Artículo de método

Evaluación de intervenciones terapéuticas en el modelo de ratón deficiente en SHIP de ileítis y fibrosis similares a la enfermedad de Crohn

DOI:

10.3791/68928

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14 de octubre de 2025

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1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, University of British Columbia and BC Children's Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este protocolo demuestra cómo el modelo de ratón deficiente en el dominio de homología 2 Src de inflamación ileal y fibrosis similar a la enfermedad de Crohn (EC) deficiente en 5'-inositol fosfatasa (SHIP) se puede utilizar para probar nuevas terapias para la EC.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La enfermedad de Crohn (EC) es una afección inflamatoria crónica y recurrente caracterizada por una inflamación transmural segmentaria que puede afectar cualquier parte del tracto gastrointestinal. Un sello distintivo de la EC es el deterioro de la función de barrera intestinal, y la fibrosis intestinal es una complicación común. Los ratones deficientes en SHIP (SHIP-/-) desarrollan espontáneamente disfunción de la barrera intestinal, inflamación ileal y patología fibrótica, recapitulando las características clave de la ileítis similar a la CD. Los ratones SHIP-/- sirven como un modelo valioso para probar terapias antiinflamatorias y antifibróticas en la EC.

Aquí, describimos métodos para evaluar las intervenciones terapéuticas en este modelo, utilizando dexametasona como ejemplo de una terapia efectiva. Proporcionamos un protocolo paso a paso para caracterizar la enfermedad y la respuesta al tratamiento, incluida la evaluación in vivo de la permeabilidad intestinal medida por FITC-dextrano, así como un examen patológico macroscópico y análisis histológicos detallados. Las evaluaciones histológicas incorporan la tinción de hematoxilina y eosina (H&E) para la inflamación, la tinción tricrómica de Masson para la fibrosis y la tinción con azul alcián/ácido peryódico-Schiff (PAS) para la hiperplasia e hipertrofia de células caliciformes. Además, se cuantifican citocinas y marcadores inflamatorios en el tejido ileal para evaluar el estado inflamatorio. Juntos, estos métodos proporcionan un marco integral para evaluar la eficacia del tratamiento en el modelo de ratón SHIP-/- de ileítis similar a la EC. Este protocolo es ampliamente aplicable a los investigadores que estudian la inflamación intestinal, la curación de la mucosa y la fibrosis intestinal.

Introducción

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Los dos tipos principales de enfermedad inflamatoria intestinal (EII) son la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), ambas caracterizadas por una inflamación gastrointestinal (GI) crónica que puede seguir un curso recurrente-remitente o progresivo1. Aunque la EII ha sido considerada históricamente una enfermedad de los países occidentalizados, su incidencia está aumentando rápidamente en los países en desarrollo de América del Sur, Asia y África2. Al mismo tiempo, la prevalencia continúa aumentando en América del Norte, Europa y Australia, con un aumento de casi el 50% tanto en la incidencia como en la prevalencia reportadas entre 1990 y 2019, lo que subraya la creciente carga de salud mundial de la EII 2,3. A pesar de los importantes esfuerzos de investigación, la causa subyacente de la EII sigue siendo desconocida. La evidencia actual sugiere una interacción compleja entre la susceptibilidad genética, la disfunción del sistema inmunológico y los desencadenantes ambientales, incluidas las alteraciones en el microbioma 4,5.

Existen diferencias clave entre CD y UC. En la CU, la inflamación se limita al colon y se caracteriza por una afectación continua que se limita a la capa mucosa 6,7. Por el contrario, la EC se caracteriza por una inflamación discontinua y transmural que puede afectar cualquier parte del tracto gastrointestinal, con mayor frecuencia en el íleon terminal 6,7. Una complicación distintiva de la EC es la fibrosis intestinal, que contribuye a la formación de estenosis y obstrucción intestinal8. La fibrosis se define por el depósito excesivo de componentes de la matriz extracelular, como el colágeno, y el engrosamiento de las capas musculares intestinales 9,10. Aproximadamente el 30% de las personas con EC desarrollan enfermedad estenosante dentro de los 10 años posteriores al diagnóstico11. Actualmente, ninguna terapia se dirige directamente a la fibrosis, una necesidad clínica insatisfecha que puede abordarse utilizando modelos preclínicos adecuados para estudiar esta complicación 9,12.

Para comprender mejor la patogénesis de la EII y facilitar el desarrollo de nuevas terapias, se han establecido numerosos modelos de ratón12. Si bien existe un gran número de modelos de colitis, solo unos pocos recapitulan la inflamación ileal y la fibrosis asociada a la EC12. Entre estos se encuentran el dominio de homología Src 2 que contiene 5'-inositol fosfatasa deficiente (SHIP-/-) descrito en este documento, así como los ratones SAMP1 / YitFc y los ratonesTnf ΔARE. Estos modelos reflejan colectivamente la complejidad de la EC humana, ya que cada uno está impulsado por distintos mecanismos celulares y moleculares. La enfermedad en ratones SAMP1 / YitFc es el resultado de una predisposición poligénica que afecta la función de barrera epitelial y la regulación inmune13,14, mientras que los ratonesTnf ΔARE portan una deleción de elementos ricos en AU en el ARNm de TNF, lo que lleva a una mayor estabilidad del ARNm y una sobreproducción de TNF15,16. Aunque valiosos, estos modelos tienen limitaciones. El modelo SAMP1/YitFc adolece de baja eficiencia reproductiva, lo que plantea desafíos para generar tamaños de cohorte suficientes para los estudios17. Además, el modeloTnf ΔARE requiere hasta 24 semanas para desarrollar una patología fibrótica notable, lo que hace que sea costoso y desafiante realizar estudios de intervención16.

SHIP es un regulador negativo de la vía de señalización de la fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) y se expresa predominantemente en células hematopoyéticas. Funciona eliminando el grupo fosfato 5' del fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato, atenuando así la señalización PI3K aguas abajo18. Los ratones SHIP-/- ofrecen varias ventajas para los estudios preclínicos. Estos ratones son relativamente fáciles de criar y muestran signos de fibrosis a partir de las 8 semanas de edad de19 años. La remodelación fibrótica acelerada en este modelo probablemente esté impulsada por respuestas inflamatorias elevadas debido a una vía PI3K desregulada, que conduce a la hiperactivación de las células inmunitarias y la posterior remodelación rápida de los tejidos. Lo más importante es que nosotros y el grupo de Kerr hemos demostrado de forma independiente que los ratones SHIP-/- desarrollan ileítis con características que se asemejan mucho a la EC19,20 humana. Apoyando la relevancia de este modelo, un subconjunto de individuos con EC tienen una actividad reducida de SHIP tanto en biopsias ileales como en PBMC21. Además, aquellos con baja actividad de SHIP tienden a experimentar un curso más grave de la enfermedad, que a menudo requiere múltiples cirugías22.

Los ratones SHIP-/- comienzan a desarrollar inflamación intestinal espontánea y discontinua localizada en el íleon distal a las 4 semanas de edad, con inflamación presente en todos los ratones a las 6 semanas de edad20. A las 8 semanas de edad, los ratones han establecido patología fibrótica, caracterizada por engrosamiento de la muscular externa y acumulación extensa de colágeno en la submucosa y entre las capas musculares19. La inflamación en este modelo es impulsada por la interleucina-1β derivada de macrófagos (IL-1β)21. Tanto el agotamiento de los macrófagos utilizando liposomas que contienen clodronato como el bloqueo farmacológico de la señalización de IL-1 con un antagonista del receptor de IL-1 (anakinra) mejoraron la inflamación intestinal en ratones SHIP-/-21. Además de la ileítis, los ratones SHIP-/- presentan inflamación pulmonar, que hemos utilizado para evaluar los efectos fuera del objetivo de las terapias diseñadas para la administración intestinal localizada23. Otros han informado que la inhibición de la caspasa-8 con Z-IETD-FMK reduce significativamente la inflamación ileal y pulmonar en ratones SHIP-/-24, lo que respalda aún más la patología pulmonar como una característica adicional para evaluar el control inflamatorio sistémico.

Este artículo metodológico revisa nuestro trabajo recientemente publicado sobre el tratamiento exitoso con dexametasona23 y proporciona una descripción detallada de los procedimientos técnicos clave, con consideraciones adicionales para el uso de modelos de ratón en pruebas farmacológicas. Específicamente, destacamos los parámetros estándar para evaluar la eficacia de los medicamentos en modelos de EII, incluida la evaluación de la permeabilidad intestinal, la patología macroscópica, la histopatología y los mediadores y efectores proinflamatorios, y discutimos cómo integrar estos datos para sacar conclusiones sobre la eficacia terapéutica general.

Protocolo

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Los estudios con animales deben realizarse de acuerdo con los protocolos éticos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y de acuerdo con las Directrices sobre Cuidado de Animales de los Consejos Nacionales de Investigación. Todos los procedimientos con animales en este protocolo siguieron las pautas éticas del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Columbia Británica (protocolo A21-0212).

NOTA: Para evaluar el impacto terapéutico del fármaco en la patología intestinal de los ratones SHIP-/-, incluya SHIP+/+ como controles sanos para la comparación. Para la intervención terapéutica, iniciar el tratamiento a las 6 semanas de edad, cuando la enfermedad está completamente establecida en el modelo. Aquí, tanto los ratones SHIP+/+ como SHIP-/- recibieron sonda oral diaria de dexametasona a 3 mg / kg en β-ciclodextrina al 0,5% (vehículo) o el vehículo solo durante 2 semanas, en un volumen de 10 μL / g.

1. Ensayo FITC-dextrano para medir la permeabilidad de la barrera epitelial

  1. Ratones rápidos durante 4 h antes del ensayo.
  2. Disolver 4 kDa de FITC-dextrano en 1x PBS estéril a una concentración final de 80 mg/ml.
  3. Prepare lo suficiente para 150 μL por ratón, más 50 μL adicionales para la curva estándar.
    NOTA: Minimice la exposición a la luz de la solución de FITC-dextrano y las muestras de plasma durante todo el procedimiento.
  4. Sujete suavemente (descoheces) cada ratón y administre 150 μL de la solución de FITC-dextrano por sonda oral.
    NOTA: Inicie un temporizador inmediatamente después de administrar la primera sonda. Espere de 10 a 15 minutos entre cada ratón posterior para permitir tiempo suficiente para que la eutanasia y los procedimientos posteriores se realicen de manera escalonada, minimizando la variabilidad debido a las diferencias de tiempo.
  5. Mantenga a los ratones sin comida durante 4 h.
  6. Eutanasia a los ratones con isoflurano al 5% (anestésico inhalante administrado con 1,5 L de oxígeno / min) seguido de dióxido de carbono de acuerdo con el procedimiento institucional estándar. Recolecte sangre mediante punción cardíaca con agujas de 25 G y jeringas de 1 ml.
  7. Agregue inmediatamente 10 μL de solución de ácido-citrato-dextrosa a cada 100 μL de sangre recolectada como anticoagulante. Mezclar bien por inversión.
  8. Centrifugar a 1500 x g durante 10 min a 4 °C y transferir cuidadosamente el plasma (sobrenadante) a tubos de microcentrífuga marcados de 1,7 ml. Mantenga las muestras en hielo y protegidas de la luz hasta el análisis.
  9. Diluya cada muestra de plasma 1:2 y 1:10 con 1x PBS.
  10. Agregue 100 μL de cada dilución a una placa opaca de 96 pocillos por duplicado.
  11. Realice diluciones en serie 1:2 del stock original de 80 mg/ml de FITC-dextrano utilizando 1x PBS para lograr las siguientes concentraciones: 3000, 1500, 750, 375, 187,5, 93,8, 46,9, 23,4 y 0 ng/ml. Agregue 100 μL de cada concentración a la placa de 96 pocillos por duplicado.
  12. Mida la fluorescencia a una excitación de 485 nm y una emisión de 535 nm utilizando un lector de microplacas.

2. Evaluación de patología macroscópica

  1. Después de la extracción de sangre para el ensayo FITC-dextrano, extirpe cuidadosamente todo el intestino delgado.
  2. Retire suavemente la grasa y el tejido conectivo adheridos.
    NOTA: Tenga cuidado al manipular el tejido, ya que las regiones enfermas pueden ser frágiles y propensas a desgarrarse.
  3. Coloque el intestino plano sobre una hoja de papel blanco en blanco para un contraste óptimo. Inspeccione visualmente el tejido en busca de signos macroscópicos de enfermedad. La inflamación se localiza típicamente en los 10 cm distales del intestino delgado en el ratón SHIP-/-.
    NOTA: Las características macroscópicas clave a evaluar incluyen cambios de color, con regiones que muestran enrojecimiento o hiperemia visibles en relación con el tejido adyacente de apariencia normal. Además, examine el engrosamiento del tejido, ya que las áreas afectadas pueden parecer hinchadas, edematosas o rígidas a la palpación suave. Busque la presencia de sangre, que puede aparecer como manchas hemorrágicas visibles, decoloración de color rojo oscuro o sangre adherida.
  4. Alinee el intestino junto a una regla para la escala y tome una foto para documentar los hallazgos patológicos macroscópicos.

3. Evaluación histológica

  1. Elimine el contenido intestinal enjuagando suavemente la luz con 1x PBS con una jeringa. No aplique demasiada fuerza al tejido, ya que esto puede distorsionar la arquitectura de las vellosidades y las criptas.
  2. Identificar y recolectar aproximadamente 1 cm del íleon distal que sea más representativo de la patología macroscópica. Incluya las regiones afectadas visibles, si están presentes. Para las comparaciones (SHIP+/+ vs. SHIP-/-), asegúrese de que los tejidos se recolecten de ubicaciones anatómicas coincidentes.
    NOTA: Para la evaluación inicial de la eficacia del tratamiento, se recomienda preparar el íleon como un rollo suizo. Este método proporciona una visualización global de la enfermedad y reduce el sesgo de muestreo.
  3. Coloque el tejido plano en un casete de histología, colocándolo entre esponjas para evitar que se doble.
  4. Para la tinción de hematoxilina y eosina (H&E) y tricrómico de Masson, fije el tejido en formalina tamponada neutra al 10% durante la noche a 4 °C, utilizando al menos 10-20 veces el volumen de tejido (aproximadamente 5 ml por casete) y asegurándose de que todos los casetes estén completamente sumergidos. Transfiera los casetes a etanol al 70% para su almacenamiento, manteniéndolos completamente sumergidos hasta el procesamiento.
    NOTA: La formalina al 10%, un fijador que contiene formaldehído al 3,7%, es un potente irritante respiratorio, un sensibilizador dérmico y está clasificado como carcinógeno humano. La inhalación, la ingestión o el contacto con la piel pueden provocar toxicidad aguda, mientras que la exposición crónica puede aumentar el riesgo de cáncer. Todos los procedimientos que involucran formalina deben realizarse en una campana extractora de productos químicos certificada mientras se usa el equipo de protección personal (EPP) adecuado, que incluye una bata de laboratorio, guantes resistentes a productos químicos y protección para los ojos. Recoja los desechos en contenedores claramente etiquetados como "Residuos de formalina" para su eliminación adecuada de acuerdo con los protocolos institucionales de desechos peligrosos. Todos los materiales contaminados con formalina (p. ej., puntas de pipeta, pañuelos, guantes) deben tratarse como desechos químicamente peligrosos y desecharse siguiendo los procedimientos locales de salud y seguridad ambiental (EHS).
  5. Para la tinción de azul alcián/PAS, fije el tejido en la solución de Carnoy (etanol al 60%, cloroformo al 30% y ácido acético glacial al 10%) a 4 °C durante la noche, utilizando aproximadamente 5 ml por casete o 10-20 veces el volumen del tejido. Transfiera los casetes a etanol al 100% para su almacenamiento hasta su procesamiento.
    NOTA: La solución de Carnoy está compuesta por 60% de etanol, 30% de cloroformo y 10% de ácido acético glacial. Esta mezcla es altamente volátil, inflamable y tóxica. Manipule la solución de Carnoy exclusivamente en una campana extractora y guárdela en recipientes herméticamente cerrados, lejos de fuentes de calor o ignición. Los desechos de Carnoy deben recolectarse en contenedores designados para solventes orgánicos mezclados y eliminarse de acuerdo con las pautas institucionales de desechos peligrosos. Todos los materiales contaminados con la solución de Carnoy deben tratarse como desechos químicamente peligrosos.
  6. Incruste los tejidos en parafina y corte secciones de 5 μm para teñirlos.
  7. Califique las secciones ileales teñidas con H&E en una escala de 16 puntos de acuerdo con los criterios de la Tabla 1. La puntuación final del daño histológico se determina promediando las puntuaciones de 2 revisores, que están cegados a la condición experimental.
  8. Evalúe las secciones transversales teñidas con tricrómico de Masson utilizando una escala de 6 puntos basada en los criterios de la Tabla 2. La puntuación final de fibrosis se calcula como la mediana de las puntuaciones asignadas por dos revisores independientes cegados a las condiciones experimentales.

4. Evaluación de citocinas

  1. Después de la disección y extracción de la muestra de histología, recolecte la porción restante de los 10 cm distales del íleon.
  2. Seque el tejido y registre el peso. Congele rápidamente en nitrógeno líquido y almacene a -80 °C para su procesamiento futuro.
  3. Cuando esté listo para el procesamiento, recupere el pañuelo y manténgalo en hielo en todo momento.
  4. Pesar las muestras de tejido. Prepare suficiente tampón de homogeneización para todas las muestras añadiendo inhibidores de la proteasa a 1x PBS (aprotinina y leupeptina, cada uno a 10 μg/ml). Use 10 μL de tampón por mg de tejido (p. ej., 100 mg de tejido requieren 1 ml de tampón).
    NOTA: El tampón de homogeneización debe prepararse fresco el día de la homogeneización para garantizar que los inhibidores de la proteasa sean efectivos.
  5. Homogeneice el tejido ileal de espesor total en un tampón de homogeneización helado con un homogeneizador de sobremesa. Asegúrese de que el homogeneizado sea uniforme y libre de fragmentos de tejido visibles. Enjuague bien la punta del homogeneizador con PBS entre muestras para evitar la contaminación cruzada.
  6. Centrifugar los homogeneizados de tejido a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C.
  7. Alícuotas de los sobrenadantes clarificados para evitar ciclos de congelación-descongelación y almacenar a -80 °C para futuros análisis.
  8. Realice ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) en sobrenadantes clarificados para cuantificar las citocinas de interés, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    NOTA: La densidad óptica a 450 nm se midió utilizando el lector de microplacas Varioskan LUX con el software Skanlt RE 7.0.2, con una longitud de onda de referencia de 570 nm para su corrección. Se utilizó Microsoft Excel para el análisis de datos y se interpolaron los valores de absorbancia dentro del rango lineal de la curva estándar para determinar las concentraciones de citoquinas.

Resultados

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Los ratones SHIP+/+ y SHIP-/- de 6 semanas de edad fueron sometidos por vía oral a 0,5% de β-ciclodextrina (control del vehículo; n = 6/genotipo) o 3 mg/kg de dexametasona (n = 6/genotipo) diariamente durante 2 semanas. El momento y la duración del tratamiento dependen del modelo y deben considerar el inicio y la tasa de progresión de la enfermedad, así como si la intervención está destinada a ser profiláctica o terapéutica. Se debe utilizar un número igual de ratones machos y hembras en los experimentos. Aunque no hemos identificado diferencias basadas en el sexo en la historia natural de la enfermedad en ratones SHIP-/-, los diferentes protocolos de tratamiento pueden mostrar respuestas específicas por sexo. En este modelo, el tratamiento profiláctico de 4 a 6 semanas de edad se puede usar para prevenir la aparición de inflamación y fibrosis, mientras que los regímenes terapéuticos realizados de 6 a 8, 8 a 10 o 6 a 10 semanas de edad se pueden usar para evaluar la eficacia del tratamiento para la enfermedad establecida. La dosificación y el momento óptimos deben guiarse por la literatura y los estudios de titulación. Hemos demostrado previamente que este régimen de dosificación de dexametasona es eficaz cuando se administra después de que se ha desarrollado la inflamación ileal.

En la Figura 1A se describe un cronograma recomendado para el día de la cosecha. La dexametasona no indujo ninguna patología intestinal en los ratones SHIP+/+ según el examen macroscópico. Los ratones SHIP-/- mostraron áreas visibles de enrojecimiento y engrosamiento, indicativas de inflamación. Estas características patológicas macroscópicas estaban ausentes en ratones SHIP-/- tratados con dexametasona (Figura 1B). Para evaluar la función de barrera intestinal, se midieron las concentraciones plasmáticas de FITC-dextrano después de la sonda oral. Aunque no son estadísticamente significativos, los ratones SHIP-/- tenían concentraciones plasmáticas elevadas de FITC-dextrano en comparación con los controles SHIP+/+, lo que sugiere una mayor permeabilidad intestinal. El tratamiento con dexametasona redujo las concentraciones de FITC-dextrano en ratones SHIP-/- a concentraciones similares a las observadas en ratones SHIP+/+ (Figura 1C).

El examen histológico de las secciones transversales intestinales de ratones SHIP-/- reveló características patológicas distintivas, incluida la infiltración de células inmunitarias, la alteración de la arquitectura de la cripta de las vellosidades, la hiperplasia/hipertrofia de las células caliciformes y el engrosamiento de la capa muscular (Figura 2A). Estas características se reflejaron en puntuaciones de daño histológico significativamente más altas en comparación con los ratones SHIP+/+ (p = 0,0005, Figura 2B). No se observó daño histológico en ratones SHIP+/+ tratados con dexametasona. De acuerdo con las mejoras observadas en la patología macroscópica y la función de barrera, la dexametasona redujo la histopatología en ratones SHIP-/-, aunque el efecto no fue estadísticamente significativo (p = 0,0981, Figura 2A y Figura 2B). La tinción tricrómica de Masson reveló una deposición sustancial de colágeno en los tejidos intestinales SHIP-/-, acompañada de puntuaciones de fibrosis significativamente más altas en comparación con los controles SHIP+/+ (Figura 2C). La dexametasona atenuó eficazmente las características fibróticas en ratones SHIP-/-, reduciendo las puntuaciones de fibrosis a valores comparables a los de los controles SHIP+/+ (Figura 2C). Además, la tinción con azul alcian / PAS confirmó hiperplasia / hipertrofia de células caliciformes en ratones SHIP-/-, que se redujo con el tratamiento con dexametasona (Figura 2D).

Para evaluar las concentraciones de citoquinas inflamatorias, se realizaron ELISA en homogeneizados de tejido ileal de espesor total (Figura 3A). Las concentraciones de IL-1β fueron significativamente más altas en ratones SHIP-/- en comparación con los controles SHIP+/+ (p = 0,0468), lo que se alinea con los hallazgos anteriores que correlacionan la expresión de IL-1β con la gravedad de la enfermedad en este modelo. El tratamiento con dexametasona redujo significativamente las concentraciones de IL-1β en ratones SHIP-/- (p = 0,0023). De acuerdo con informes anteriores, las concentraciones de IL-6 o TNF no difirieron entre los cuatro grupos experimentales. También medimos las concentraciones de las proteínas mieloperoxidasa (MPO) y lipocalina-2 (LCN-2) asociadas a neutrófilos en homogeneizados ileales de espesor total como marcadores bioquímicos adicionales de inflamación (Figura 3B). Las concentraciones de MPO y LCN-2 fueron significativamente más altas (p = 0,0031 y p = 0,0002 respectivamente) en ratones SHIP-/- en comparación con los controles SHIP+/+, aunque el aumento de LCN-2 fue impulsado en gran medida por las altas concentraciones medidas en 2 de 6 ratones. El tratamiento con dexametasona redujo la MPO y redujo modestamente la LCN-2, las diferencias no fueron significativas. Estos datos sugieren que la MPO es un marcador útil de inflamación en ratones SHIP-/-, mientras que las concentraciones de LCN-2 no son tan consistentes o confiables.

Para investigar la relación entre las características inflamatorias y fibróticas en el modelo de ratón SHIP-/-, realizamos análisis de correlación de Spearman utilizando puntuaciones de daño histológico, puntuaciones de fibrosis y concentraciones de IL-1β de tejido ileal de espesor total (Figura 4). Las concentraciones de IL-1β se correlacionaron positivamente con las puntuaciones de daño histológico (r = 0,6813), lo que indica que el aumento de la inflamación se asoció con un mayor daño tisular (Figura 4A). También se observó una correlación moderada entre las concentraciones de IL-1β y las puntuaciones de fibrosis (r = 0,4117), lo que sugiere un vínculo entre la producción de citoquinas inflamatorias y la remodelación fibrótica (Figura 4B). Además, las puntuaciones de daño histológico se correlacionaron significativamente con las puntuaciones de fibrosis (r = 0,6241), lo que sugiere que el daño estructural y la fibrosis progresan en paralelo en ratones SHIP-/- (Figura 4C).

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Figura 1: La dexametasona reduce la patología intestinal macroscópica y la permeabilidad en ratones SHIP-/-. Los ratones SHIP+/+ y SHIP-/- fueron sometidos diariamente a una β-ciclodextrina al 0,5% como control del vehículo (VC) o dexametasona (Dex; 3 mg/kg) de 6 a 8 semanas de edad. (A) Cronograma experimental recomendado. (B) Se evaluó la morfología macroscópica del ciego y el íleon distal, y se muestran imágenes representativas (n = 4-6 ratones por grupo). Los asteriscos denotan áreas de enrojecimiento y engrosamiento irregulares observados en el examen macroscópico. Las imágenes pretenden servir como ejemplos representativos de la patología general y no están destinadas a un análisis cuantitativo. (C) Para evaluar la permeabilidad intestinal, los ratones se ayunaron durante 4 h y se les administraron 80 mg / ml de FITC-dextrano. Después de 4 h adicionales de ayuno, se recolectó sangre mediante punción cardíaca y se midieron las concentraciones plasmáticas de FITC-dextrano. Los datos se presentan como media±DE. La barra gris representa el rango de concentraciones plasmáticas de FITC-dextrano típicamente observadas en ratones sanos C57BL / 6 cuatro horas después de la sonda25. La significación estadística se determinó mediante la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: La dexametasona reduce las puntuaciones de daño histológico, el colágeno, el grosor muscular y la hiperplasia e hipertrofia de las células caliciformes en el íleon distal de ratones SHIP-/-. Los ratones SHIP+/+ y SHIP-/- fueron sometidos diariamente a una β-ciclodextrina al 0,5% como control del vehículo (VC) o dexametasona (Dex; 3 mg/kg) de 6 a 8 semanas de edad. (A) Se fotografiaron secciones transversales ileales teñidas con H&E de ratones con un aumento de 10x; barras de escala = 200 μm. (B) Puntuaciones de daño histológico para ratones SHIP+/+ y SHIP-/- expresadas como mediana ± IQR. (C) Las secciones transversales ileales fijas se tiñeron con tricrómico de Masson para la fibrosis; el colágeno se tiñe de azul. Las imágenes se tomaron con un aumento de 10x; Barras de escala = 200 μm. Puntuaciones de fibrosis para ratones SHIP+/+ y SHIP-/- expresadas como mediana ± IQR. (D) Las secciones transversales ileales fijas se tiñeron con azul alcián/PAS. Las imágenes fueron fotografiadas con un aumento del 10×; Barras de escala = 200 μm. Todas las secciones son representativas de n = 6 ratones por grupo (excepto SHIP+/+ Dex y SHIP-/- Dex, n = 5). La significación estadística para la puntuación de daño histológico se determinó mediante la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: La dexametasona reduce las concentraciones de IL-1β en homogeneizados ileales de espesor total de ratones SHIP-/-. Los ratones SHIP+/+ y SHIP-/- fueron sometidos diariamente a una β-ciclodextrina al 0,5% como control del vehículo (VC) o dexametasona (Dex; 3 mg/kg) de 6 a 8 semanas de edad. (A) Las concentraciones de IL-1β, TNF e IL-6 se midieron en homogeneizados ileales de espesor total. (B) Se midieron las concentraciones de mieloperoxidasa (MPO) y lipocalina-2 (LCN-2) en homogeneizados de tejido ileal de espesor total. Los datos se presentan como media ± DE. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Las concentraciones de IL-1β se correlacionan positivamente con el daño histológico y la fibrosis y la fibrosis se correlaciona con la puntuación de daño histológico en ratones SHIP-/-. Se realizó un análisis de correlación de Spearman para evaluar las relaciones entre la puntuación de daño histológico, la puntuación de fibrosis y las concentraciones de IL-1β en tejido ileal de espesor total de ratones SHIP-/-. Se observaron correlaciones positivas significativas entre (A) la puntuación de daño histológico y las concentraciones de IL-1β (r = 0,6813), (B) la puntuación de fibrosis y las concentraciones de IL-1β (r = 0,4117), y (C) la puntuación de daño histológico y la puntuación de fibrosis (r = 0,6241). Cada punto de datos representa un mouse individual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Componente de dañoPuntuación
Pérdida de la arquitectura de la cripta0 = ninguno
1 = <25% de pérdida
2 = 25-50% de pérdida
3 = 50-75% de pérdida
4 = >75% de pérdida
Infiltración de células inmunitarias0 = ninguno
1 = célula inmune ocasional en la lámina propia
2 = aumento de células inmunitarias en la lámina propia
3 = células inmunitarias confluentes en la lámina propia y rotura de la mucosa
4 = infiltración de células inmunitarias en toda la sección
Hiperplasia e hipertrofia de células caliciformes0 = ninguno
1 = <50% de aumento en el número y tamaño de las células caliciformes
2 = >50% de aumento en el número y tamaño de las células caliciformes
Ulceración0 = ninguno
1 = ulceración intermedia
2 = ulceración sustancial
Edema0 = ninguno
1 = <50% de la sección
2 = >50% de la sección
Engrosamiento muscular0 = ninguno
1 = espesamiento intermedio
2 = espesamiento sustancial

Tabla 1: Puntuaciones de daño histológico. El daño histológico de las secciones transversales ileales de ratones SHIP+/+ y SHIP-/- teñidos con H&E se califican en función de las características clave de la ileítis que caracterizan el modelo de ratón SHIP-/-, incluida la pérdida de arquitectura (0-4), la infiltración de células inmunitarias (0-4), la hiperplasia e hipertrofia de células caliciformes (0-2), la ulceración (0-2), el edema (0-2) y el engrosamiento muscular (0-2).

Componente de fibrosisPuntuación
Exceso de colágeno0 = Arquitectura normal; Sin exceso de colágeno
1 = Aumento leve de colágeno; limitado a submucosa o subserosa
2 = Expansión moderada del colágeno en la submucosa y muscular propia parcial, con haces desorganizados
3 = Colágeno extenso y denso que reemplaza la estructura normal, que involucra la submucosa y la muscular (transmural)
Hiperplasia fibromuscular/muscularización/obliteración muscular de la submucosa0 = Ninguno, contenido normal de submucosa muscular
1 = Aumento leve del contenido muscular
2 = Gran cantidad de músculo en la submucosa, afecta la morfología pero la estructura normal
3= El músculo ha obliterado todo el espacio submucoso

Tabla 2: Puntuación de fibrosis. La fibrosis en secciones transversales ileales de ratones SHIP+/+ y SHIP-/- teñidos con tricrómico de Masson se puntuó en función de las características clave de la fibrosis intestinal observadas en el modelo SHIP-/-, incluida la deposición excesiva de colágeno (0-3) y la hiperplasia fibromuscular o la obliteración muscular de la submucosa (0-3). El colágeno se evalúa para determinar la extensión y la alteración arquitectónica, mientras que los cambios musculares se evalúan en función del grado de infiltración muscular y distorsión de la estructura submucosa.

Discusión

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Este protocolo describe los procedimientos para evaluar la ileítis y la fibrosis intestinal en ratones SHIP-/-, un modelo murino de inflamación intestinal similar a la EC con patología fibrótica acompañante. El modelo de ratón SHIP-/- recapitula características de la EC que no se observan comúnmente en otros modelos de ratón de inflamación intestinal, específicamente la localización ileal, la inflamación en parches y transmurales y la patología fibrótica19,26. Combinado con la facilidad de reproducción y el corto tiempo para la manifestación de la enfermedad, el modelo SHIP-/- está bien posicionado como una herramienta poderosa para la investigación traslacional en EC19.

En este estudio, la significación estadística para el ensayo FITC-dextrano y la puntuación histológica se evaluaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis, ya que estos conjuntos de datos no cumplieron con los supuestos de normalidad requeridos para un ANOVA de una vía, y las puntuaciones histológicas representan variables discontinuas y no paramétricas. Si bien nuestros análisis no arrojaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos tratados con dexametasona y tratados con vehículo, observamos tendencias claras. La dexametasona redujo la permeabilidad intestinal y la histopatología de los ratones SHIP-/-, y estos efectos pueden haber alcanzado significación con tamaños de muestra más grandes.

Pueden surgir varios desafíos técnicos al realizar este protocolo. Con respecto a la manipulación de tejidos, los SHIP-/- ilea requieren una manipulación suave durante la disección, ya que son propensos a desgarrarse. Esto es particularmente importante cuando se preparan tejidos para imágenes macroscópicas. La fijación tisular es otro factor crítico para el análisis histológico. El tejido fijado en formalina es adecuado tanto para la tinción de H&E como para la tinción tricrómica de Masson, pero es incompatible con la tinción de azul alcián/PAS. Por el contrario, el tejido fijado de Carnoy es apropiado para la tinción de H&E y Alcian Blue/PAS, pero no para el tricrómico de Masson. La fijación de Carnoy conduce a una tinción intensa y difusa de color azul oscuro, que oscurece la visualización del colágeno y la capa muscular. Para el análisis de citoquinas, es esencial procesar muestras en hielo, ya que las citocinas son muy sensibles a la degradación. Es fundamental homogeneizar el tejido clarificado en alícuotas inmediatamente después del procesamiento. Los ciclos repetidos de congelación y descongelación pueden comprometer sustancialmente la integridad de las citocinas y socavar cualquier diferencia potencial entre genotipos y / o grupos de tratamiento. Por último, para garantizar una cuantificación precisa, recomendamos realizar múltiples diluciones de cada muestra para confirmar que las lecturas se encuentran dentro del rango lineal de la curva estándar del ensayo y para minimizar la posible interferencia de la matriz tisular compleja. Abordar estas consideraciones técnicas es esencial para generar resultados reproducibles e interpretables, pero la variabilidad biológica inherente a los ratones SHIP-/- también debe manejarse cuidadosamente.

Hay varios aspectos críticos de los ratones SHIP-/- que también deben tenerse en cuenta y controlarse cuidadosamente para garantizar la reproducibilidad y minimizar las variables de confusión. El microbioma intestinal tiene un profundo impacto en el desarrollo de la enfermedad y las respuestas terapéuticas en modelos murinos de EII27,28. Nuestro trabajo anterior ha demostrado que la inflamación intestinal en ratones SHIP-/- depende de la microbiota y puede mejorarse con antibióticos29. Por lo tanto, se deben usar controles de compañeros de cama para reducir la variabilidad impulsada por el microbioma, y los grupos de tratamiento deben equilibrarse para el origen de la jaula30. Además, es esencial tener una cuidadosa coincidencia sexual. Aunque no se han observado diferencias basadas en el sexo en la penetrancia o la gravedad de la enfermedad en ratones SHIP-/-, otros modelos de ileítis como SAMP1/YitFc, exhiben un inicio más temprano y una mayor gravedad de la enfermedad en las hembras14,31. Como las hormonas sexuales también pueden modular la composición microbiana32, la coincidencia por sexo es fundamental para minimizar los posibles factores de confusión en los estudios de tratamiento. Además, los tratamientos individuales que se están evaluando pueden tener una eficacia diferencial en ratones machos y hembras. Aunque los hallazgos actuales no revelan diferencias relacionadas con el sexo en la enfermedad o la respuesta terapéutica a la dexametasona, se debe realizar el emparejamiento por sexo en todos los estudios de tratamiento.

Además de las consideraciones sobre el microbioma y el sexo descritas anteriormente, es importante incluir ratones SHIP+/+ en los estudios de tratamiento para evaluar los efectos del vehículo y los agentes terapéuticos en ausencia de inflamación intestinal. Esto asegura que ni el fármaco ni su método de administración causen o contribuyan a la patología en el intestino sano, mejorando así la interpretación de la eficacia terapéutica y la seguridad.

El momento de la intervención del tratamiento también es esencial y debe modificarse de acuerdo con los objetivos experimentales, ya que existen diferencias significativas tanto en la inflamación como en la fibrosis en ratones a las 4, 8 y 12 semanas de edad19,26. Los ratones SHIP-/- desarrollan inflamación intestinal a partir de las 4 semanas de edad, y todos los ratones presentan inflamación a las 6 semanas de edad, y los marcadores de patología fibrótica se pueden medir a las 6 semanas de edad y están bien establecidos a las 8 semanas de edad19,26. Por lo tanto, los tratamientos dirigidos a la inflamación ileal deben comenzar a las 6 semanas de edad. Las intervenciones antifibróticas pueden iniciarse de forma profiláctica a las 6 semanas o terapéuticamente entre las 8 y las 10 semanas. Sin embargo, el inicio y la gravedad de la enfermedad pueden variar con el entorno microbiano, que difiere entre las instalaciones. Los investigadores primero deben determinar la cinética de la enfermedad en su colonia antes de implementar protocolos de tratamiento. Además, los ratones SHIP-/- pueden presentar una reducción de peso de hasta el 17% a las 4-5 semanas, con un 5% adicional a las 8-10 semanas33. Los animales que exhiben una pérdida de peso profunda deben excluirse de los estudios, ya que esto refleja una manifestación grave de la enfermedad y puede socavar los resultados del tratamiento relacionados con la patología intestinal.

Una consideración importante al analizar la progresión de la enfermedad en el modelo SHIP-/- es la selección de marcadores inflamatorios apropiados. Según nuestra amplia experiencia con el ratón SHIP-/-, el perfil de citocinas generalmente se centra en mediadores específicos, como IL-1β, que se sabe que se regulan al alza durante la progresión de la enfermedad. Sin embargo, para la caracterización inicial de las respuestas inflamatorias o cuando se evalúan nuevas estrategias terapéuticas, es aconsejable un análisis de citocinas multiplex. Este enfoque imparcial permite un perfil más amplio del medio inflamatorio y puede revelar objetivos inesperados relevantes para la patogénesis de la enfermedad o la respuesta al tratamiento.

El modelo de ratón SHIP-/- ofrece ventajas prácticas que permiten la reproducibilidad y la eficiencia. Los ratones SHIP-/- desarrollan inflamación ileal y fibrosis espontáneas y constantes sin necesidad de desencadenantes exógenos. Esto elimina la variabilidad asociada con la preparación de reactivos y los protocolos de dosificación no estandarizados al inducir la inflamación intestinal. El inicio de la enfermedad es rápido, con inflamación evidente a las 4-6 semanas de edad y fibrosis a las 8 semanas de edad, lo que hace que el modelo sea eficiente en tiempo y costo. Además, los ratones SHIP-/- son fáciles de criar y mantener, el genotipado es sencillo y no se requieren estrategias de reproducción especializadas. Esto simplifica el manejo de las colonias, reduce la carga de trabajo técnico y disminuye el riesgo de introducir variabilidad genética no deseada 19,21,26. La enfermedad se puede evaluar de manera confiable utilizando técnicas ampliamente disponibles en la mayoría de los entornos de investigación, incluido el ensayo FITC-dextrano, H&E y la tinción tricrómica de Masson y ELISA. Estas características combinadas respaldan un diseño de estudio eficiente, reducen las barreras financieras y técnicas y promueven la generación de datos consistentes entre laboratorios.

Si bien el modelo SHIP-/- presenta ventajas únicas, el modelo también tiene limitaciones. Al igual que con todos los modelos preclínicos, no puede replicar completamente la naturaleza compleja y multifactorial de la EII humana, que está influenciada por factores genéticos, inmunológicos y ambientales34. Los modelos DSS y TNBS siguen siendo muy populares debido a su simplicidad y rentabilidad. Cuando se combinan con modificaciones genéticas, estos modelos químicos pueden servir como herramientas efectivas para comprender las contribuciones específicas de los genes a la función de barrera35. Sin embargo, su principal utilidad radica en modelar la lesión epitelial aguda; no logran captar la patología crónica inmunomediada que caracteriza a la EC y su mecanismo de daño epitelial inducido por agentes químicos que carecen de relevancia clínica directa36. La dependencia exclusiva de un modelo puede dar lugar a una evaluación incompleta y/o engañosa del potencial terapéutico, y se recomienda utilizar varios modelos para garantizar la eficacia del tratamiento.

Divulgaciones

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Este trabajo cuenta con el apoyo de las instalaciones de Cuidado de Animales del Instituto de Investigación del Hospital Infantil de Columbia Británica y la financiación del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá a través de la Red Canadiense de Glicómica (GlycoNet, una red de centros de excelencia) y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (MOP-133607 a LS). K.S. y W.M. son beneficiarios de las becas de doctorado TRIANGLE (TRaIning a New generation of researchers in Gastroenterology and LivEr program).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microtubo de 1,7 mL con tapa de presión;DiamedSPE155-N
1x DPBS (sin cloruro de calcio, sin cloruro de magnesio)GibcoREF 14190-144
25G x figure-materials-1” agujas BDREF 305122Para punción cardíaca
26G x figure-materials-2” agujasBDREF 305110Enjuaguido intestinal
Ácido acéticoSigma-AldrichA6283Histología
Solución de dextrosa de citrato ácido (38 mM de ácido cítrico, 107 mM de citrato de sodio, 136 mM de dextrosa)Millipore SigmaC3821
Aguja de alimentación animal, no estéril, reutilizable, tipo 304SSMillipore Sigma CAD7900 Para gavage
Straight
Talla: 24G,
Lxdiam. 1 pulgada. x bola de 1,25 mm,
AprotininaCayman Chemical9087-70-1Búfer de homogeneización
Jeringuilla BD Luer-Lok estéril, de un solo uso, 5 mLBDREF 309646Enjuaguido intestinal
BD OptEIA Mouse IL-6 ELISA SetBD Biociencias555240
BD OptEIA Mouse TNF ELISA Set IIBD Biociencias558534
BD® Jeringuilla Luer Slip Tip estéril, de un solo uso, 1 mLBDREF 309659
Almohadillas de espuma para biopsia cuadradas, 30,2 x 25,4 x 2 mm de alto.Simport ScientificREF M476-1Histología
Formalde-Fresh tamponado (Formol de bajo olor, 10% de formalina)Fisher ChemicalSF93-4Histología
Placas inmunológicas no estériles de fondo plano transparentes de 96 pozosTermo Científica439454
Centrífuga refrigerada Eppendorf 5415R  Marshall ScientificEP-5415R
Alcohol etílico anhidroGreenfield GlobalP016EAANHistología
Casete de tejido Fisherbrand TRU-FLOWFisher Scientific15-200-403Histología
FITC-dextran, 3-5kDa (1g)Millipore SigmaFD4-1G
Número CAS: 60842-46-8
LeupeptinaMillipore Sigma103476-89-7Búfer de homogeneización
Mouse IL-1 beta/IL-1F2 DuoSet ELISA R& Sistemas DDY401
Placa multipantalla de 96 pozos, fondo sólidoMillipore SigmaMSSWNFX40Blanco, no estéril, no tratado
Cloroformo OmniPurMillipore Sigma3150Histología
Homogeneizador politrón PT-MR2100Cinemática AG632081
Lector de microplacas multimodo Varioskan LuxTermo CientíficaVL0L00D0

Referencias

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