Artículo de método

Chip microfluídico para la construcción de modelos de lesión axonal y permite el análisis multiómico

DOI:

10.3791/68915

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14 de octubre de 2025

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1Beijing Advanced Innovation Center for Big Data-Based Precision Medicine, Beihang University, 2Interdisciplinary Innovation Institute of Medicine and Engineering, Beihang University, 3School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 4School of Software, Beihang University, 5School of Beijing, Beihang University

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe un sistema microfluídico que modela la dinámica metabólica neuronal después de la lesión axonal, lo que permite obtener imágenes, análisis multiómicos y estudios mecanicistas de remodelación metabólica intrínseca.

Resumen

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Las neuronas se polarizan para formar dendritas y axones, lo que permite la comunicación intercelular. La lesión axonal interrumpe estas conexiones y transmite señales de daño al soma, lo que a menudo conduce a la degeneración neuronal. Por lo tanto, mantener la homeostasis axonal es esencial para promover la regeneración local de los axones y proteger contra la neurodegeneración. Este proceso se basa en el metabolismo celular para suministrar energía y precursores biosintéticos y se sostiene mediante mecanismos que regulan el equilibrio metabólico y eliminan los subproductos. Sin embargo, el metabolismo neuronal está compartimentado entre el soma y el axón y está influenciado in vivo por el microambiente circundante, como la actividad metabólica derivada de los astrocitos (por ejemplo, la lanzadera de lactato astrocito-neurona). Estos factores complican la investigación de los mecanismos metabólicos intrínsecos de las neuronas. Para abordar estos desafíos, aquí desarrollamos una plataforma microfluídica para cultivar neuronas corticales primarias in vitro que conserva las características metabólicas clave observadas in vivo, incluido el flujo glucolítico fisiológico y la respiración mitocondrial. Este sistema proporciona un modelo simplificado para investigar la remodelación metabólica intrínseca en las neuronas después de una lesión axonal. Los chips microfluídicos convencionales admiten modelos de lesión axonal in vitro y son compatibles con imágenes de células vivas, tinción de inmunofluorescencia y tratamiento de hipoxia. Para dar cabida a los análisis transcriptómicos y metabolómicos a gran escala que involucran millones de células, diseñamos y fabricamos chips microfluídicos de alto rendimiento con protocolos operativos optimizados. El dispositivo cuenta con cámaras soma y axonales dispuestas alternativamente conectadas por microcanales, y la lesión axonal es inducida por la aspiración endouterina de líquido del compartimento axonal. Esta plataforma permite una evaluación rápida de la dinámica de metabolitos y enzimas, mejorando la precisión y la reproducibilidad de las investigaciones multiómicas.

Introducción

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Las neuronas establecen dos tipos distintos de protuberancias con funciones especializadas, axones y dendritas, a través de la polarización durante el desarrollo 1,2. La regeneración nerviosa se refiere al proceso de recrecimiento axonal después de una lesión neural3, con un enfoque de investigación en la reparación del sistema nervioso central (SNC). A diferencia del sistema nervioso periférico, el SNC tiene una capacidad regenerativa limitada 4,5,6, lo que a menudo resulta en deficiencias funcionales persistentes o discapacidades permanentes en pacientes con lesiones de la médula espinal o lesiones cerebrales traumáticas 7,8. Por lo tanto, el desarrollo de estrategias para mejorar la reparación del SNC y dilucidar los mecanismos subyacentes a la regeneración axonal son cruciales.

Los dispositivos microfluídicos, que funcionan como sistemas de cultivo in vitro integrados, rentables y de alto rendimiento, exhibieron ventajas notables en la investigación celular y neuronal en los últimos años 9,10. En comparación con los métodos tradicionales, la tecnología microfluídica permite una regulación precisa del esfuerzo cortante del fluido, los gradientes de concentración y las estructuras espaciales, simulando así de cerca los microambientes fisiológicos y patológicos auténticos para promover el crecimiento, la migración, la diferenciación y las interacciones celulares 11,12,13,14. Los modelos de lesión axonal in vitro basados en microfluidos permiten el cultivo compartimentado de cuerpos y procesos celulares neuronales a través de la polarización espacial, proporcionando una herramienta indispensable para explorar la capacidad regenerativa intrínseca de las neuronas y sus adaptaciones metabólicas después de una lesión15,1 6,17,18. Proporciona una ventana crítica a cómo las neuronas responden a las lesiones, regulan los procesos metabólicos19 y promueven la regeneración axonal20. Sin embargo, las plataformas microfluídicas existentes para la lesión axonal y la investigación metabólica aún enfrentan desafíos, incluidos bajos rendimientos de células neuronales, precisión reducida en las mediciones metabólicas y falta de procedimientos operativos estandarizados.

En respuesta a estas limitaciones, este estudio desarrolló una novedosa plataforma microfluídica a gran escala que permite la inducción estandarizada y de alto rendimiento de la lesión axonal y proporciona suficiente material celular para análisis multiómicos compartimentados. Este diseño integrado confronta directamente la necesidad crítica insatisfecha en la investigación de lesiones neuronales. Específicamente, el chip microfluídico que diseñamos presenta una disposición alterna de cámaras somales y axonales conectadas por microsurcos, con transección axonal lograda a través de aspiración endouterina controlada. Este enfoque es ideal para estudios que requieren modelos de lesión axonal reproducibles y de alto rendimiento y perfiles metabólicos precisos, como la investigación de los mecanismos metabólicos subyacentes a la regeneración axonal. En comparación con los métodos tradicionales, esta técnica ofrece un mayor rendimiento, una mayor precisión metabólica y la capacidad de establecer modelos de lesión estandarizados. Por ejemplo, estudios previos han demostrado la importancia del transporte mitocondrial en la regeneración axonal 20,21,22,23, mientras que nuestra plataforma revela además el papel del metabolismo de la glucosa en la regeneración axonal después de una lesión. Este protocolo establece un sistema técnico para la axotomía y el análisis metabólico a gran escala que es visualmente verificable y operacionalmente estandarizado.

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Protocolo

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Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas del Comité de Ética de la Universidad de Beihang y fueron aprobados por el comité (código de aprobación: BM20210060). La Figura 1 describe la línea de tiempo experimental.

1. Diseño del dispositivo microfluídico convencional y a gran escala

  1. Diseñe el dispositivo microfluídico con AutoCAD para crear esquemas bidimensionales (2D) y modelos estructurales tridimensionales (3D).
  2. Utilice estos diseños para fabricar un molde maestro en una oblea de silicio con fotolitografía negativa SU-8.
  3. Replique el molde maestro fundiendo polidimetilsiloxano (PDMS), lo que da como resultado un chip microfluídico funcional de alta precisión.
  4. Diseñe cada microcanal para que tenga una altura de 5 μm, permitiendo que solo pasen los axones mientras bloquea los somas.
  5. Haga que los microcanales tengan 10 μm de ancho para aumentar la capacidad axonal.
  6. Diseñe las cámaras para que tengan 120 μm de altura y 220 μm de ancho, proporcionando suficiente espacio para el soma neuronal.
  7. Utilice esta plataforma microfluídica para simular una lesión axonal in vivo controlando el flujo de fluidos y la colocación de las neuronas.
  8. Prepare muestras metabolómicas y transcriptómicas utilizando el dispositivo para la manipulación celular de alta precisión y habilite el procesamiento de alto rendimiento para mejorar la precisión de la muestra y la validez biológica.

2. Fabricación de dispositivos microfluídicos convencionales y a gran escala

  1. Pese la base de PDMS y el agente de curado en una proporción de 10:1 (p/p) y colóquelos en un tubo de centrífuga.
  2. Coloque el tubo de centrífuga que contiene la mezcla de PDMS en un mezclador de agitador centrífugo. Centrifugar a 2000 × g durante 4 min para mezclar, luego centrifugar nuevamente a 2000 × g durante 4 min para desgasificar.
  3. Vierta 13-15 g del PDMS desgasificado en el molde microfluídico, asegurándose de que el fondo del molde esté completamente cubierto.
  4. Coloque el molde en un desecador al vacío. Use una bomba de vacío para evacuar el aire durante 5-10 minutos para eliminar completamente las burbujas del PDMS.
  5. Use una bombilla de goma para golpear suavemente la superficie del PDMS para romper las burbujas superficiales restantes.
  6. Coloca el molde en un horno de convección y hornea a 80 °C durante 100 min para curar el PDMS.
  7. Una vez que el PDMS esté completamente curado, deslice suavemente la punta de un bisturí debajo del borde del PDMS para levantarlo y separarlo con cuidado del molde.
  8. Utilice un punzón de biopsia con un diámetro de 2,0-2,5 mm para crear orificios en el PDMS para la infusión del medio de cultivo y la carga celular.
  9. Elimine las impurezas de la superficie del PDMS con cinta adhesiva, luego colóquelo en un plato de vidrio limpio y envuélvalo con papel de aluminio para guardarlo.
  10. (Opcional) Trate la superficie del PDMS con plasma de oxígeno (30 W, 20 s) y luego presiónela contra otra superficie para una unión irreversible.
  11. Antes del experimento, esterilizar en autoclave el dispositivo microfluídico a 121 °C y 101 kPa durante 5 min para garantizar la esterilidad.

3. Preparación de las neuronas corticales

  1. Anestesiar 3 ratas Sprague-Dawley (SD) postnatales (dentro de las 12 h posteriores al nacimiento) colocándolas en hielo durante 5 min, luego decapitarlas rápidamente.
  2. Diseccionar el área motora de la corteza cerebral y colocar el tejido en un tampón de disección preenfriado (p. ej., 2 ml de HBSS sin calcio ni magnesio).
    NOTA: Realice todos los procedimientos de disección de tejidos en hielo utilizando soluciones preenfriadas.
  3. Picar el tejido en trozos de aproximadamente 1 mm3 con unas tijeras estériles y transferirlo a un tubo de centrífuga de 15 ml.
  4. Deje reposar durante 5 minutos y luego aspire cuidadosamente el sobrenadante para eliminar la sangre residual y el amortiguador.
  5. Añadir solución de papaína precalentada (1 mg/ml) en 5 ml de HBSS con calcio y magnesio calentados a 37 °C.
  6. Incubar en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante 40 min, invirtiendo suavemente el tubo 3 veces cada 10 min.
  7. Después de la digestión, triture suavemente la suspensión 100 veces con una pipeta de 200 μl.
    NOTA: Evite introducir burbujas de aire para evitar el estrés celular.
  8. Centrifugar a 300 × g durante 3 min y desechar el sobrenadante.
  9. Agregue una solución de terminación que contenga 1 mg/ml de inhibidor de la proteasa (p. ej., 600 μl de vial inhibidor del kit del sistema de disociación de papaína en 5 ml de HBSS con calcio y magnesio) para resuspender las células.
  10. Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 μm y recoja el filtrado en un nuevo tubo de centrífuga.
  11. Centrifugar el filtrado a 200 × g durante 10 min y desechar el sobrenadante.
  12. Vuelva a suspender el sedimento en 500 μL de medio de cultivo neuronal completo que contenga 2% de B27 y 1% de GlutaMAX.
  13. Cuente las células (aproximadamente 3 millones / rata) y ajuste la densidad a 1 × 106 células / ml para su uso posterior.

4. Recubrimiento

NOTA: Trate los cubreobjetos o las placas de cultivo con una solución de poli-D-lisina (PDL) para mejorar la adhesión de las neuronas y crear un entorno óptimo para el crecimiento neuronal.

  1. Recubrimiento de cubreobjetos
    1. Coloque un cubreobjetos destinado a dispositivos microfluídicos convencionales (Φ25 mm, espesor 0,17 mm) en una placa de cultivo de 35 mm y agregue 2 ml de solución PDL de 0,1 mg/ml.
    2. Incubar a 37 °C durante 6 h o toda la noche.
    3. Después de la incubación, recupere cuidadosamente la solución de PDL para su reutilización o eliminación adecuada.
    4. Agregue 2 ml de agua ultrapura estéril al plato y gírelo 50 veces en el sentido de las agujas del reloj, seguido de 50 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj (para varios platos, gírelos simultáneamente en un plato más grande).
    5. Aspire el agua con una bomba de vacío conectada a una punta de pipeta estéril, recogiendo los desechos en un contenedor de desechos líquidos.
    6. Repita el procedimiento de lavado (pasos 4.1.4-4.1.5) tres veces en total.
    7. Deje que los cubreobjetos se sequen al aire de forma natural en un gabinete de bioseguridad antes de usarlos.
  2. Recubrimiento de placas de cultivo
    1. Agregue una cantidad adecuada de 0,1 mg/ml de solución de PDL a la placa de cultivo o placa de pocillos (p. ej., agregue 2 ml a una placa de 35 mm para microfluídica convencional y 5 ml a una placa de 10 cm para microfluídica a gran escala).
      NOTA: Asegúrese de que el gabinete de bioseguridad esté en funcionamiento correctamente con flujo de aire estéril para evitar la contaminación.
    2. Asegúrese de que la solución cubra completamente el fondo e incube a 37 °C durante 6 h o toda la noche.
    3. Después de recuperar la solución de PDL, lave la placa de cultivo tres veces con una cantidad adecuada de agua ultrapura estéril como se describe en el paso 4.1.4.
    4. Retire el agua ultrapura residual y seque al aire la placa de cultivo en una campana de flujo laminar para su uso posterior.

5. Preparación del medio neuronal

  1. Prepare el medio completo para el cultivo de neuronas de rutina.
    1. Retire el émbolo de una jeringa desechable de 50 ml. Coloque la jeringa con el cabezal de goma hacia arriba en un banco limpio dentro de un gabinete de bioseguridad.
    2. Agregue 500 μL de penicilina estreptomicina (PS), 1 mL de B27, 125 μL de GlutaMAX y 500 μL de suero fetal bovino (FBS) en la jeringa en secuencia. Cambie la punta de la pipeta para cada componente para evitar la contaminación cruzada.
      NOTA: Agregue cada componente en el orden especificado para mantener la coherencia.
    3. Tome un nuevo tubo de centrífuga estéril de 50 ml. Etiquételo como "Neurobasal-A (NBA) + 2% B27 + 0.25% GlutaMAX + 1% FBS + 1% PS".
      NOTA: Use NBA si no son neuronas embrionarias; use neurobasal (NB) para neuronas embrionarias.
    4. Coloque un filtro de jeringa de 0,22 μm en el extremo de la jeringa.
      NOTA: Asegúrese de que el filtro esté bien conectado a la jeringa para evitar fugas.
    5. Use NBA para llenar la jeringa con líquido hasta 50 ml, incluido el volumen de aditivos. Vuelva a instalar el émbolo.
    6. Empuje lentamente el émbolo a aproximadamente 2 ml/s para filtrar el líquido en el tubo de centrífuga etiquetado.
    7. Apriete la tapa del tubo de centrífuga. Invierta el tubo de 3 a 5 veces para mezclar el medio.
  2. Medio completo que contiene [U-13C6]-glucosa (para análisis de flujo metabólico): Para el análisis de flujo metabólico del metabolismo de la glucosa en neuronas dañadas, use NBA sin azúcar para preparar un medio completo que contenga [U-13C6]-glucosa.
    1. Use NBA sin glucosa como solución base y agregue [U-13C6]-glucosa a una concentración final de 25 mM antes de la filtración (si [U-13C6]-glucosa es sólida, calcule y pésela con anticipación). Siga la misma secuencia para agregar otros componentes, así como los pasos de filtración y mezcla, como se describe en la sección 5.1.

6. Recuento de células

  1. Limpie bien el hemocitómetro con etanol al 75%. Asegúrese de que todas las superficies estén completamente secas antes de continuar.
  2. Agregue 90 μL de tampón salino tamponado con fosfato estéril (PBS) a un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml.
  3. Vuelva a suspender suavemente la suspensión de células neuronales recolectada pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 3 a 5 veces para garantizar una mezcla completa.
  4. Con una pipeta de 10 μL, transfiera 10 μL de la suspensión de células mixtas al tubo de centrífuga que contiene 90 μL de PBS (dilución 1:10).
  5. Utilice una pipeta de 200 μl para mezclar suavemente la solución 10 veces, asegurándose de que no se formen burbujas.
  6. Sustituya la punta de la pipeta por una nueva punta de 10 μl. Extraiga 10 μL de la mezcla y agréguela a la cámara de muestras del hemocitómetro.
  7. Coloque el hemocitómetro en la platina del microscopio y enfoque con el objetivo de 20x. Ubique la cuadrícula central 4 × 4 y cuente las células en los 16 cuadrados siguiendo las reglas estándar del hemocitómetro.
  8. Registre el recuento total de células de los 16 cuadrados. Calcule la concentración celular usando la fórmula: (Recuento total × 10) × 104 células/ml.
    NOTA: Trabaje siempre en un gabinete de bioseguridad con el equipo de protección personal adecuado.

7. Cultivo in vitro de neuronas corticales en dispositivos microfluídicos convencionales o a gran escala

  1. Protocolo A (Dispositivos microfluídicos convencionales).
    1. Verifique que la superficie de vidrio en la placa de cultivo de 35 mm esté completamente seca.
    2. Con unas pinzas estériles de punta fina, coloque el chip microfluídico esterilizado en autoclave en el centro de la superficie de vidrio con los microcanales hacia abajo.
    3. Presione suavemente el chip sobre la superficie de vidrio con una punta de pipeta de 200 μl para garantizar una adhesión completa.
    4. Marque la cámara izquierda con un punto (·) usando un marcador permanente para designar el compartimento del soma.
    5. Aspire 10 μL de suspensión neuronal (10 millones de células/mL) con una pipeta de 10 μL.
    6. Dispense lentamente la suspensión en el puerto de carga sobre el compartimento de soma marcado.
    7. Confirme el flujo de fluido adecuado hacia el depósito inferior de la cámara izquierda.
    8. Transfiera la placa de cultivo a una incubadora humidificada (37 °C, 5% CO2) durante 20 min.
    9. Retire la placa de cultivo de la incubadora.
    10. Con un microscopio de contraste de fase de 20 ×, confirme la perfusión del medio desde el compartimento somático hasta el compartimento axonal a través de los microcanales.
    11. Agregue 150 μL de medio basal neuronal al puerto superior del compartimento axonal (cámara derecha), lo que permite un flujo impulsado por la gravedad al depósito inferior.
    12. Del mismo modo, agregue 15 μL de medio neuronal completo al puerto superior del compartimento soma (cámara izquierda).
      NOTA: En esta etapa, las neuronas deben adherirse visiblemente, con la mayoría de los desechos celulares expulsados al pozo inferior. No reemplace el medio durante el cultivo; Utilice una sola adición de medio neuronal completo como se describe en el paso 5.1.3.
    13. Vierta 20 ml de agua ultrapura en una placa de cultivo de 150 mm para crear una cámara de humedad. Coloque la placa de cultivo de 35 mm dentro de la placa grande.
    14. Transfiera todo el sistema de cultivo a la incubadora y manténgalo durante el tiempo requerido (por ejemplo, 7 días).
      NOTA: Realice todos los procedimientos de cultivo celular en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad. Use equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio y guantes). Descontamine las superficies de trabajo antes y después de los procedimientos.
  2. Protocolo B (Chips microfluídicos a gran escala).
    NOTA: El protocolo estándar de especificaciones convencionales se siguió con dos modificaciones.
    1. Utilice una placa de Petri de 10 cm para colocar el dispositivo.
    2. Elija la siembra de canal completo o de canal de intervalo según las necesidades experimentales, ya que cada método requiere diferentes protocolos de lesión axonal.
    3. Una vez completada la siembra, agregue 5 ml de medio de cultivo de neuronas completo a la placa de Petri de 10 cm para mantener el crecimiento de las neuronas.
    4. Agregue 20 ml de agua ultrapura a un plato grande de 150 mm para crear una cámara de humedad. Luego, coloque el plato de 10 cm dentro del plato grande.
    5. Igual que el paso 7.1.14.

8. Establecimiento de un modelo de lesión axonal in vitro en dispositivos microfluídicos convencionales

  1. Marque el lado izquierdo del dispositivo microfluídico como el compartimento somal (como lo indica la marca "·") y el lado derecho como el compartimento terminal axonal.
  2. Siembra neuronas corticales en el compartimento sómico.
  3. Cultive las neuronas in vitro hasta el día 7 (DIV7), lo que permite que los axones se extiendan a través de los microcanales hasta el compartimento terminal axonal.
  4. En DIV7, realice procedimientos de lesión axonal en el compartimento terminal axonal para establecer un modelo de lesión axonal in vitro .
  5. Tome una cantidad adecuada de medio NBA y transfiérala a un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml para su uso posterior.
  6. Cultive neuronas corticales en el dispositivo microfluídico durante el período especificado. Luego transfiera el dispositivo a un banco limpio.
  7. Use papel sin pelusa para secar el fondo de la placa de cultivo de 35 mm. Utilice una pipeta de 200 μl para aspirar el medio de los dos orificios del lado derecho del dispositivo microfluídico.
  8. Conecte el tubo de la bomba de vacío a una punta de pipeta estéril y sin filtro de 200 μl, encienda la bomba de vacío (velocidad de succión de 60 l/min) y apunte la punta al punto de conexión entre el orificio inferior de la cámara terminal del axón y la cámara para aspirar el medio antiguo (en este punto, los axones se rompen debido a la presión negativa).
  9. Vuelva a colocar la punta de la pipeta de 200 μl y extraiga 150 μl de NBA, añadiéndola lentamente a través del orificio inferior de la cámara derecha.
    NOTA: Si el flujo de líquido es demasiado lento y se forman burbujas, expulse rápidamente el líquido de la punta para llenar rápidamente la cámara.
  10. Alterne el uso de los dos orificios del lado derecho para la adición de líquido: después de cada adición de NBA, use inmediatamente la bomba de vacío para aspirar líquido del otro orificio para cortar los axones. Repita esta operación 4 veces y, después de la última aspiración, reemplácela con un medio neuronal completo nuevo.
  11. Aspire el medio viejo del orificio lateral del cuerpo celular y agregue un medio neuronal completo fresco que contenga medicamentos (si es necesario).
  12. Coloque el dispositivo microfluídico junto con la placa de cultivo en una placa de cultivo de 150 mm y continúe cultivando durante el tiempo especificado (por ejemplo, 24 h).
    NOTA: La operación de daño axonal requiere medio NBA, ya que el medio neuronal completo producirá burbujas que afectarán el efecto de corte.

9. Lesión axonal de dispositivos microfluídicos a gran escala

  1. Método 1: Lesión axonal manual.
    1. Siembra neuronas en todas las cámaras del dispositivo microfluídico.
    2. Incube el dispositivo a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% deCO2 durante tres días, luego retire todo el dispositivo microfluídico.
      NOTA: Para evitar el estrés mecánico o el desgarro de los axones que crecen en los microcanales, retire el dispositivo microfluídico en DIV3 en lugar de DIV7. Esto es particularmente importante si el diseño experimental incluye un grupo de control sin daños.
    3. En DIV7, retire la placa de cultivo que contiene el dispositivo microfluídico de la incubadora y colóquela en una etapa estéril.
    4. Prepare un microscopio con un aumento de 20x y esterilice el área de trabajo con etanol al 75%.
    5. Sostenga una punta de pipeta filtrada estéril de 10 μl e identifique los haces de axones en los microcanales originales bajo la guía del microscopio.
    6. Realice rasguños longitudinales a lo largo de cada haz de axones con la punta de la pipeta.
    7. Observe la rotura del axón bajo el microscopio en tiempo real después del rascado.
      NOTA: Cuando manipule neuronas vivas, use guantes de nitrilo y trabaje en un entorno de laboratorio esterilizado por rayos UV
  2. Método 2: Lesión axonal asistida por vacío.
    1. Siembra neuronas corticales alternativamente en el dispositivo microfluídico de gran formato.
    2. Encienda la bomba de vacío y ajústela a 60 L/min.
    3. Conecte el extremo del tubo de la bomba de vacío al puerto de la cámara del axón con una punta de pipeta estéril.
    4. Completa la separación de axones mediante la aplicación de presión de vacío a través de protocolos microfluídicos convencionales.
    5. (Opcional) Para recolectar específicamente los axones lesionados, en un punto de tiempo definido después de la axotomía, aspire rápidamente el contenido del compartimento del cuerpo celular usando una bomba de vacío (con una velocidad de succión de 60 L / min) para eliminar los cuerpos celulares, dejando así solo los axones dentro de los microcanales.

10. Tratamiento hipóxico de dispositivos microfluídicos convencionales o a gran escala

  1. Siembra neuronas primarias en el dispositivo microfluídico y cultivo hasta DIV7 en condiciones normóxicas (37 °C, 5% CO2).
  2. Coloque el dispositivo microfluídico en una cámara incubadora de hipoxia y suministre una mezcla de gases que consista en 1% de O2, 5% de CO2 y N2 equilibrado.
  3. Utilice un rotámetro para controlar el caudal de gas y ajústelo a 25 L/min.
  4. Enjuague la cámara durante 5 minutos para desplazar el aire.
  5. Mientras sujeta la entrada de la cámara hipóxica, cierre la válvula reductora de presión de salida.
  6. Sujete el tubo de salida de la cámara hipóxica y, finalmente, cierre bien la válvula del cilindro de gas.
  7. Incubar el dispositivo microfluídico en la cámara hipóxica a 3 °C durante 1 h.

11. Preparación de muestras de neuronas cultivadas in vitro utilizando dispositivos microfluídicos a gran escala para análisis ómicos

  1. Muestra para transcriptómica.
    1. Transfiera el dispositivo microfluídico con los axones dañados a una campana de flujo laminar 6 h después de que se complete la lesión axonal.
    2. Después de desechar el medio viejo, lave las células neuronales 2-3 veces con PBS estéril.
    3. Utilice un kit de extracción de ARN estándar para aislar y purificar el ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    4. Realizar secuenciación de ARN. Realizar análisis bioinformáticos de seguimiento de los datos de secuenciación adquiridos.
  2. Muestra para análisis de flujo metabólico.
    NOTA: Para monitorear los cambios en el flujo metabólico de glucosa en las neuronas después de una lesión utilizando un dispositivo microfluídico a gran escala, empleamos el análisis de flujo metabólico de rastreo de glucosa [U-13C6]24. El protocolo para preparar muestras para el análisis de LC-MS es el siguiente:
    1. Use cachorros de rata P0 SD para los experimentos. Diseccionar las neuronas corticales y cultivarlas in vitro, ya sea a corto plazo (DIV5-DIV7) o a largo plazo (DIV15-DIV30).
    2. Tanto para las neuronas jóvenes (DIV5-DIV7) como para las maduras (DIV15-DIV30), establezca grupos de lesiones y grupos de control no lesionados.
    3. Sustituir el medio por uno que contenga 25 mM [U-13C6]-glucosa (Neurobasal-A sin glucosa, 1% FBS, 2% B27, 25 mM [U-13C6]-glucosa) e incubar durante 4 h a 37 °C.
      NOTA: Para evitar el estrés neuronal y la apoptosis causados por cambios osmóticos o de pH durante el intercambio de medios, prepare neuronas adicionales cultivadas en un medio que contenga 25 mM [U-13C6] de glucosa en el momento de la siembra y use este medio para el intercambio.
    4. Después de enjuagar suavemente dos veces con 5 ml de HBSS precalentado (que contiene calcio y magnesio), congele rápidamente las muestras en nitrógeno líquido y guárdelas a -80 °C.
      NOTA: Use guantes de nitrilo y una bata de laboratorio cuando manipule nitrógeno líquido.

12. Tinción de inmunofluorescencia neuronal basada en dispositivos microfluídicos convencionales y a gran escala

NOTA: Al cultivar neuronas in vitro utilizando dispositivos microfluídicos, se debe considerar el daño potencial a los axones neuronales dentro de los microcanales que puede ocurrir durante el desmontaje de estos dispositivos para la fijación de células vivas.

  1. Utilice una bomba de vacío de microresiduos para eliminar el medio de cultivo de los cuatro pocillos del dispositivo microfluídico.
    NOTA: Mantenga el líquido en dos cámaras durante todo el proceso de tinción de inmunofluorescencia. Los parámetros de succión no deben ser demasiado altos (2,5 L/min es óptimo) para evitar dañar o aspirar cuerpos celulares neuronales y axones.
  2. Agregue 100 μL de 1x PBS a cada uno de los dos pocillos superiores del dispositivo microfluídico (PBS fluirá naturalmente a los pocillos inferiores).
  3. Vuelva a colocar la punta sin filtro en el extremo de la bomba de vacío, aspire PBS de los pocillos inferiores y repita el proceso tres veces. En la iteración final, aspire todo PBS de los cuatro pocillos.
  4. Agregue 150 μL de solución de paraformaldehído (PFA) al 4% a cada uno de los dos pocillos superiores y fije a temperatura ambiente durante 10-15 min.
    NOTA: Evite el desmontaje del dispositivo durante la fijación de células vivas para mantener la integridad estructural neuronal. Este enfoque ayuda a distinguir las ubicaciones de los somas y axones neuronales con mayor claridad.
  5. Lavar tres veces con 1x PBS, luego incubar las neuronas con tampón de bloqueo que contenga 5% de suero de cabra, 0,3 M de glicina, 2% de albúmina sérica bovina (BSA), PBS y 0,1% (o 0,5%) de Triton X-100 durante 1 h.
  6. Diluya el anticuerpo primario (p. ej., βIII-tubulina, ratón, 1:2000) en el tampón de bloqueo, agregue 100 μL al pocillo superior izquierdo y 50 μL al pocillo superior derecho, e incube con neuronas durante la noche a 4 ° C.
  7. Después de aspirar el anticuerpo primario, lavar tres veces con 1x PBS como se describe en los pasos 12.2-12.3. Luego agregue el anticuerpo secundario preparado con tampón de bloqueo en los pocillos superiores del dispositivo microfluídico como se describe en el paso 12.6, e incube en la oscuridad durante 30 min (cubra con papel de aluminio si es necesario).
  8. Después de lavar tres veces con 1x PBS, enjuague una vez con agua ultrapura. Use con cuidado pinzas curvas para agarrar y quitar el dispositivo de la parte superior derecha de la configuración microfluídica.
  9. Agregue 1 ml de PBS a la placa de cultivo para separar el cubreobjetos grande de la placa.
  10. Utilice una pipeta para extraer 15 μl de medio de montaje y colóquelo sobre el cubreobjetos en la ubicación designada para los cubreobjetos.
  11. Baje suavemente el lado de la celda sobre el medio de montaje, coloque el cubreobjetos y elimine el exceso de líquido.
  12. Deje que el medio de montaje se seque completamente a temperatura ambiente.
  13. Una vez que el medio de montaje se haya secado a temperatura ambiente, use un microscopio confocal de disco giratorio para realizar imágenes.
  14. Seleccione un objetivo de aire de 20x, establezca el tiempo de exposición en 100-200 ms por fotograma y ajuste la potencia del láser al 5-10% del máximo con excitación de 488 nm para la proteína fluorescente verde (GFP) y/o 561 nm para la proteína fluorescente roja (RFP).

13. Imágenes de células vivas en dispositivos microfluídicos convencionales

  1. Cultive las neuronas corticales en el dispositivo microfluídico hasta DIV7.
  2. Prepare un tinte de células vivas (por ejemplo, una sonda para el potencial de membrana mitocondrial) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  3. Colorante diluido en medio de mantenimiento neuronal precalentado (37 °C).
  4. Cargue la solución de colorante en el compartimento somático del dispositivo microfluídico.
  5. Incubar durante 30 min en una incubadora deCO2 al 5% de 37 °C.
  6. Lave suavemente los compartimentos 3 veces con 3 ml de HBSS precalentado (37 °C) que contenga calcio y magnesio.
  7. Agregue una solución de imágenes de células vivas sin rojo de fenol al chip microfluídico.
  8. (Opcional) Incluya GlutaMAX (0,25%) y B27 (2%) para imágenes prolongadas.
  9. Coloque el chip microfluídico en la platina del microscopio con la cámara somática a la izquierda y la cámara terminal axonal a la derecha.
  10. Agregue una gota de aceite de inmersión a la lente del objetivo, asegurándose de que el aceite haga contacto con el cubreobjetos debajo del chip.
  11. Utilice un objetivo de 40x con una exposición de 150 ms y una potencia láser máxima del 10-15% para la obtención de imágenes.
    NOTA: Ajuste estos parámetros en función de la fotoestabilidad del tinte.

14. Análisis de datos

  1. Utilice el software ImageJ para analizar imágenes de microscopía. Evalúe la calidad del ARN con un bioanalizador. Realice y analice RNA-seq utilizando una plataforma adecuada.
  2. Para estudios metabolómicos, extraiga datos brutos de espectrometría de masas utilizando el programa MRMPROBS (versión 2.60) y recopile información sobre los metabolitos identificados, incluidos los detalles isotópicos y las áreas de pico.
  3. Utilice GraphPad Prism (versión 8.4.3) para todos los análisis estadísticos. Presente los datos como media ± SEM. Utilice pruebas t de dos colas no pareadas o pruebas de Mann-Whitney para comparaciones de grupos, y aplique ANOVA de dos vías para comparaciones entre múltiples puntos de tiempo dentro de grupos (Significación: ns, no significativa; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001).

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Resultados

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Para establecer una plataforma de investigación integral para estudiar los mecanismos de regulación metabólica en las neuronas corticales, primero cultivamos neuronas corticales en un dispositivo microfluídico convencional, controlando con precisión el crecimiento de axones a lo largo de los microcanales (Figura 2A). Con un diseño adecuado, los microcanales se construyeron con una altura baja (5 μm) y un ancho mayor (10 μm), lo que permite que cada canal albe...

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Discusión

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El establecimiento de modelos in vitro avanzados para el estudio de la lesión axonal y la regeneración es esencial para descubrir los mecanismos moleculares y metabólicos implicados en la reparación neuronal16,19. En este estudio, presentamos un flujo de trabajo estandarizado que integra dispositivos microfluídicos, cultivos neuronales a gran escala y protocolos precisos de lesión axonal, lo que permite un análisis multi...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (Subvenciones Nos. L222080, F251031, Z240011, 7192103) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvenciones Nos. 82271513)

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Medio neurobasal-AGibco10888022Medio de cultivo
Alexa Fluor 488 anti-ratón cabraInvitrogenA-21042Inmunofluorescencia
Balanza analíticaShanghai Shunyu Hengping Scientific Instrument Co., Ltd.FA1004Pesaje preciso de reactivos/muestras
B27 (50x)Gibco17504044Medio de cultivo
Ensayo de proteínas BCABosterAR1189Concentraciones de proteínas
BioanalizadorAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Albúmina sérica bovinaVista de GenviewFA016Inmunofluorescencia
Mezclador de agitador centrífugoPENSARARE-310Mezcla de PDMS y desgasificación
Analizador CLARIOstarPlus-ACUBMG LABTECHCLARIOstar PlusConcentraciones de proteínas
Incubadora de CO2Thermo Fisher Scientific (Asheville) LLC3111Incubación de cultivos celulares a 37 ° C, 5% CO?
Bomba de vacío de diafragma resistente a la corrosiónTecnología de instrumentos Shanghai Lichen Bangxi Co., Ltd.LC-85DLCAspirar el líquido residual y proporcionar succión para la axotomía
D-GLUCOSA (U-13C6, 99%)Laboratorios de isótopos de CambridgeCLM-1396Flujo metabólico
ADNasa IRoche11284932001Cultura neuronal
Plataforma Dr.TOM2 Genómica BGIRealizar y analizar secuencias de ARN
Horno eléctrico de secado por aire calienteBIOM Huahong Bonn / Huaying BosiDHG-9070ACurar PDMS
Balanza electrónicaShanghai Huachao Industrial Co., Ltd.HC313Pesaje rutinario de materiales
Medio de montaje acuoso FluoromountSigma-AldrichF4680Inmunofluorescencia
GlutaMAXGibco35050061Medio de cultivo
GlicinaSolarbioG8200Inmunofluorescencia
HBSSGibco14025092Cultura neuronal
HBSS, sin calcio, sin magnesioGibco14175095Cultura neuronal
Esterilizador de vapor de alta presiónSTIK Instrument (Shanghai) Co., Ltd.HMJ-54AEsterilización de equipos y medios de laboratorio
Cámara hipóxicaTecnologías STEMCELL27310Tratamiento hipóxico
ImagenJNIHSe utiliza para analizar imágenes de microscopía
Microscopio LeicaLeica Microsystems CMS GmbHFluorescente LED DMILObservación en vivo y de fluorescencia
Solución de imágenes de células vivasInvitrogenA14291DJImágenes de células vivas
Caja de almacenamiento médica a baja temperatura (-80 ° C)Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.DW-86L388JAlmacenamiento de muestras a largo plazo a -80 ° C
Mini bomba de vacío de sobremesaHaimen Qilin-Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.GL-805Aplicaciones de vacío a pequeña escala
MitoTracker Naranja CMTMRosInvitrogenM7510Tinción de potencial de membrana mitocondrial
Programa MRMPROBSVersión 2.60Para extraer datos brutos de espectrometría de masas 
Medio neurobasalGibco21103049Medio de cultivo
Neurobasal-A sin glucosaGibcoA2477501Medio de cultivo
PapaínaWorthingtonLS003127Cultura neuronal
ParaformaldehidoSigma-AldrichP6148Fijación celular
PDMSDow CorningDC184Fabricación de dispositivos
Vial inhibidor del kit PDSWorthingtonLK003182Cultura neuronal
Penicilina EstreptomicinaGibco15140122Medio de cultivo
Solución salina tamponada con fosfatoBiosharpBL302ADiluir las sustancias y limpiar los recipientes de las celdas
Limpiador de plasmaHarrick PlasmaODC-32G-2Activación
Poli-D-lisinaSigma-AldrichP6407Cultura neuronal
PrismaTeclado gráficoVersión 8.4.3Análisis estadísticos
Centrífuga refrigeradaEppendorf AG (Alemania)5430RSeparación de muestras a temperaturas controladas
Kit de extracción de ARN total de células/bacterias puras RNArepTiangenDP430Transcriptómica
RotámetroDwyerRMA-23-SSVControlar el bajo flujo de oxígeno
Microscopio estereoscópicoCorporación OlympusSZ2-ILSTObservación y disección de muestras
Agitador orbital StuartKylin-BellTS-200Mezcla de cultivos/soluciones celulares a velocidades ajustables
Tritón X-100Sigma-AldrichX100Inmunofluorescencia
Bomba de vacío de paletas rotativas ULVACULVAC (Ningbo) Co., Ltd.GLD-N202Creación de vacío para filtración/secado
β III-tubulinaPromegaG7121Inmunofluorescencia

Referencias

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