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Ensayo de toxicidad para el desarrollo basado en el monitoreo en tiempo real de la interrupción de la señal del factor de crecimiento de fibroblastos en células madre pluripotentes inducidas por humanos

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DOI:

10.3791/68910

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10 de octubre de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Engineering, Yokohama National University, 2Division of Cellular & Molecular Toxicology, Center for Biological Safety & Research, National Institute of Health Sciences, 3Health and Medical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 4Kanagawa Institute of Industrial Science and Technology (KISTEC)

En este artículo

Resumen

En este estudio, presentamos un ensayo celular in vitro para identificar sustancias químicas teratogénicas. La dinámica de la señalización del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) / factor de respuesta sérica (SRF) se midió en células reporteras pluripotentes inducidas (iPS) humanas, y el riesgo de teratogenicidad se evaluó cuantificando la interrupción química de esta vía de señalización.

Resumen

La toxicidad para el desarrollo (Devtox) se evalúa típicamente en modelos animales. Sin embargo, existen desafíos para garantizar la precisión, como falsos negativos debido a diferencias entre especies y preocupaciones éticas con respecto al bienestar animal. Por lo tanto, existe la necesidad de nuevos sistemas de prueba para evaluar Devtox humano y ayudar a abordar estos problemas. Planteamos la hipótesis de que los teratógenos interrumpen las vías de señalización relacionadas con Devtox esenciales para la morfogénesis, independientemente de sus objetivos moleculares. Para probar esta hipótesis, desarrollamos un sistema reportero del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) utilizando células madre pluripotentes inducidas humanas (iPS). Este sistema permite cuantificar la interrupción de la señal causada por productos químicos, logrando una tasa de precisión del 83% para compuestos teratogénicos y no teratogénicos conocidos. Debido a que la actividad de señalización de Devtox cambia con el tiempo, es importante capturar su dinámica continuamente en lugar de medir en un solo punto final. El uso de un sistema de medición de luminiscencia en tiempo real es opcional, pero mejora la resolución temporal con menos trabajo. Toda la prueba se puede completar en 1 semana, desde la siembra de células en una placa de cultivo hasta la adquisición de datos de luminiscencia.

Introducción

Algunos productos químicos causan toxicidad para el desarrollo (Devtox), incluidos retrasos en el crecimiento, malformaciones, déficits funcionales y muerte1. La evaluación de Devtox es esencial para garantizar la seguridad de los productos farmacéuticos y pesticidas2. Los ensayos actuales de Devtox generalmente se basan en múltiples modelos animales. Sin embargo, debido a las diferencias entre especies, los modelos animales tienen limitaciones inherentes al extrapolar los resultados a los humanos3. La talidomida, un conocido tóxico para el desarrollo, se recetó por primera vez a mujeres embarazadas a fines de la década de 1950 para aliviar las náuseas matutinas. Aunque no se observó teratogenicidad en roedores, se notificaron malformaciones graves de las extremidades en recién nacidos humanos en todo el mundo. Esta tragedia puso de relieve las limitaciones de las pruebas de seguridad en animales e impulsó los esfuerzos internacionales para introducir y revisar las directrices de prueba de Devtox4. Además, existen preocupaciones relacionadas con el bienestar animal, así como con el tiempo y el costo sustanciales requeridos para las pruebas con animales. Por lo tanto, se necesitan ensayos in vitro alternativos que puedan predecir con precisión el Devtox humano5.

Aquí, proponemos un ensayo in vitro para evaluar los tóxicos del desarrollo basados en la interrupción de las vías de señalización que son críticas para el desarrollo embrionario 6,7,8. El ensayo se realiza utilizando células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) modificadas genéticamente para expresar la luciferasa NanoLuc (Nluc), un gen reportero luminiscente, bajo el control del elemento de respuesta sérica (SRE). El SRE es el sitio de unión del factor de respuesta sérica (SRF), un factor de transcripción en la vía de señalización del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). SRF integra señales de múltiples ligandos y regula la expresión de más de 200 genes que juegan un papel esencial en diversos procesos biológicos, incluido el desarrollo embrionario9.

En este ensayo, las células indicadoras se expusieron a una sustancia problema y se estimularon con FGF para activar la señalización y amplificar cualquier interferencia de la sustancia química. Una característica clave de este ensayo es capturar la dinámica de la actividad de señalización a medida que cambia la intensidad de la luminiscencia. Debido a que la actividad de señalización varía con el tiempo, las mediciones de punto final en un solo punto de tiempo pueden ser inexactas10. De hecho, las mediciones en siete puntos de tiempo durante un período de 24 horas demostraron una precisión predictiva mejorada, con un valor de área bajo la curva (AUC) de 0,837.

Las sustancias problema pueden aplicarse en una amplia gama de concentraciones, desde 0,01 ng/ml hasta 1000 μg/ml, dependiendo de la citotoxicidad y la solubilidad. Se requieren aproximadamente 1.4 × 104 celdas para sembrar una sola placa de 96 pocillos. Una limitación de este ensayo es que las sustancias químicas teratogénicas pueden no ser detectables si actúan a través de objetivos no expresados en células iPS humanas indiferenciadas. Además, es posible que este ensayo no capture metabolitos teratogénicos. Además, no proporciona información sobre los mecanismos detallados que subyacen a la toxicidad teratogénica ni sobre sus resultados específicos.

El uso de un sistema de monitoreo de luminiscencia en tiempo real mejora aún más la resolución del tiempo, reduce la mano de obra requerida para mediciones continuas y minimiza los artefactos de la manipulación repetida de placas de cultivo. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el ensayo Devtox basado en la interrupción de la señal. Todo el procedimiento se puede completar en una semana. Este enfoque se puede automatizar, lo que lo hace adecuado para el cribado químico y contribuye a reducir las pruebas con animales.

Protocolo

En este estudio se utilizaron células iPS humanas (201B7), con el gen Nluc bajo el control de un elemento de respuesta sérica (SRE) golpeado en el locus del Sitio de Integración de Virus Adenoasociados 1 (AAVS1) utilizando el sistema CRISPR-Cas9 (Figura 1A). Los detalles de la edición de genes para células reporteras (células iPS humanas knocked-knocked-SRE-Nluc) se han informado en otros lugares6. El protocolo se divide principalmente en tres pasos: 1) un ensayo de citotoxicidad de un producto químico para determinar su concentración máxima de exposición, 2) pruebas de interrupción de la señal y 3) análisis de datos.

Para minimizar la influencia de la evaporación del medio, realice todos los experimentos de cultivo celular utilizando los 60 pocillos centrales de una placa de 96 pocillos y agregue agua a los pocillos más externos y a los espacios entre pocillos. Cubra la placa con una película de sellado permeable al gas durante la incubación para reducir aún más la evaporación.

1. Preparación celular

  1. Cultivo de células reporteras durante al menos 2 semanas después de descongelar el caldo congelado. Mantenga las células en un programa de repetición de 7 días y use células de día 7 para el ensayo. Optimice la densidad de siembra a ~ 80% de confluencia el día del paso.
  2. Siembre células individuales a 2,0 × 105 células/pocillo en una placa de seis pocillos recubierta de ECM con 2 ml de medio de mantenimiento fresco suplementado con un inhibidor de ROCK de 10 μM.
  3. Después de 24 h, reemplace el medio con 2 ml / pocillo de medio de mantenimiento fresco.
  4. A las 72 h, recolecte las células utilizando un reactivo de disociación a base de enzimas para obtener una suspensión unicelular. Sembrar a 1,0 × 105 células/pocillo en una placa de seis pocillos recubierta de ECM con 2 ml de medio de mantenimiento fresco suplementado con inhibidor de ROCK de 10 μM.
  5. Después de 24 h, reemplace el medio con 4 ml / pocillo de medio de mantenimiento fresco.
  6. Después de 96 h, recolecte las células como una suspensión unicelular utilizando un reactivo de disociación basado en enzimas. Utilice estas celdas para el ensayo informador.

2. Ensayo de citotoxicidad

  1. Prueba preliminar
    1. Siembre células individuales a 2,0 × 104 células/pocillo en una placa de 96 pocillos recubierta de ECM con 200 μL de medio de mantenimiento fresco suplementado con un inhibidor de ROCK de 10 μM. Selle la placa con una película permeable al gas.
    2. A las 24 h, sustituya el medio por 200 μl/pocillo de medio de mantenimiento nuevo y vuelva a sellar la placa con una película permeable al gas.
    3. A las 72 h, sustituya el medio por 100 μl/pocillo de medio de ensayo y vuelva a sellar la placa con una película permeable al gas.
    4. A las 96 h, reemplace el medio con 100 μL / pocillo de medio de ensayo.
      NOTA: Si no se logra una confluencia del 100%, suspenda el ensayo. Debido a que la tasa de crecimiento puede variar según la línea celular, optimice la densidad de siembra para garantizar una confluencia completa el día del ensayo.
    5. Disolver la sustancia problema en un medio de ensayo hasta su máxima solubilidad.
      NOTA: Cuando se usa dimetilsulfóxido (DMSO) como solvente, la concentración final de DMSO no debe exceder el 0.1%.
    6. Preparar una dilución en serie de cinco puntos y cinco veces de la sustancia problema en medio de ensayo utilizando la solución del paso 2.1.5.
    7. Agregue 11 μl/pocillo de las soluciones químicas del paso 2.1.6. Para el control del vehículo, agregue 11 μL/pocillo de medio de ensayo que contenga la misma concentración de DMSO.
    8. Después de 48 h, incubar las placas a 25 °C durante 30 min.
    9. Agregue 111 μl/pocillo de reactivo de ensayo de viabilidad celular luminiscente basado en ATP preequilibrado a 25 °C. Para el blanco, preparar un pocillo que contenga 111 μl de medio de ensayo y 111 μl del reactivo.
    10. Agite la placa a 300 rpm durante 2 minutos con un agitador de microplacas.
    11. Transfiera 200 μL de la mezcla a una placa negra para la medición de la luminiscencia. Incubar las placas a 25 °C durante 10 min.
    12. Mida la intensidad de la luminiscencia para estimar el recuento de células.
    13. Calcule la viabilidad celular utilizando la siguiente fórmula:
      Viabilidad celular (%) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100
      NOTA: Determine los pasos posteriores en función de la viabilidad celular. Si la viabilidad es del >50% en todas las concentraciones probadas, continúe con el Paso 2.2 con la concentración máxima de solubilidad. Si la viabilidad supera el 50% dentro del rango probado, proceda a la prueba de determinación utilizando la concentración más alta con viabilidad >50%. Si la viabilidad es del <50% en todas las concentraciones, repita la prueba preliminar a partir de una concentración más baja.
  2. Prueba de determinación
    1. Siembre células individuales a 2,0 × 104 células/pocillo en una placa de 96 pocillos recubierta de ECM con 200 μL de medio de mantenimiento fresco suplementado con un inhibidor de ROCK de 10 μM. Selle la placa con una película permeable al gas.
    2. A las 24 h, sustituya el medio por 200 μl/pocillo de medio de mantenimiento nuevo y vuelva a sellar la placa con una película permeable al gas.
    3. A las 72 h, sustituya el medio por 100 μl/pocillo de medio de ensayo y vuelva a sellar la placa con una película permeable al gas.
    4. A las 96 h, reemplace el medio con 100 μL / pocillo de medio de ensayo.
      NOTA: Si no se logra una confluencia del 100%, suspenda el ensayo. Optimice la densidad de siembra para garantizar una confluencia completa el día 4.
    5. Disolver la sustancia problema en un medio de ensayo de acuerdo con los resultados del ensayo preliminar (paso 2.1).
    6. Preparar una dilución en serie de nueve puntos y dos veces de la sustancia problema en medio de ensayo utilizando la solución del paso 2.2.5.
    7. Añadir 11 μl/pocillo de las soluciones químicas del paso 2.2.6. Para el control del vehículo, agregue 11 μL/pocillo de medio de ensayo que contenga la misma concentración de DMSO.
    8. Después de 48 h, incubar las placas a 25 °C durante 30 min.
    9. Agregue 111 μl/pocillo de reactivo de ensayo de viabilidad celular luminiscente basado en ATP preequilibrado a 25 °C. Para el blanco, preparar un pocillo que contenga 111 μl de medio de ensayo y 111 μl del reactivo.
    10. Agite la placa a 300 rpm durante 2 minutos con un agitador de microplacas.
    11. Transfiera 200 μL de la mezcla a una placa negra para la medición de la luminiscencia. Incubar las placas a 25 °C durante 10 min.
    12. Mida la intensidad de la luminiscencia para estimar el recuento de células.
    13. Calcule la viabilidad celular utilizando la siguiente fórmula:
      Viabilidad celular (%) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100
    14. Genere una curva de dosis-respuesta utilizando datos de nueve concentraciones y calcule el IC50 a partir de la curva.

3. Ensayo de reportero en tiempo real (Figura 1B)

  1. Siembre células individuales a 2,0 × 104 células/pocillo en una placa de 96 pocillos recubierta de ECM con 200 μL de medio de mantenimiento fresco suplementado con inhibidor de ROCK de 10 μM. Selle la placa con una película permeable al gas.
  2. A las 24 h, sustituya el medio por 200 μl/pocillo de medio de mantenimiento nuevo y vuelva a sellar la placa con una película permeable al gas.
  3. A las 72 h, sustituya el medio por 100 μl/pocillo de medio de ensayo y vuelva a sellar la placa con una película permeable al gas.
  4. A las 96 h, reemplace el medio con 100 μL / pocillo de medio de ensayo que contenga un 1% de sustrato luminiscente.
    NOTA: Si no se logra una confluencia del 100%, suspenda el ensayo. Debido a que la tasa de crecimiento puede variar según la línea celular, optimice la densidad de siembra para garantizar la confluencia completa el día 4.
  5. Disolver la sustancia problema en un medio de ensayo a la concentración determinada en la sección 2.
  6. Preparar una dilución en serie doble de ocho puntos de la sustancia problema en un medio de ensayo, a partir de la solución preparada en la fase 3.5.
  7. Dos horas después del intercambio de medio en el Paso 3.4, agregue 11 μL/pocillo de las soluciones químicas del Paso 3.6. Para el control del vehículo, agregue 11 μL/pocillo de medio de ensayo que contenga la misma concentración de DMSO.
  8. Una hora después de comenzar la exposición química (Paso 3.7), agregue 12 μL/pocillo de medio de ensayo que contenga bFGF hasta una concentración final de 2 ng/mL.
  9. Mida la luminiscencia de forma continua durante 48 h utilizando un sistema de medición de luminiscencia en tiempo real bajo una atmósfera humidificada, 5% CO2 a 37 °C.
    NOTA: Establezca el tiempo 0 en el punto de adición de FGF (ver Figura 1B).

4. Análisis de datos (Figura 1C)

  1. Calcular el cambio log2 veces (LogFC) de la intensidad de la luminiscencia normalizando el grupo de ensayo al control del vehículo:
    LogFC = log2(Luc_sample / Luc_vehicle)
  2. Integre LogFC en la serie temporal de 48 h para estimar el área entre las curvas (ABC) para los grupos de prueba y control del vehículo.
  3. Suma de los valores ABC de todas las concentraciones para cuantificar el alcance global de la perturbación de la señal causada por la sustancia problema.
  4. Realice un análisis de la curva de características operativas del receptor (ROC) para determinar el umbral para la clasificación de Devtox.

Resultados

En nuestra experiencia, la morfología celular es útil para determinar si un ensayo se ha realizado correctamente. La Figura 2A muestra imágenes típicas de microscopía confocal de células inmediatamente antes y después de la exposición química. Al final del ensayo, casi toda la superficie de los pocillos está cubierta por células. La Figura 2B muestra imágenes de tinción de células vivas/muertas. El número de células muertas teñidas con yoduro de propidio (PI) aumenta después de la exposición química; sin embargo, la viabilidad celular es de al menos el 50% y casi todas las células están teñidas con calceína-AM.

En la Tabla 1 se enumeran las sustancias problema utilizadas en nuestros estudios anteriores 7,8. Estos estudios demuestran que los productos químicos Devtox se pueden distinguir con mayor precisión en función de la interrupción de la señal FGF en células iPS humanas. Un hallazgo clave es que el monitoreo continuo de la actividad de señalización es fundamental porque cambia dinámicamente con el tiempo. El uso de un sistema de medición de luminiscencia en tiempo real proporciona una resolución de tiempo considerablemente mayor con menos trabajo de medición. Aquí, describimos un protocolo que utiliza un sistema de monitoreo en tiempo real.

La figura 3A muestra los cambios en la intensidad de la luminiscencia durante 48 h en seis pocillos replicados en las mismas condiciones sin la sustancia problema. Las seis curvas están casi alineadas, lo que indica una buena reproducibilidad de pozo a pozo. Aunque no se identificó claramente en las mediciones manuales de 24 h en nuestros estudios anteriores, dos picos distintos, un pico inicial inmediatamente después de la adición del ligando FGF y un segundo pico aproximadamente a las 24 h, aparecen en mediciones en tiempo real de 48 h. La Figura 3B muestra los cambios en la intensidad de la luminiscencia tras la exposición al ácido valproico (VPA), un conocido tóxico para el desarrollo. El VPA es un inhibidor de la histona desacetilasa que causa defectos en el tubo neural, el corazón y las extremidades¹¹. VPA interrumpe la señalización de FGF de una manera dependiente de la concentración. El sistema automatizado de medición en tiempo real capturó la dinámica de la señal con mayor precisión que las mediciones manuales.

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Figura 1: Ensayo de interrupción de la señal FGF/SRF. (A) Ingeniería genética de células iPS humanas para generar células reporteras de señales FGF / SRF. Se construyó un plásmido que contenía Nluc aguas abajo del elemento de respuesta sérica, brazos homólogos para knock-in dirigido y el gen de resistencia a la puromicina bajo el control del promotor de la fosfoglicerato quinasa humana. Después de la selección de puromicina, se establecieron células reporteras de SRE-Nluc. (B) Cronograma del ensayo. Las células reporteras se sembraron en una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante 4 días para cubrir toda la superficie. El sustrato luminiscente y la sustancia problema se añadieron 3 y 1 h antes de iniciar la medición, respectivamente. El tiempo de adición del ligando FGF se estableció en 0 h y la intensidad de luminiscencia se midió continuamente durante las siguientes 48 h. (C) Análisis de datos. La dinámica de la señal se registró en células expuestas y no expuestas a productos químicos de prueba y se normalizó al control del vehículo para estimar el área entre curvas como el grado de como una medida de la interrupción de la señal causada por un producto químico. Se obtuvieron valores ABC para cada producto químico a diferentes concentraciones y se calculó su suma. El análisis de la curva de características operativas del receptor se realizó utilizando todos los tóxicos conocidos para el desarrollo probados para determinar el umbral. Abreviaturas: iPS = células madre pluripotentes inducidas; RLU = Unidad de luz relativa; AUC = Área bajo la curva; FGF = factor de crecimiento de fibroblastos; SRF = factor de respuesta sérica; SRE = elemento de respuesta sérica; HA = brazo homólogo; L = izquierda; R = derecha; PuroR = gen de resistencia a la puromicina; hPGK = fosfoglicerato quinasa humana; Nluc = NanoLuc luciferasa; ROC = característica de funcionamiento del receptor; ABC = área entre las curvas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Morfología celular y tinción de células vivas/muertas. A) Imágenes microscópicas confocales de las células antes (día 4) y después (día 6) de la exposición a una sustancia problema. Las células restantes que cubren casi toda la superficie de los pocillos después de la prueba son un indicador de una prueba exitosa. La cobertura casi completa del pozo al final del ensayo indica una ejecución exitosa. (B) Tinción de células vivas/muertas antes y después de la exposición a una sustancia problema. Las células vivas se tiñeron de verde con Calceína-AM y las células muertas se tiñeron de rojo con yoduro de propidio (PI). se tiñeron con calceína-AM (verde) y las células muertas con yoduro de propidio (PI, rojo). La proporción de células muertas debe ser menor que < el 50% del total de células. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Ejemplos típicos de dinámica de intensidad de luminiscencia. (A) La luminiscencia del curso temporal cambia el curso del tiempo de la luminiscencia después de la estimulación del ligando FGF, medido utilizando un sistema de medición de luminiscencia en tiempo real. La intensidad de la luminiscencia se monitoreó cada 22 min durante 48 h. Las seis líneas de colores representan señales de diferentes pozos. (B) Comparación de mediciones de luminiscencia manuales y en tiempo real con ácido valproico. Se observó una interrupción de la señal con ambos métodos de medición, mientras que el monitoreo en tiempo real capturó más claramente la señal mejorada en el segundo pico. Abreviaturas: RLU = Unidad de luz relativa; VPA = ácido valproico; FGF = factor de crecimiento de fibroblastos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Sustancia de pruebaAbreviaturaCas NO.Estudio en animales
(estudio previo)		Estudio in vitro
(este estudio)		Suma de valores ABCConcentración máxima
(μg/ml)
ácido trans-retinoicoATRA302-79-4PP65.90.0100
HidroxiureaHU127-07-1PP63.3149
Ácido metoxiacéticoMAA625-45-6PP225683
Cloruro de metilmercurioMeHg115-09-3PP77.71.20
Hidrato de metotrexatoMTX133073-73-1PP80.55.00
Salicilato de sodioSA54-21-7PP38.7666
Ácido valproicoAVA99-66-1PP63.3100
6-Aminonicotinamida6-UNA329-89-5PN24.91.00
Ácido bóricoBA10043-35-3PN24.2250
5-Bromo-2'-desoxiuridinaBrdU59-14-3PP83.950.0
5,5-dimetil-2,4-oxazolidinedionaDMO695-53-4PP50.3840
Cloruro de litioLiCl7447-41-8PN29.8250
5-Fluorouracilo5-FU51-21-8PP92.42.65
Ciclofosfamida monohidratoCPA6055-19-2PN19.1400
Mesilato de imatinibIMA220127-57-1PP42.412.5
LenalidomidaLEN191732-72-6PP94.735.0
PomalidomidaPOM19171-19-8PP50.92.50
TalidomidaTHA50-35-1PP53.312.0
AcrilamidaAcA79-06-01NN37.1454
D-AlcanforLEVA464-49-3NN27.550.0
Clorhidrato de difenhidraminaDHM147-24-0NP68.2262
Ftalato de dimetiloDMP131-11-3NN24.4100
Sal sódica de penicilina GPeng69-57-8NN22.11000
Sacarina sódicaSAC82385-42-0NN34.01000
AcetaminofénAPAP103-90-2NN22.320.0
Trihidrato de amoxicilinaAMX61336-70-7NN28.425.0
CimetidinaCM51481-61-9NN25.330.0
EritromicinaERY114-07-8NN20.015.0
HidroclorotiazidaHCTZ58-93-5NN21.920.0
SulfasalazinaSSZ599-79-1NN30.8100
QuímicoAUCUmbralSensibilidadEspecificidadExactitud
30 sustancias0.81937.90.7780.9170.833

Tabla 1: Productos químicos Devtox y no Devtox clasificados en experimentos con animales y resultados estimados con y sin interrupción de la señal FGF. Abreviaturas: P = positivo (Devtox); N = negativo (no Devtox).

Discusión

El desarrollo embrionario-fetal está estrechamente regulado por redes de señalización12. Si bien la retroalimentación dentro de estas redes proporciona robustez contra el ruido interno y externo, planteamos la hipótesis de que los productos químicos Devtox pueden ejercer efectos más allá de dicha amortiguación. Aquí, presentamos un protocolo para estimar los productos químicos de Devtox basado en la interrupción excesiva de la señalización de FGF / SRF. Este enfoque no proporciona ninguna información sobre los mecanismos moleculares responsables de Devtox, como las proteínas diana de una sustancia química, y se centra solo en la señalización de FGF / SRF. Sin embargo, fue posible clasificar los productos químicos Devtox de manera eficiente, con una precisión del 83% y un AUC de 0,819 (Tabla 1). Esto probablemente se deba a que cada vía de señalización está estrechamente asociada con otras y forma redes de señalización densas, y la interrupción dentro de estas redes da como resultado la interrupción de la señal FGF / SRF.

Se deben abordar varios desafíos técnicos al generar celdas indicadoras. Nluc es aproximadamente 100 veces más brillante que las luciferasas convencionales derivadas de luciérnagas o Renilla, lo que permite un monitoreo continuo a largo plazo de los cambios de señal13. Nluc que contiene la secuencia PEST se utilizó para capturar con mayor precisión la dinámica de la actividad de señalización. La secuencia PEST promueve la degradación de proteínas. Mientras que la proteína Nluc es estable con una vida media de más de 6 h, la etiqueta PEST acelera la degradación a través de la vía ubiquitina-proteasoma, reduciendo su vida media a 10-30 min. Además, el gen reportero fue golpeado en el locus AAVS1, un "puerto seguro" genómico, asegurando que la expresión no se silencie y que los genes esenciales no se interrumpan accidentalmente14.

En la evaluación de los métodos de prueba, es crucial seleccionar productos químicos de referencia para Devtox y no Devtox. Seleccionamos productos químicos de referencia de las listas del estudio de validación internacional ECVAM, las guías ICH S5 (incluida la talidomida) y los estudios en animales7. Enumeramos 30 productos químicos Devtox y no Devtox, pero es necesario agregar y probar más productos químicos de fuentes confiables. Por lo tanto, el umbral ROC (Suma ABC = 37,9) informado aquí debe considerarse preliminar y requerirá validación con un conjunto más grande e independiente de compuestos para garantizar la solidez estadística. La ciclofosfamida (CPA) fue una de las tres sustancias químicas con resultados falsos negativos. La CPA se hidroxila en el hígado a 4-hidroperoxiciclofosfamida, y la CPA y sus productos de degradación son teratogénicos15. Los ensayos in vitro, incluido nuestro enfoque, generalmente no consideran el metabolismo y no pueden detectar sustancias químicas que inducen Devtox a través del metabolismo. Esta es una limitación del enfoque propuesto. Además de los falsos negativos dependientes del metabolismo (p. ej., CPA), también observamos un falso positivo con clorhidrato de difenhidramina (DHM). La evidencia epidemiológica no respalda fuertemente una asociación causal entre DHM y malformaciones congénitas, sin embargo, varios estudios in vitro lo han clasificado como un tóxico para el desarrollo; Esto probablemente contribuyó a su clasificación errónea en nuestro ensayo. Por el contrario, la 6-aminonicotinamida (6-AN) no interrumpió la señalización de FGF/SRF y, por lo tanto, se clasificó erróneamente, lo que sugiere que su mecanismo de toxicidad para el desarrollo puede proceder a través de vías no capturadas por este reportero. Juntos, estos ejemplos respaldan la expansión del panel de ensayos para incluir vías de señalización de desarrollo adicionales para reducir tanto los falsos positivos como los falsos negativos.

Varios factores tienen una gran influencia en este ensayo. Uno de esos factores es la preparación celular antes del ensayo. Para minimizar esto, las células se mantuvieron en un programa de repetición de 7 días para garantizar que las células utilizadas en el ensayo se recolectaran en las mismas condiciones de crecimiento. Las células se siembran el lunes, se pasan el jueves y se usa una porción para el ensayo y se siembra para el siguiente paso. Otro factor es la densidad celular en el momento de la exposición a una sustancia problema. El ensayo se realizó solo cuando las células alcanzaron el 100% de confluencia el día de la exposición química. Los efectos de borde en placas de 96 pocillos son bien conocidos. En este ensayo, solo se utilizaron los 60 pocillos internos de la placa de 96 pocillos para evitar efectos de borde. Además de las consideraciones generales, la variabilidad técnica puede ocurrir durante un ensayo. Un problema común fue la intensidad de luminiscencia inconsistente entre los pozos en el grupo de control del vehículo, que puede haber sido el resultado de una siembra celular desigual o una calidad celular subóptima. Recomendamos mantener las células en aproximadamente un 80% de confluencia para minimizar esta variabilidad y verificar un crecimiento uniforme en los pocillos el día después de la siembra. El ajuste de la densidad de siembra de iPSC también puede mejorar la reproducibilidad del ensayo. Además, la muerte celular excesiva puede conducir a fluctuaciones de luminiscencia no específicas no relacionadas con la señal experimental. Por lo tanto, evalúe la morfología celular al final del ensayo para asegurarse de que las células estén en condiciones adecuadas durante la medición. En los ensayos manuales, la extracción de la placa de la incubadora en cada punto de tiempo expone las células a breves cambios de temperatura y niveles de CO2. Para limitar estas fluctuaciones ambientales, las mediciones deben realizarse de manera rápida y consistente.

Este ensayo se puede realizar manualmente o utilizando un sistema de medición en tiempo real. El enfoque manual no requiere equipos especializados, pero un sistema de medición en tiempo real permite una detección más precisa de la dinámica de la señal. Aunque no se identificó en las mediciones manuales, el sistema de medición en tiempo real capturó claramente dos picos de la señal de luminiscencia. En las mediciones manuales, se produjo una brecha de 12 h en la adquisición de datos durante la noche, lo que puede haber llevado a la subestimación o pérdida del segundo pico. Estos dos picos pueden ser causados por la retroalimentación negativa de la señalización de FGF y la presencia de un ligando de FGF térmicamente estable. En particular, la interrupción de la señal de FGF por un producto químico a veces parecía ser mayor en el segundo pico que en el primer pico (Figura 3B).

Este protocolo representa un enfoque prometedor para el cribado químico de Devtox utilizando un ensayo reportero humano basado en iPSC para evaluar cuantitativamente la interrupción de la señal de FGF. En las últimas décadas se han desarrollado varios ensayos in vitro alternativos para la toxicidad del desarrollo, incluida la prueba de células madre embrionarias de ratón (mEST)16, la prueba de células madre embrionarias basada en Hand1 (Hand1-EST)17 y ReProGlo18. En comparación con estos ensayos convencionales, este método demostró una precisión predictiva superior. En los últimos años, se han introducido estrategias alternativas, como las que emplean células madre embrionarias humanas o embriones de pez cebra, como parte de los esfuerzos internacionales para establecer sistemas de pruebas sin animales. Estos enfoques también han informado de una alta precisión predictiva para las evaluaciones de toxicidad para el desarrollo. Para mejorar aún más el rendimiento de este ensayo, puede ser beneficioso incorporar vías de señalización adicionales involucradas en el desarrollo embrionario. Hay varias otras vías de señalización importantes en la morfogénesis del desarrollo, como Wnt / β-catenina, BMP / SMAD y señalización Hedgehog / GLI19. Las diferentes combinaciones de células indicadoras utilizadas para evaluar estas vías de señalización pueden proporcionar una evaluación más completa de varios productos químicos. El efecto de la etapa de diferenciación de las células iPS, por ejemplo, la etapa más temprana en la que se forman las tres capas germinales, en la sensibilidad de detección de este ensayo será nuestro tema de investigación futuro. Los estudios futuros también pueden explorar la validación entre especies utilizando sistemas de células madre de roedores o conejos para permitir la comparación directa con conjuntos de datos in vivo en esas especies, mientras que nuestro enfoque principal sigue siendo las células iPS humanas para maximizar la relevancia humana.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por JSPS, Japón [números de subvención KAKENHI 23K25021 y 25K03278]; MHLW, Japón [números de subvención del programa 23KD1003 y 24KD1003]; KISTEC, Japón; y AMED, Japón [números de subvención JP23mk0101252 y 25mk0121314].

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo microcentrífuga de 1,5 mLFastGeneFG-MCT015CPreparación química de prueba
Tubo centrífugo de 15 mLVIOLAMO1-3500-21Cultivo celular
Tubo PCR de 8 tirasWatson137-333CPreparación química de prueba
Placa inferior blanca/transparente de 96 pozos, superficie TCThermo Fisher Scientific165306Mediciones de cultivo celular y luminiscencia
Microplaca negra Fondo plano 96PozoASONE3-3321-04Para la medición de luminiscencia en ensayos de citotoxicidad
Respira-MÁS FÁCILTOHOBERM-2000Película de sellado permeable al gas
Ensayo de Viabilidad de Celdas Luminiscentes CellTiter-GloPromegaG7572Ensayo de citotoxicidad
Centrífuga 5702 REppendorfCentrifugación
ClipTip 300, Filtrado, Estéril, RackThermo Fisher Scientific94420513
ClipTip 50, Filtrado, Estéril, RackThermo Fisher Scientific94420253
Contador Automático de Celdas Countess 3 FLInvitrogenRecuento de células
Portaobjetos de la cámara de conteo celular de la CondesaInvitrogenC10312Recuento de células
Cultura Sí, DMSO FUJIFILM Wako031-24051Disolvente para productos químicos
CultureSure Y-27632FUJIFILM Wako036-24023Inhibidor de ROCK para la siembra de iPSC
DMEM/F12 HEPES, sin fenol rojoThermo Fisher Scientific11039-021Recubrimiento para cultivo celular iPS
F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 a 300 y micro; LThermo Fisher Scientific4661180N
F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 5 a 50 & micro; LThermo Fisher Scientific4661160N
Chip de filtroWatson
Matriz de membrana basal de Geltrex sin factor de crecimiento reducidoThermo Fisher ScientificA1413202Recubrimiento para cultivo celular iPS
HIENAI Mat 01RCOSMO BIOHMAT01RPara mantener la estabilidad de la temperatura de la placa durante el manejo de cultivos celulares
Calentador de tubos HIENAI GX01COSMO BIOTWGX013Para mantener el medio caliente durante la manipulación experimental
Proteína recombinante bFGF de estabilidad térmica humanaThermo Fisher ScientificPHG0367Estimulación FGF para el ensayo reportero
Células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPS)201B7 (RCB Cat# HPS0063, RRID: CVCL_A324)Banco de celdas RIKEN BRC
Agitador de microplacasTAITEC0089532-000Agitación de placas para prueba de citotocicidad
Lector múltiplePerkinElmerARVO X4Medición de luminiscencia
Sustrato de células vivas de endurazina nano-gloPromegaN2571Sustrato de luminiscencia
PBS (-) FUJIFILM Wako166-23555Culutre celular
ParafilimCOMO UNO65-1681-93Almacenado para recubrir la placa
Pipettoeppendorf
WSL-1563 KronosHTATTO3510140Sistema de medición de luminiscencia en tiempo real  
EmbalseBMBioBM-0850-1
STEMdif APEL2 Mediano  Tecnologías STEMCELLST-05275Medio de ensayo
StemFlex MediumThermo Fisher ScientificA3349401Medio de mantenimiento
Agua estéril, libre de endotoxinasFUJIFILM Wako196-15645Control de humedad para cultivo celular iPS
Placa de cultivo tisular VTC-P6VIOLAMO2-8588-01Cultura celular
TrypL Select Enzyme (1X), sin fenol rojoThermo Fisher Scientific12563011Cultivo celular
Ácido valproicoFUJIFILM Wako227-01071Producto químico de prueba

Referencias

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