarizado in vitro para cuantificar y comparar las tasas de fagocitosis de glóbulos rojos xenogénicos (humanos) y alogénicos (rata) por macrófagos de rata aislados.

Resumen

El trasplante de células xenogénicas a menudo enfrenta un rechazo inmunológico significativo, incluso en modelos animales inmunodeficientes. Entre los componentes inmunes residuales, los macrófagos pueden fagocitar activamente las células humanas trasplantadas, lo que representa un desafío para el injerto a largo plazo. Para abordar esto, desarrollamos un ensayo in vitro estandarizado para cuantificar la fagocitosis mediada por macrófagos de glóbulos rojos (RBC) humanos versus ratas. Los macrófagos peritoneales de rata se aislaron, cultivaron y expusieron a glóbulos rojos humanos o de rata. Los glóbulos rojos humanos se identificaron utilizando CD235a, mientras que los glóbulos rojos de rata se marcaron previamente con DeepRed. El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando CD163 para identificar la exclusión de macrófagos y yodo propido (PI) para las células vivas de puerta. Los resultados mostraron una diferencia sustancial en la actividad fagocítica: el 5,08% de los macrófagos engullieron glóbulos rojos humanos, mientras que solo el 1,59% fagocitaron glóbulos rojos de rata, lo que arrojó un índice de fagocitosis relativo de 3,21. Este protocolo permite la evaluación cuantitativa de la compatibilidad inmunitaria y ofrece un método reproducible para evaluar las respuestas inmunitarias innatas en xenotrasplantes. Tiene potencial para refinar la selección de donantes-receptores y guiar estrategias inmunosupresoras en la investigación traslacional.

Introducción

El uso del trasplante de células xenogénicas, en particular el injerto de células humanas en modelos animales, es una estrategia esencial en la investigación biomédica¹. Permite la evaluación de la supervivencia celular, el injerto y las respuestas inmunitarias en un entorno controlado in vivo . Si bien los modelos de ratón han dominado históricamente este campo debido a su genética bien caracterizada y facilidad de manipulación, su pequeño tamaño presenta una limitación significativa en estudios que requieren grandes volúmenes de sangre o altos rendimientos celulares. Por el contrario, las ratas ofrec....

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las políticas y procedimientos éticos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Jiangsu (UJS-IACUC) (Aprobación no. UJS-IACUC-2021090102). Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Afiliado de la Universidad de Jiangsu. Todas las muestras se recolectaron de pacientes que habían dado su consentimiento informado. El sobrenadante eliminado debe colocarse en un tanque de líquido residual dedicado y entregarse al departamento de enfermedades infecciosas del hospital.

Resultados

A través del análisis de citometría de flujo, podemos inferir la tasa de fagocitosis de macrófagos de rata hacia glóbulos rojos humanos y glóbulos rojos de rata. Las células muertas se excluyen primero usando PI. Los macrófagos CD163 positivos que expresan CD235a positivos indican la fagocitosis de los glóbulos rojos humanos. La proporción de macrófagos que han fagocitado hRBC se define como la tasa de fagocitosis de los macrófagos de rata hacia los glóbulos rojos humanos. La proporción .......

Discusión

Este estudio estableció un ensayo in vitro robusto y reproducible para evaluar la fagocitosis mediada por macrófagos de glóbulos rojos xenogénicos y alogénicos. En este estudio, los glóbulos rojos humanos se marcaron con CD235a-BV421, mientras que los glóbulos rojos de rata se tiñeron con el tinte DeepRed. Cuando los macrófagos fagocitan los glóbulos rojos marcados, los anticuerpos conjugados (CD235a-BV421) o el colorante (DeepRed) se internalizan juntos. Como resultado, los pro.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,05% Tripsina-EDTA	ThermoFisher	25300062
Rastreador de Células Rojas Profundas	ThermoFisher	C34565	El polvo (15 & mu; g) fue disuelta en DMSO (20 & mu; L)
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma	D2650
Suero Salino Tamponado con Fosfato de Dulbecco (DPBS)	ThermoFisher	C10010500BT
Ficoll-Paque PLUS	Cytiva	17144002
Ficoll-Paque PREMIUM	Cytiva	17544602
Anticuerpo antihumano CD235a BV421 del ratón	BD Biociencias	562938
Anticuerpo FITC Antiratón CD163	BIO-RAD	MCA342F
Proteína K	Sigma	P2308
RPMI 1640	ThermoFisher	11875093