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Artículo de método

Una evaluación cuantitativa de la fagocitosis de eritrocitos alogénicos y xenogénicos por macrófagos de rata in vitro

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DOI:

10.3791/68904

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22 de agosto de 2025

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1Institute of Regenerative Medicine, and Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Jiangsu University, 2Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Large Animal Models for Biomedicine, and South China Institute of Large Animal Models for Biomedicine, School of Pharmacy and Food Engineering, Wuyi University, 4State Key Laboratory of Cell Biology, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, 5Innovation and Transformation Center, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 6Prometheus RegMed Tech Ltd, 7Department of Medicinal and Life Sciences, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Tokyo University of Science

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este trabajo describe un protocolo estandarizado in vitro para cuantificar y comparar las tasas de fagocitosis de glóbulos rojos xenogénicos (humanos) y alogénicos (rata) por macrófagos de rata aislados.

Resumen

El trasplante de células xenogénicas a menudo enfrenta un rechazo inmunológico significativo, incluso en modelos animales inmunodeficientes. Entre los componentes inmunes residuales, los macrófagos pueden fagocitar activamente las células humanas trasplantadas, lo que representa un desafío para el injerto a largo plazo. Para abordar esto, desarrollamos un ensayo in vitro estandarizado para cuantificar la fagocitosis mediada por macrófagos de glóbulos rojos (RBC) humanos versus ratas. Los macrófagos peritoneales de rata se aislaron, cultivaron y expusieron a glóbulos rojos humanos o de rata. Los glóbulos rojos humanos se identificaron utilizando CD235a, mientras que los glóbulos rojos de rata se marcaron previamente con DeepRed. El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando CD163 para identificar la exclusión de macrófagos y yodo propido (PI) para las células vivas de puerta. Los resultados mostraron una diferencia sustancial en la actividad fagocítica: el 5,08% de los macrófagos engullieron glóbulos rojos humanos, mientras que solo el 1,59% fagocitaron glóbulos rojos de rata, lo que arrojó un índice de fagocitosis relativo de 3,21. Este protocolo permite la evaluación cuantitativa de la compatibilidad inmunitaria y ofrece un método reproducible para evaluar las respuestas inmunitarias innatas en xenotrasplantes. Tiene potencial para refinar la selección de donantes-receptores y guiar estrategias inmunosupresoras en la investigación traslacional.

Introducción

El uso del trasplante de células xenogénicas, en particular el injerto de células humanas en modelos animales, es una estrategia esencial en la investigación biomédica1. Permite la evaluación de la supervivencia celular, el injerto y las respuestas inmunitarias en un entorno controlado in vivo . Si bien los modelos de ratón han dominado históricamente este campo debido a su genética bien caracterizada y facilidad de manipulación, su pequeño tamaño presenta una limitación significativa en estudios que requieren grandes volúmenes de sangre o altos rendimientos celulares. Por el contrario, las ratas ofrecen varias ventajas, incluida una mayor masa corporal, una mayor relevancia fisiológica para los sistemas humanos y un mayor rendimiento de muestras biológicas como sangre o macrófagos peritoneales2. En consecuencia, los modelos de rata se utilizan cada vez más en estudios que involucran investigación hematopoyética y del sistema inmunológico3.

Uno de los principales desafíos en el trasplante xenogénico es el rechazo inmunológico. Incluso en modelos inmunodeficientes donde las células T, las células B o las células NK están ablacionadas genéticamente, las células inmunitarias innatas residuales, particularmente los macrófagos, permanecen funcionalmente activas4. Los macrófagos sirven como defensores de primera línea del sistema inmunológico del huésped, reconociendo y eliminando células extrañas a través de la fagocitosis5. Este proceso está regulado en parte por la interacción entre la proteína reguladora de señales alfa (SIRPα) en los macrófagos y CD47, una señal de "no me comas" expresada en la mayoría de los tipos de células. Cuando el SIRPα de roedores no reconoce el CD47 de las células humanas, este desajuste puede dar lugar a una fagocitosis mejorada. Incluso en estos animales inmunodeficientes permisivos, este fenómeno también existe 6,7.

La cuantificación de la fagocitosis mediada por macrófagos en este contexto es fundamental para evaluar la probabilidad de supervivencia celular y para optimizar las estrategias de trasplante8. Aunque se han desarrollado varios métodos in vivo y ex vivo para evaluar el rechazo inmunológico, los ensayos in vitro estandarizados para la fagocitosis de macrófagos siguen siendo limitados. Los métodos tradicionales basados en microscopía a menudo requieren mucha mano de obra y carecen de rigor cuantitativo. La citometría de flujo, por el contrario, ofrece un ensayo basado en una sola célula y una plataforma cuantitativa capaz de distinguir con precisión los tipos de células y medir la absorción fagocítica a través de la detección de marcadores de superficie.

En este artículo, desarrollamos un ensayo in vitro estandarizado para evaluar la fagocitosis diferencial de glóbulos rojos humanos y de rata por macrófagos peritoneales de rata. Los glóbulos rojos sirven como un modelo ideal para los ensayos de fagocitosis debido a su estructura simple y expresión de CD47, que actúa como una señal "propia" para inhibir la depuración mediada por macrófagos9. En este protocolo, los macrófagos peritoneales de rata se recolectan mediante lavado peritoneal, se cultivan in vitro y se exponen a glóbulos rojos humanos o glóbulos rojos alogénicos de rata marcados con DeepRed. Después de la coincubación, se utiliza la citometría de flujo para evaluar la internalización de los glóbulos rojos por los macrófagos. Los macrófagos se identifican por la expresión de CD163, los glóbulos rojos humanos por CD235a y los glóbulos rojos de rata por fluorescencia DeepRed. Las células muertas se excluyen mediante tinción PI, lo que garantiza que solo se analicen macrófagos viables.

Este enfoque permite una evaluación cuantitativa precisa de la actividad fagocítica de los glóbulos rojos alogénicos y xenogénicos in vitro, lo que proporciona información sobre el alcance de la depuración inmune mediada por macrófagos. En nuestros experimentos, los macrófagos de rata demostraron una fagocitosis significativamente mayor de los glóbulos rojos humanos (5,08%) en comparación con los glóbulos rojos de rata (1,59%), lo que arrojó un índice de fagocitosis relativo de 3,21. Estos resultados subrayan la importancia de los mecanismos inmunitarios innatos en entornos xenogénicos y resaltan el valor de este ensayo en la validación del modelo preclínico.

En conclusión, el protocolo presentado aquí ofrece un método reproducible y eficiente para medir la fagocitosis de macrófagos in vitro. Es particularmente útil para los investigadores que trabajan en los campos de xenotrasplantes, investigación con células madre hematopoyéticas y pruebas de compatibilidad inmunológica. Al proporcionar un marco estandarizado para la cuantificación de la fagocitosis, este ensayo puede contribuir a mejorar la reproducibilidad experimental y a mejorar la comprensión de las respuestas inmunitarias innatas en modelos de trasplante entre especies.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las políticas y procedimientos éticos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Jiangsu (UJS-IACUC) (Aprobación no. UJS-IACUC-2021090102). Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Afiliado de la Universidad de Jiangsu. Todas las muestras se recolectaron de pacientes que habían dado su consentimiento informado. El sobrenadante eliminado debe colocarse en un tanque de líquido residual dedicado y entregarse al departamento de enfermedades infecciosas del hospital.

1. Aislamiento de macrófagos

  1. Preparación: Prepare los materiales necesarios, incluidas ratas experimentales, recipientes de anestesia, vasos de precipitados e isoflurano como anestésico, y enfríe previamente la centrífuga a 4 ° C.
  2. Anestesiar y sacrificar a las ratas: Siguiendo las pautas institucionales de cuidado de animales, eutanasia a las ratas después de inhalar anestesia excesiva con isoflurano.
  3. Desinfección con alcohol: Coloque la rata sacrificada en un vaso de precipitados y agregue una cantidad suficiente de etanol al 75% para cubrir completamente la rata. Remojar durante 10 min.
  4. Inyección y mezcla de líquido abdominal: Desinfecte el abdomen de la rata e inyecte 50 ml de PBS estéril helado en la cavidad abdominal a lo largo de la línea media con una jeringa.
    1. Agite suavemente la rata y masajee la pared abdominal con los dedos para asegurar una mezcla completa del líquido en la cavidad abdominal. Masajear durante 2-3 minutos.
  5. Recolección del líquido abdominal: Haga una pequeña incisión en la pared abdominal de la rata, incline ligeramente el cuerpo y aspire el líquido abdominal con una jeringa.
  6. Centrifugación: Centrifugar el fluido recogido a 500 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
  7. Lisis de glóbulos rojos: Agregue 3-5 veces el volumen de pellets celulares del tampón de lisis de glóbulos rojos y mezcle suavemente durante 1-2 minutos.
    NOTA: Por ejemplo, si el volumen de sedimentos celulares es de 1 ml, agregue 3-5 ml de tampón de lisis. Este paso se puede realizar a temperatura ambiente o a 4 °C, seguido de centrifugación a 400-500 x g durante 5 min. La centrifugación a 4 °C es más efectiva. Debido a la presión osmótica, los glóbulos rojos se lisarán y la solución se volverá roja. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante rojo.
    1. Receta de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC): Disuelva 8,3 g de NH4Cl, 1,0 g de KHCO3 y 1,8 ml de EDTA al 5% en 800 ml de H2O destilado, y esterilice con filtro a través de un filtro de 0,2 μm, cs a 1000 ml con H2O destilado, y ajuste el pH 7,2 ~ 7,4. Si el precipitado rojo aún es visible, repita este paso hasta que la solución se vuelva clara y transparente. Por lo general, una pequeña cantidad de glóbulos rojos residuales no afecta los ensayos posteriores (si hay pocos glóbulos rojos en el sedimento, se puede omitir este paso).
  8. Lavado de celdas: Lave las celdas dos veces con aproximadamente 10 ml de medio RPMI 1640 preenfriado. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C cada vez y desechar el sobrenadante.
  9. Resuspensión y recuento celular: Vuelva a suspender las células en un medio preenfriado que consiste en RPMI 1640 + 1 % FBS + 1 % PS, cuente las células mediante tinción con azul de tripano y evalúe la viabilidad celular.
  10. Cultivo celular: Si se requiere cultivo, siembre las células a una densidad de 1 × 106/ml en una placa de cultivo de 24 pocillos, con 1 ml de medio RPMI 1640-10% FBS-1% PS por pocillo. Después de 2 h de incubación, reemplace el medio y lave los pocillos 1-2 veces con medio RPMI 1640 para eliminar las células no adherentes.
    NOTA: Las células adherentes formarán una monocapa de macrófagos. Si se necesita extracción de ARN, agregue 1 ml de Trizol al gránulo celular, pipetee varias veces para interrumpir las células y transfiera la mezcla a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para la extracción inmediata de ARN o guárdela a -80 °C. Para el análisis FACS, ajuste el recuento de células a 1 × 106 por tubo, agregue 20 μL de tampón FACS y continúe con la tinción FACS. Tampón FACS: DPBS + 2% FBS, esterilizar con filtro a través de un filtro de 0,22 μm, almacenado a 4 °C).

2. Recolección de glóbulos rojos en ratas o humanos

  1. Preparación: Enjuague previamente los tubos de centrífuga de 15 ml y las jeringas de 10 ml con heparina.
  2. Recolección de sangre de corazón de rata: Después de anestesiar y sacrificar a la rata, corte con cuidado una pequeña sección de la cola de la rata con unas tijeras y recolecte sangre de la vena de la cola.
  3. Recolección de sangre humana: Recolecte sangre humana mediante la técnica de venopunción.
  4. Mezcla de muestras de sangre: Mezclar 1 ml de PBS con 1 ml de sangre venosa humana o sangre de rata.
  5. Separación en gradiente de densidad de Ficoll: Agregue 1,5 ml de solución de Ficoll con una densidad de 1,077 a un tubo de centrífuga de 15 ml para sangre periférica humana; agregue 1,5 ml de solución de Ficoll con una densidad de 1,084 a un tubo de centrífuga de 15 ml para sangre de rata.
  6. Estratificación de muestras de sangre: Coloque lentamente las muestras de sangre diluidas a lo largo de la pared del tubo de centrífuga sobre la solución de gradiente de densidad correspondiente.
  7. Centrifugación: Centrifugar a 400 x g durante 30 min a una temperatura de 18-20 °C.
  8. Eliminación de capas de plasma y linfocitos: Elimine la capa superior de plasma, la capa de linfocitos y la capa de solución de Ficoll, dejando solo la capa inferior de glóbulos rojos.
  9. Lavado de glóbulos rojos: Lave los glóbulos rojos una vez con 10 ml de PBS.
  10. Centrifugación y eliminación del sobrenadante: Centrifugar a 400 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
  11. Resuspensión y recuento celular: Agregue 1 ml de medio RPMI 1640 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, mezcle con una cantidad adecuada de gránulos de glóbulos rojos y realice el recuento celular.

3. Ensayo de fagocitosis in vitro

  1. Aislamiento y cultivo de macrófagos: Aísle los macrófagos y siembre a una densidad de 1 × 106 células/pocillo en una placa de cultivo de 12 pocillos. Incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 2 h para permitir que las células se adhieran.
  2. Eliminación de células no adherentes: Después de 2 h de incubación, retire con cuidado las células no adherentes y lave suavemente con medio RPMI 1640.
  3. Cultivo continuo: Continúe cultivando los macrófagos adherentes hasta por 2 h para asegurar una adhesión completa al fondo de la placa de cultivo.
  4. Tratamiento de inanición: Después de 2 h, reemplace el medio con RPMI 1640 sin suero e incube en condiciones de inanición durante 2 h para mejorar la actividad fagocítica de los macrófagos.
  5. Adición de células humanas: Agregue células humanas preteñidas con DeepRed a la placa de cultivo e incube a 37 ° C con 5% de CO2 durante 2 h para permitir que los macrófagos fagociten las células humanas.
  6. Conclusión y análisis: Después del ensayo de fagocitosis, observe la actividad fagocítica bajo un microscopio o cuantifique mediante citometría de flujo (FACS).

4. Citometría de flujo

  1. Preparación celular: Digerir las células con tripsina-EDTA al 0,05% y detener la digestión utilizando el medio RPMI 1640 que contiene un 10% de FBS. Centrifugar las células, desechar el sobrenadante, volver a suspender las células en el tampón FACS y contarlas. Prepare 1 × 106 celdas por tubo en dos tubos. Además, prepare un tubo de glóbulos rojos humanos y un tubo de glóbulos rojos de rata.
  2. Preparación del tubo de tinción única: agregue el anticuerpo CD163 anti-rata de ratón a un tubo de muestra, el anticuerpo CD235a anti-humano de ratón al tubo de glóbulos rojos humanos y DeepRed al tubo de glóbulos rojos de rata.
    1. Incube estos tubos en hielo, protegidos de la luz, durante 30 min, mezclando cada 10 min. Agregue 1 ml de tampón FACS para eliminar los anticuerpos no unidos, centrifugue y deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 500 μL de tampón FACS.
  3. Preparación de la muestra: Agregue CD163 anti-rata de ratón, anticuerpos CD235a anti-humanos de ratón y DeepRed a los tubos de muestra. Incubar sobre hielo, protegido de la luz, durante 30 min, mezclando cada 10 min. Agregue 1 ml de tampón FACS a cada tubo de muestra para eliminar los anticuerpos no unidos, centrifugar y eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 500 μL de tampón FACS.
  4. Análisis: Excluir la adhesión celular mediante activación en FSC-H versus FSC-A. Utilice los tubos de tinción única para ajustar la configuración adecuada de voltaje y compensación antes de analizar las muestras (Figura 1). Analice los datos con el software FlowJo v10.8.1.
    NOTA: Se utilizaron controles de tinción única CD163-FITC y PI para establecer la compensación.

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Resultados

A través del análisis de citometría de flujo, podemos inferir la tasa de fagocitosis de macrófagos de rata hacia glóbulos rojos humanos y glóbulos rojos de rata. Las células muertas se excluyen primero usando PI. Los macrófagos CD163 positivos que expresan CD235a positivos indican la fagocitosis de los glóbulos rojos humanos. La proporción de macrófagos que han fagocitado hRBC se define como la tasa de fagocitosis de los macrófagos de rata hacia los glóbulos rojos humanos. La proporción ...

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Discusión

Este estudio estableció un ensayo in vitro robusto y reproducible para evaluar la fagocitosis mediada por macrófagos de glóbulos rojos xenogénicos y alogénicos. En este estudio, los glóbulos rojos humanos se marcaron con CD235a-BV421, mientras que los glóbulos rojos de rata se tiñeron con el tinte DeepRed. Cuando los macrófagos fagocitan los glóbulos rojos marcados, los anticuerpos conjugados (CD235a-BV421) o el colorante (DeepRed) se internalizan juntos. Como resultado, los pro...

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Divulgaciones

JYG es asesor científico de Prometheus RegMed Tech Ltd. Los autores de izquierda declaran no tener ningún conflicto de intereses potencial.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a la Sra. Mei Fang, la Sra. Min Ma, la Sra. Yu-Tong Meng y el Sr. Quan-Kai Lei por sus contribuciones iniciales. Esta investigación fue financiada en parte por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82270697), el Proyecto de Planificación de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Guangdong de China (2021B1212040016), la Fundación de Investigación Básica Básica y Aplicada de Guangdong (2023A1515012574), la Unidad de Cultivo de Disciplinas Médicas Clave Provinciales de Jiangsu (JSDW202229) y el Fondo de Innovación del Ecosistema Celular del Laboratorio Haihe (HH24KYZX0008), la Fundación China para el Emprendimiento y el Empleo Juvenil -Incaier Public Welfare Fondo (HH25KYHX0003).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,05% Tripsina-EDTAThermoFisher25300062
Rastreador de Células Rojas ProfundasThermoFisher  C34565El polvo (15 & mu; g) fue disuelta en DMSO (20 & mu; L)
Dimetilsulfóxido (DMSO)SigmaD2650
Suero Salino Tamponado con Fosfato de Dulbecco (DPBS)ThermoFisherC10010500BT
Ficoll-Paque PLUSCytiva17144002
Ficoll-Paque PREMIUMCytiva17544602
Anticuerpo antihumano CD235a BV421 del ratónBD Biociencias562938
Anticuerpo FITC Antiratón CD163BIO-RADMCA342F
Proteína KSigmaP2308
RPMI 1640ThermoFisher11875093

Referencias

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  2. Szpirer, C. Rat models of human diseases and related phenotypes: A novel inventory of causative genes. Mamm Genome. 33 (1), 88-90 (2022).
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