Artículo de método

Modelo de Ratón de Embolia Microvascular para Microscopía de Dos Fotones In Vivo usando Microsferas de Poliestireno Fluorescente

DOI:

10.3791/68939

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21 de noviembre de 2025

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1Biomedical Engineering and Physics, Amsterdam University Medical Center, University of Amsterdam, 2Amsterdam Neuroscience, neurovascular disorders, 3Amsterdam Cardiovascular Sciences

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo contiene una descripción detallada de un enfoque paso a paso para un modelo ratón de ventana craneal crónica y embolia microvascular, optimizado para la imagen in vivo de microscopía de dos fotones utilizando microesferas fluorescentes de poliestireno.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las oclusiones microvasculares en el cerebro son relativamente comunes, pero siguen siendo en gran medida poco estudiadas. La tasa de eventos, las consecuencias a largo plazo y los posibles mecanismos de liquidación son en gran medida desconocidos. Los modelos actuales utilizados para estudiar estos eventos, como la fototrombosis y la inyección de microémbolos, tienen cada uno sus propias ventajas y limitaciones. Este estudio desarrolló un protocolo detallado que combina la preparación de una ventana craneal crónica con la inducción de embolias microvasculares cerebrales mediante la inyección intraarterial de microesferas en ratones. Este sistema permite la obtención de imágenes in vivo a largo plazo de la microvasculatura y microoclusiones mediante microscopía de dos fotones. Las microesferas se administran mediante un catéter situado en la arteria carótida externa (ECA), que está permanentemente ligada. Es importante destacar que la arteria carótida común (ACC) y la arteria carótida interna (ACI) permanecen intactas durante y después del procedimiento, minimizando así la alteración del flujo sanguíneo cerebral. Para facilitar la imagen in vivo inmediata y evitar el agrupamiento o adhesión de microesferas a las puntas de la pipeta y al catéter, las microesferas se suspenden en una mezcla de FITC-Dextran y 0,1% Tween 20. La técnica de inyección fue validada mediante imágenes 3D post mortem in situ para determinar la distribución de las microesferas. Este estudio demuestra aún más su utilidad con un ejemplo in vivo de microscopía de dos fotones. Este enfoque proporciona un método consistente y robusto para inducir y estudiar embolias microvasculares, permitiendo investigar su impacto y dinámica de eliminación mediante imágenes in vivo de alta resolución.

Introducción

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Un ictus isquémico debido a embolia de una arteria cerebral grande es un evento agudo y a menudodevastador 1. Los émbolos también pueden aparecer en vasos más distales. Como resultado, pueden desarrollarse infartos cerebrales silenciosos (SBIs); Como su nombre indica, estos permanecen asintomáticos y suelen descubrirse incidentalmente durante la imagen por razones no relacionadas 2,3. Las SBI son comunes y se encuentran entre las condiciones cerebrovasculares más observadas en autopsias de personas mayores 4,5. Estudios epidemiológicos han mostrado una prevalencia del 20% en personas sin antecedentes de ictus. Los SBI contribuyen a la disfunción cognitiva y la demencia, aumentan la mortalidad general y son un factor de riesgo para futuros accidentes cerebrovasculares 6,7,8. Los infartos suelen tener solo unos pocos milímetros de diámetro y están asociados a la oclusión de arterias penetrantes con diámetros aproximados de 100 μm. Estos penetradores dan lugar a un extenso lecho arteriolar y capilar. Un pequeño microtrombo que atraviesa las arterias penetrantes y se aloja en la microcirculación aguas abajo probablemente permanecerá indetectable en laangiografía 9. Sin embargo, muchos microtrombos pueden liberarse en fibrilación auricular, placas ateroscleróticas y de otras fuentes 10,11,12,13,14. Además de los microtrombos, otras micropartículas (MPs), incluyendo partículas grasas, agregados celulares e incluso microplásticos, pueden causar embolias microvasculares. Varios estudios muestran la presencia de MP plástica en la sangre y el cerebro que es mayor que el diámetro capilar de 5μm 15,16.

Las oclusiones microvasculares siguen siendo relativamente poco estudiadas en comparación con el ictus agudo y el SBI. Se sabe poco sobre la tasa de eventos, las consecuencias a largo plazo y los posibles mecanismos de compensación. Sin embargo, el interés está aumentando rápidamente tras la exitosa introducción clínica de la trombotomía mecánica en el ictus, donde las embolias microvasculares pueden causar una repercusión microvascular deteriorada tras una aparente recanalización exitosa de la arteria culpablegrande 17. Además, hay un aumento en la investigación sobre microplásticos, que puede tener un efecto parcial a través de emboliasmicrovasculares 18,19,20.

Las oclusiones microvasculares en la corteza del ratón pueden estudiarse, entre otras cosas, mediante microscopía multifotónica, utilizando una ventana craneal. Los modelos más utilizados para estudiar oclusiones microvasculares cerebrales son el modelo fototrombótico y el modelo de microsfera. El modelo fototrombótico emplea tintes fotosensibles para inducir embolias en vasos seleccionados (normalmente vasos no capilares) mediante fotoactivación. Sin embargo, este modelo no permite el estudio de embolias durante un periodo prolongado debido a la activación del sistema fibrinolítico, que disuelve laembolia 21,22. Además, la activación del tinte fotosensible produce especies de oxígeno singlete, causando daños endoteliales y de la barrera hematoencefálica(BBB) 23. Para estudios sobre la función endotelial y de la BBB durante embolias cerebrales, y los efectos a largo plazo sobre la circulación cerebral y la función cerebral, se prefiere por ello el modelo de microsfera. El modelo de inyección de microesferas utiliza microsferas inyectadas en la circulación cerebral para ocluir la microvasculaturacerebral 9,24,25,26,27,28,29,30. La posible desventaja de este modelo radica en que no es posible predeterminar la localización de las embolias, a diferencia del método fototrombótico31,32. La ventaja es que se pueden inyectar microesferas de diámetros bien definidos, apuntando así a vasos (micro-) de diámetrosespecíficos 33,34,35.

A lo largo de los años, se han desarrollado múltiples enfoques para la inyección de microsferas en la circulación cerebral de roedores. Estos protocolos encuentran consenso para acceder al triángulo carotídeo, que consiste en la arteria carótida común (CCA), la arteria carótida interna (ICA) y la arteria carótida externa (ECA) para la inyección intraarterial de la microsfera. El método para la inyección intraarterial de microesferas varía entre protocolos de varias maneras. En primer lugar, los estudios utilizaron una jeringuilla 9,26,27,29,33,34 o un catéter 25,28,30,36. En segundo lugar, existe una considerable variación en el número y tamaño de las microesferas inyectadas. Los diámetros de las microsferas suelen oscilar entre 10 y 50 μm, y la elección depende del tamaño del recipiente objetivo. Como regla general, cuanto más grandes sean las microsferas, menor es el número que se debe inyectar, ya que hay menos arteríolas quecapilares 25, 26 y 30.

Lograr una inyección intraarterial constante de microsfera sigue siendo un reto. En la práctica, se inyectan grandes cantidades de microsferas, pero solo una fracción llega a la circulación cerebral. Esto resulta especialmente problemático para estudiar los efectos de microesferas alojadas mediante la imagen microscopía de dos fotones in vivo , ya que el éxito de esta técnica depende de la presencia de microesferas en las capas externas de la corteza del ratón dentro de la vista a través de la ventana craneal preparada. Elegir tintes fluorescentes adecuados para microesferas es fundamental, ya que combinarlos con modelos de ratón transgénico y tinción intravascular puede ser complicado debido a la intensa fluorescencia de las microesferas y los espectros de emisión superpuestos.

Las oclusiones microvasculares se estudian en modelos de roedores, y se han demostrado previamente efectos sinérgicos de múltiples microesferas en cerebros de roedores ex vivo 9, así como una aparente extravasación de tales partículas, un proceso llamado angiofagia 33,35,37,38. Para permitir su investigación in vivo, se desarrollaron métodos para la microscopía multifotónica en ratones con ventanas craneales. El propósito del estudio actual es desarrollar y reportar un protocolo detallado para la inyección intraarterial de microesferas en ratones que optimice el estudio de sus efectos sobre el tejido cerebral y su destino. La principal ventaja de este protocolo es su mayor eficiencia de liberación, minimizando la pérdida de microsferas y aumentando la probabilidad de su presencia en el territorio de la arteria cerebral media (MCA) dentro del área de imagen craneal de la ventana. El protocolo optimizado de inyección de microsferas se evalúa mediante microscopía in vivo de dos fotones e imagen 3D post mortem in situ con un criomicrotomode imagen dedicado 39.

Protocolo

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Todos los procedimientos que involucraban animales seguían la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El Comité Central de Experimentos con Animales de los Países Bajos otorgó la aprobación plena (AVD11400202316817).

NOTA: Se utilizaron ratones macho y hembra de entre 2 meses y 1 año. A la llegada, los animales se aclimataban durante 7 días antes de cualquier procedimiento experimental. Los animales fueron alojados con un máximo de 4 por jaula, se les proporcionó alimento y agua ad libitum, y se mantuvo en un ciclo de 12 horas de luz a oscuridad. Se obtuvieron ratones NG2-DsRed y TIE2-GFP (véase la Tabla de Materiales para más detalles) y se criaron internamente.

1. Implante craneal de ventana

  1. Anestesia y cuidados prequirúrgicos
    1. Añade 0,06 mg/mL de Carprofeno al agua potable un día antes de empezar la cirugía de ventana craneal.
    2. Pesa al ratón y administra 5 mg/kg de Carprofeno y 2 mg/kg de dexametasona por vía subcutánea 30 minutos antes de la cirugía.
    3. Prepara la zona quirúrgica colocando una almohadilla térmica con un sistema de retroalimentación en el marco estereotáctico y cubriéndola con un paño estéril.
    4. Coloca todos los instrumentos quirúrgicos estériles sobre un segundo paño estéril.
    5. Anestesiar al ratón en una cámara de inducción con una mezcla de aire de 1 L/min (30% oxígeno y 70% aire médico) y 3-4% isoflurano, seguido de mantener la anestesia con 1,5-2% de isoflurano usando una mascarilla facial.
    6. Asegura el ratón en un marco estereotáctico e inserta la sonda termómetro de la almohadilla calefactor por vía rectal usando lubricante. Aplica pomada para los ojos para evitar que se resequen y coloca la almohadilla térmica a 37 °C.
    7. Administrar subcutáneamente 1,5 mg/kg de ropivacaína en la línea de la incisión quirúrgica 5 minutos antes de la cirugía.
    8. Limpia la piel sobre el cráneo desde el cuello hasta justo más allá de los ojos con betadine usando una punta de algodón.
  2. Preparación quirúrgica para fijación de barras de cabeza y ventanas
    1. Utilizando pinzas estériles y tijeras quirúrgicas, realiza una incisión inicial en la piel sobre la parte posterior del cráneo. Extiende la incisión desde la sutura lambda hacia adelante a lo largo de la línea media hasta las suturas frontales justo antes del bregma (Figura 1A). Retrae y retira cuidadosamente la piel para exponer completamente los músculos temporales de ambos lados.
    2. Aplica aproximadamente 0,1 mL de lidocaína al 1% en el cráneo para minimizar el sangrado.
    3. Retira el periosteo y rasca todas las zonas del cráneo donde se fijará la barra de la cabeza usando una cuchilla quirúrgica. Haz los arañazos perpendiculares a lo largo del cráneo para asegurar una adherencia firme de la barra de la cabeza.
    4. Limpia la sangre que quede con una punta de algodón y seca el cráneo con aire comprimido.
  3. Fijación de la barra de cabeza
    1. Prepara una mezcla de pegamento dental en un recipiente cerámico frío (4 °C) añadiendo 100 μL de monómero a 0,1 g de polímero y mezclando. Añade 1 gota de catalizador a la mezcla para iniciar la solidificación rápida del pegamento.
    2. Aplica el pegamento en la parte inferior de la barra de cabeza. Inclina ligeramente la barra de la cabeza hacia el lado lateral izquierdo desde el seno sagital y presiona sobre el cráneo. Aplica pegamento adicional en los bordes de la barra de cabeza para sellar todas las aberturas. Esto garantiza una adherencia firme.
    3. Haz una mezcla de cemento dental mezclando 100 μL de líquido de cemento dental con 0,1 g de polvo. Aplica el cemento en todos los lados de la barra de la cabeza mientras evitas que el cemento fluya sobre el cráneo en la zona de perforación. Añadir una capa adicional de cemento dental sobre la barra de cabeza para formar un pozo, permitiendo la aplicación de fluidos sobre la ventana craneal (Figura 1B).
    4. Deja que el pegamento dental y el cemento sequen al menos 10 minutos.
    5. Confirma la adherencia firme de la barra de la cabeza aplicando suavemente presión sobre el cráneo donde se realizará la craneotomía. La barra de la cabeza se adhiere correctamente cuando el cráneo no se mueve y no aparece líquido entre el cemento dental y el cráneo.
  4. Craneotomía
    1. Sujeta el ratón al soporte de imagen usando la barra de cabeza o mantenlo en el marco estereotáctico para asegurar firmemente la cabeza del animal durante la craneotomía.
    2. Marca el objetivo de perforación de craneotomía (4 mm de diámetro) en el cráneo usando un marcador de punta fina. Localiza el MCA visible a través del cráneo para asegurarte de que la ventana craneal esté posicionada de forma óptima, cubriendo la mayor parte posible del MCA. Para confirmar el tamaño y la colocación correctos del objetivo de perforación, sujeta el cristal de la cubierta por encima del área marcada y ajusta el tamaño del objetivo según sea necesario.
    3. Comienza a taladrar en círculos en las marcas sin ejercer presión sobre el cráneo, para evitar la generación de calor (Figura 1C). Enfría el cráneo aplicando solución fisiológica cada 30 segundos. Mientras enfrías, limpia y enfría la cabeza del taladro sumergiéndola en agua y luego secándola con una toalla de papel. Elimina todo el polvo óseo regularmente usando aire comprimido. Confirma el tamaño de la craneotomía colocando el cristal de la cubierta sobre el cráneo y ajustando el taladro si es necesario.
    4. Sigue taladrando en círculos hasta que el hueso esté suficientemente delgado. Las grietas aparecerán en la zona de perforación una vez que el cráneo esté casi perforado. Asegúrate de que el hueso esté suficientemente adelgazado añadiendo solución salina para ablandar el cráneo adelgazado y presionando suavemente la parte media del hueso craneal dentro de la zona de perforación. La zona de perforación es lo suficientemente delgada cuando el cráneo se mueve uniformemente hacia abajo en todos los lados bajo una presión suave. Sigue perforando hasta llegar a este punto. No perforar el cráneo; Esto puede dañar la duramadre y el tejido cerebral. Mantén la zona de perforación empapada en LCR si la duramadre está dañada o se produce sangrado.
      NOTA: Antes de retirar el cráneo, asegúrate de que todo el polvo óseo esté eliminado de la zona de perforación. Las partículas óseas residuales en la duramadre pueden iniciar potencialmente el crecimiento óseo bajo la ventana.
    5. Elimina completamente todo el polvo óseo usando aCSF y aire comprimido. Aplica aCSF en la zona perforada hasta que el cráneo esté completamente sumergido. Utilizando una aguja de calibre 27 (0,4 mm x 16 mm) o 30 (0,3 mm x 13 mm), perfora cuidadosamente el cráneo delgado horizontalmente (~180°), evitando dañar la duramadre y el cerebro. Empuja suavemente el hueso hacia arriba hasta que se desprenda, aplicando la mínima fuerza. Si el hueso no se desprende fácilmente, sigue perforando. Retirar el cráneo desprendido con fórceps, manteniendo el cerebro sumergido en aCSF (Figura 1D).
    6. Enjuaga el cerebro con LCR y luego coloca una esponja hemostática estéril y absorbente de gelatina porcina empapada en LCR en el cerebro para controlar el sangrado local durante 2 minutos. Retira cuidadosamente la esponja, manteniendo el cerebro sumergido en una LCR. Continúa enjuagando con LCR para asegurarte de que no quede polvo óseo ni sangre en el cerebro. Si el sangrado persiste, coloca una esponja hemostática estéril y absorbente fresca empapada en LCR en el cerebro.
      NOTA: El sangrado leve es común durante la extracción ósea. Asegúrate de que el sangrado ha parado antes de colocar el cristal, ya que el sangrado residual puede reducir la claridad de la ventana.
  5. Colocación del vidrio de cubierta
    1. Absorbe el LCR que cubre el cerebro con una punta de algodón, dejando solo una capa fina. Coloca el vaso de la cubierta sobre el cerebro y presiónalo suavemente contra la abertura del cráneo usando micropinzas dobladas. Asegúrate de que el cristal de la cubierta quede ligeramente por debajo del nivel del cráneo y esté situado paralelo a la barra de la cabeza.
      NOTA: El cristal debe presionarse firmemente contra el cerebro para evitar la formación de cavidades y preservar la calidad de la ventana. Mantener el cristal de la cubierta paralelo a la barra de la cabeza garantiza que quede perpendicular al objetivo del microscopio, mejorando la calidad de imagen.
    2. Sujeta el cristal de la cubierta al cráneo y a la barra de la cabeza con cola epoxi, aplicándola en los laterales mientras sujeta el cristal firmemente en su lugar y paralelo a la barra de la cabeza.
    3. Sella todos los bordes del cristal de la cubierta con pegamento para evitar la exposición cerebral. Mantenga una gota de LCR en el cerebro durante la aplicación para evitar que el pegamento se filtre por la ventana o entre en contacto con la duramadre (Figura 1E).
    4. Deja que el pegamento solidifique durante 5 minutos.

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Figura 1: Resumen del protocolo de craneotomía. Ejemplos detallados de imágenes y planos esquemáticos de pasos cruciales durante la craneotomía y la cirugía de colocación de la barra de cabeza. (A) Extracción de la piel (paso 2.2). (B) Fijación de la barra de cabeza (paso 2.3). (C) Perforación de la craneotomía de 4 mm (paso 2.4.3). (D) Extracción del cráneo (paso 1.4.5). (E) Colocación del cristal de cubierta (paso 1.4.7). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

  1. Cuidados postquirúrgicos
    1. Administrar 5 mg/kg de Carprofeno por vía subcutánea.
    2. Transfiere al animal a una jaula de recuperación a 37 °C durante 30 minutos. Luego devuelvo a su jaula con 0,06 mg/mL de Carprofeno en el agua potable durante hasta 2 días tras la cirugía.
    3. Proporcionar comida remojada en 0,06 mg/mL de Carprofeno hasta que el animal recupere su peso previo a la cirugía.
    4. Permite que el animal se recupere al menos 7 días antes de realizar la cirugía modelo de embolia microvascular.

2. Modelo murino de embolia microvascular

  1. Ensamblaje de catéteres
    1. Inserta la punta de un microcatéter de 20 cm de largo (ID 0.23114 OD 0.27432 mm) en un catéter transparente (ID 0.31 OD 0.64 mm) y sella la conexión con pegamento epoxi y cinta adhesiva. Confirma que la longitud total del catéter es suficiente para contener al menos 160 μL.
    2. Inserta una aguja luer-lock calibre 27 (0,1 mm x 16 mm) en el extremo opuesto del catéter transparente. Sella el extremo con cola epoxi y cinta adhesiva.
    3. Llena una jeringuilla de 1 mL con solución salina y conéctala al bloqueo Luer de la aguja del catéter. Enjuaga con 0,7 mL de suero salino, asegurando que no queden fugas ni burbujas de aire.
    4. Llena el catéter con 80 μL de suero fisiológico y marca el nivel alcanzado en el catéter.
  2. Anestesia y cuidados prequirúrgicos
    1. Proporciona al ratón agua potable que contenga 0,06 mg/mL de Carprofeno un día antes de la cirugía de embolia microvascular.
    2. Coloca una almohadilla térmica con sistema de retroalimentación bajo un paño estéril y ponlo a 37 °C.
    3. Coloca todos los instrumentos quirúrgicos estériles sobre un segundo paño estéril.
    4. Pesa al ratón y administra 5 mg/kg de Carprofeno por vía subcutánea 30 minutos antes de la cirugía.
    5. Anestesiar al ratón usando isoflurano al 3-4% en una cámara de inducción con un flujo de gas de 1 L/min compuesto por un 30% de oxígeno y un 70% de aire quirúrgico.
    6. Transfiere al ratón a la mesa quirúrgica y mantenga la anestesia mediante una mascarilla facial que administre isoflurano al 1,5-2% a 1 L/min con 30% de oxígeno y 70% de aire.
    7. Introduce una sonda rectal lubricada y aplica pomada para los ojos para evitar que se reseque.
    8. Coloca una jeringuilla de 2 mL debajo del cuello del ratón supino para facilitar el acceso a la zona quirúrgica.
    9. Asegura suavemente las patas delanteras a la camilla quirúrgica con cinta adhesiva.
    10. Afeita la zona quirúrgica y aplica betadine seguida de lidocaína.
  3. Incisión
    1. Verifica la profundidad de la anestesia usando un pellizco en el dedo del pie.
    2. Realice una incisión mediana de aproximadamente 0,5 cm sobre la tráquea por debajo de la mandíbula utilizando tijeras quirúrgicas y pinzas de disecación.
    3. Diseca el tejido conectivo superficial a la fascia cervical utilizando pinzas microsuturas para exponer los músculos esternohioides subyacentes.
    4. Separa los músculos esternohioides izquierdo y derecho rasgando suavemente el tejido conectivo entre ellos. Retrae el músculo omohioideo derecho caudal lateralmente con un gancho de tejido. Asegúrate de que el triángulo carotídeo derecho, incluyendo el CCA, ICA y ECA, sea claramente visible.
  4. Preparación quirúrgica de la arteria parietal posterior (ECA), ICA, ECA y arteria parietal posterior (PPA)
    NOTA: Evita agarrar o pellizcar el nervio vago; Muévelo solo con cuidado para evitar efectos adversos en la salud del animal. No toques la tráquea, ya que esto puede causar problemas respiratorios. Identifica la arteria occipital (OA), que se ramifica desde la ICA a mitad de camino entre la bifurcación en forma de Y de la ICA y el origen de la ECA, y la arteria tiroidea superior (TA), que se ramifica desde el lado medial de la ECA. Estas arterias son frágiles y deben tratarse con extremo cuidado.
    1. Retira cualquier fascia y tejido adiposo que quede alrededor del CCA.
    2. Separa cuidadosamente el CCA del nervio vago.
    3. Coloca dos roscas 4/0 1.5 alrededor del CCA y átalas flojamente. Asegúrate de que los nudos no impidan el flujo sanguíneo de la CCA.
    4. Retira la fascia y el tejido adiposo de la ACI y la PPA. Liga temporalmente la PPA y todas las ramas laterales de la ICA, incluida la OA, atando un nudo con un hilo 4/0 1.5.
    5. Retira la fascia y el tejido adiposo de la ECA y la TA. coloca dos nudos sueltos alrededor del ECA y TA usando roscas 4/0 1.5. Coloca el hilo más distal lo más lejos posible de la bifurcación en forma de Y y úsalo para ligar permanentemente la ECA y la TA. Deja el nudo proximal suelto.
  5. Preparación de la solución de microsfera y carga de catéter
    NOTA: Prepara la solución de FITC-Dextran/microesfera poco antes de la inyección para minimizar la adhesión de la microesfera al catéter.
    1. Homogeneizar y sonicar las microesferas de 10 μm (7,2 x 106 microesferas/mL) para obtener una suspensión uniforme de partículas individuales.
    2. Preparar 140 μL de 25 mg/mL de FITC-Dextrán 70 kDa que contenga 0,1% Tween20, luego añadir 20 μL de microesferas homogenizadas para obtener 160 μL de mezcla FITC-Dextran/Tween20/microesferas que contenga 1,44 × 105 microesferas.
    3. Retrae brevemente la jeringuilla conectada al catéter para crear una esclusa de aire.
    4. Sumerge la punta del catéter en la mezcla preparada de FITC-Dextran/Tween20/microesfera y tira lentamente de la jeringuilla hasta que la mezcla esté en el catéter.
    5. Asegúrate de que no haya burbujas de aire en el catéter. Si la hay, vacía la mezcla en un recipiente de 0,5 mL y repite los pasos 2.5.3 y 2.5.4.
    6. Coloca la jeringuilla con el catéter cargado en la bomba de la jeringuilla. Ajusta la bomba a 10 μL/min y haz funcionar hasta que aparezca una pequeña gota de mezcla de microsfera en la punta del catéter.
  6. Inserción de catéter e inyección de microesferas
    NOTA: Evita inyectar burbujas de aire en el sistema vascular, ya que esto puede causar efectos adversos graves o la muerte. Las burbujas de aire pueden deberse a una carga incorrecta del catéter o fugas en la tubería.
    1. Coloca un clip de vaso en el ICA y aprieta uno de los nudos proximales previamente preparados alrededor del CCA (véase el paso 2.4.3).
    2. Con microtijeras, realiza una pequeña incisión diagonal en el ECA aproximadamente 0,5 mm distal al hilo de ligadura. Asegúrate de que el tamaño de la incisión sea ligeramente menor que el diámetro del catéter.
    3. Absorbe cualquier sangre con un paño o tejido estéril, asegurándote de que no siga filtrándose sangre más allá de las ligaduras y la pinza del vaso.
      NOTA: El triángulo vascular debe permanecer libre de sangre tras la incisión ECA. La sangre residual puede provocar la formación de coágulos, que pueden provocar grandes eventos isquémicos cerebrales al restaurar el flujo carotídeo o bloquear la ECA, impidiendo la inyección de microsferas.
    4. Enciende brevemente la bomba de jeringuilla para formar una gota de mezcla de microsfera en la punta del catéter, confirmando que no queda aire en la punta del catéter.
    5. Abre la incisión ECA e inserta el catéter usando micropinzas finas. Evita tocar otras superficies durante la inserción para evitar la pérdida de la mezcla de microsferas o la entrada de aire en el catéter. Si la inserción falla o la punta del catéter toca una superficie, repita el paso 2.6.4 antes de volver a intentarlo.
    6. Asegura el catéter en el ECA apretando la sutura proximal (véase el paso 2.4.5) alrededor del ECA.
    7. Asegúrate de que no haya fugas ni burbujas de aire dentro de la vasculatura iniciando la bomba de jeringuilla a 10 μL/min. Si alguno de los dos está presente, desconecta el catéter y vuelve al paso 2.6.4.
    8. Si no se detectan fugas ni burbujas de aire, continúe bombeando a 10 μL/min para aumentar gradualmente la presión en el catéter y la vasculatura hasta observar un agrandamiento visible de la arteria. Para igualar la presión arterial del animal, establezca una presión adecuada en el catéter y la vasculatura antes de reabrir el ACI y el ACC. Cuando se restablece el flujo sanguíneo en el CCA y el ICA, puede entrar algo de sangre en el catéter, pero posteriormente se reinyectará en el ICA. Confirma visualmente la inyección de la mezcla de microsferas en la ECA y que la acumulación de presión es exitosa observando cómo el tinte verde FITC llena las arterias. Si no se observa esto, detener la bomba de jeringuilla, retirar el catéter y repetir los pasos 2.6.4 a 2.6.8.
    9. Retira el clip del recipiente del ICA y luego aumenta el caudal de la bomba de jeringuilla a 20 μL/min. Confirma la inyección exitosa de la microesfera verificando que la ICA distal a la bifurcación de la PPA está llena de tinte FITC. Si se confirma, proceder al paso 2.6.11; Si no, procede al paso 2.6.10.
    10. Detiene la bomba de jeringuilla y afloja la ligadura de la PPA. Reposiciona la ligadura PPA más distal respecto a la bifurcación ICA-PPA y luego aprieta la ligadura. Volver al paso 2.6.9.
    11. Retira el hilo que ligó el CCA para permitir que la mezcla de microesferas fluya hacia el ICA.
    12. Solución de problemas en caso de flujo retrógrado durante la inyección de la mezcla de microsferas:
      1. Si se produce un flujo retrógrado de la mezcla de microesferas hacia la CCA, se reduce el flujo de la bomba de jeringuilla a 10 μL/min.
      2. Si el flujo retrógrado continúa, exprime suavemente el ECA, ICA y CCA usando microfórceps para asegurar que no haya obstrucción del flujo debido a un trombo.
      3. Confirma visualmente que no hay embolo de aire dentro de la vasculatura. Un émbolo de aire puede reconocerse como una sección transparente dentro de la vasculatura.
      4. Si hay un émbolo de aire, detenga la bomba de jeringuilla y mueva el émbolo de aire a la ECA apretando suavemente la arteria con micropinzas. Liga el CCA y coloca un clip de recipiente en el ECA. Retira el catéter y el embolo de aire y vuelve al paso 2.6.4.
      5. Si no hay obstrucción pero el flujo retrógrado continúa, cierra el CCA usando un clip de recipiente y vuelve al paso 2.6.10.
        NOTA: No debe producirse flujo retrógrado de la mezcla de microsfera hacia la CCA, ya que podría indicar una reapertura inadecuada de la ACI, embolia atmosférica o formación de trombos con efectos potencialmente perjudiciales en el resultado del experimento.
    13. Detener la inyección de microesfera apagando la bomba de jeringuilla una vez que la mezcla en el catéter alcance los 80 μL (véase el paso 3.1.4). Se inyecta un total de 80 μL de FITC-Dextran/Tween20 con 7,2 x 104 microesferas.
  7. Finalización del procedimiento
    1. Liga el CCA usando el nudo preparado restante (véase el paso 2.4.3) y cierra el ICA con el clip del recipiente.
    2. Retira el catéter del ECA manteniendo el hilo que asegura el catéter en el ECA en la misma posición.
    3. Liga permanentemente el ECA apretando el hilo que había asegurado el catéter.
    4. Quita el clip del vaso y los hilos alrededor del CCA, ICA y PPA para restablecer el flujo sanguíneo. Humece la zona quirúrgica con unas gotas de suero salino.
    5. Sutura la piel con una aguja curva de corte inverso de 3/8 de 12 mm y una sutura de seda 3-0 (USP) no absorbible.
  8. Cuidados postquirúrgicos
    1. Administrar subcutáneamente 5 mg/kg de Carprofeno.
    2. Transfiere al animal a la jaula de recuperación (~33 °C) durante 30-60 minutos. Devuelva al animal a su jaula cuando esté completamente recuperado.
    3. Durante los primeros 2 días, remojas la comida durante 10 minutos en 0,06 mg/mL de Carprofeno y se lo proporcionen al animal, y complementa el agua potable con 0,06 mg/mL de Carprofeno. Después de este periodo, continúa administrando comida en remojo sin Carprofen hasta que el animal recupere su peso previo a la cirugía.
    4. Controla al animal varias veces al día durante los dos primeros días, y después 3 veces por semana. Eutanasia al animal si se alcanza un objetivo humano.
      NOTA: Los objetivos humanos se definen según la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo. Además, eutanasia a cualquier animal si muestra signos de isquemia, como comportamiento circular o parálisis, ya que el modelo de embolia microvascular no debería causar un evento isquémico mayor.

figure-protocol-2
Figura 2: Cirugía de embolia microvascular. Imágenes detalladas de ejemplo y dibujos esquemáticos de pasos cruciales durante la cirugía de embolia microvascular. (A) Preparación de las ligaduras CCA (2x), ECA (2x), TA, OA y PPA (paso 2.4). (B) Ligadura (temporal) de la ACC (1esta) y ECA, seguida del cierre de la OA y la PPA y cierre temporal de la ICA con un clip de vaso, permitiendo una incisión en la ECA sin sangrado (paso 2.6.2). (C) Colocación del catéter en el ECA disecado, que se atan entre sí con la segunda sutura (paso 2.6.7). (D) Apertura de la sutura proximal alrededor del ACC y retirada del clip del vaso del ACI para restaurar el flujo sanguíneo, seguido de la inyección de la mezcla microesférica en el ACI (paso 2.6.10). CCA = Arteria Carótida Común; ECA = Arteria Carótida Externa; TA = Arteria tiroidea; OA = Artería occipital; PPA = Arteria Pterigopalata; ICA = Arteria Carótida Interna. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Imagen in vivo

  1. Microscopía de dos fotones
    1. Coloque el animal en el soporte de imagen de dos fotones del microscopio para la imagen in vivo postoperatoria. Mantener una anestesia ligera con isoflurano al 1,2% en una mezcla de 1 L/min de 30% oxígeno y 70% aire, y monitorizar la frecuencia y profundidad de la respiración. Consulte la Tabla Suplementaria 1 para los detalles de la configuración del microscopio.
    2. Localiza microesferas alojadas a través de la ventana craneal usando un objetivo 10x (10x/0,30 DRY) y iluminación de lámpara de mercurio. Luego, cambiar a imagen de dos fotones con un objetivo de inmersión en agua de 25x (25x/0,95 AGUA). Consulta la Tabla Suplementaria 2 para los ajustes de imagen.
    3. Registra pilas Z alrededor de la microsfera de interés.

4. Análisis post mortem

  1. Punto final experimental para la imagen in situ
    1. Cuando se alcance el punto final experimental, se eutanasia al animal mediante dislocación cervical bajo > 4% de isoflurano en una mezcla de 1 L/min de 30% osígeno y 70% aire médico.
  2. Imagen cerebral in situ
    1. Extrae el cerebro, inyecciónalo en un disolvente de sodio carboximetilcelulosa al 3,0% (Sigma) mezclado con tinta negra al 0,1% (VWR), y congelarlo a −20 °C durante al menos 24 horas.
    2. Imagina el cerebro usando un pequeño Sistema de Criomicrotomo de Imagen Fluorescente 3D (pequeño-3D-FICS) previamente descrito por Juch R.N.S. et al.40. Configura el sistema para cortar el cerebro verticalmente en secciones de 16 μm e imagen con una resolución de 13,66 × 13,66 μm. Consulte la Tabla Suplementaria 3 y la Tabla Suplementaria 4 para los ajustes de imagen y especificaciones del sistema. Analiza las imágenes usando el softwareArticulus 41.
  3. Imagen in situ de ratón entero
    1. Quita la piel, los dientes y la cola del animal.
      NOTA: La eliminación de la cola es opcional pero aumenta la velocidad de imagen.
    2. Inmerser el animal en disolvente de sodio al 3,0% de carboximetilcelulosa (Sigma) mezclado con tinta negra al 0,1% (VWR), y congelar a −20 °C durante al menos 24 horas.
    3. Imagina al animal usando un sistema grande de criomicrotomo de imagen fluorescente 3D (FICS 3D grande) como se describió anteriormente 42. Configura el sistema para cortar secciones de 25,9 μm con una resolución en plano de 26,09 μm. Consulte la Tabla Suplementaria 5 y la Tabla Suplementaria 6 para los ajustes de imagen y especificaciones del sistema. Analiza las imágenes usando el softwareArticulus 41.

Resultados

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Imagen post mortem in situ

El éxito de la cirugía de embolia microvascular fue confirmado mediante imágenes in situ de cuerpo entero y cerebro completo 4 días después de la cirugía de embolia microvascular (Figura 3A). La rebanada sagital de un ratón muestra alojamiento de microesferas en el cerebro. La Figura 3B,C muestra un ejemplo de un cerebro de ratón extraído, 1 día después de la cirugía de embolia microvascular. Las microesferas estaban predominantemente alojadas en el hemisferio ipsilateral, en el territorio de flujo de las arterias cerebrales media y anterior. El recuento de microesferas en cortes de cerebro aumentó significativamente cuando se añadió Tween20 a la mezcla (Figura 3E). El seguimiento del peso durante la recuperación tras la cirugía de microembolia muestra que los ratones perdieron menos peso y se recuperaron más rápido tras la cirugía cuando se les inyectó una mezcla de microesfera que contenía Tween20 (Figura 3F).

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Figura 3: Distribución de microesferas en el ratón tras la cirugía de embolia microvascular. Localización in situ de microesferas de 10 μm en el ratón visualizada usando el softwareArticulus 41. (A) Ejemplo del plano sagital de un ratón entero fotografiado con el gran 3D-FICS tras una cirugía de embolia microvascular. (B-D) Imágenes representativas axiales, coronales y sagitales de un cerebro de ratón, imágenes usando el pequeño 3D-FICS. (E) Número medio de microesferas detectadas por cada sección cerebral coronal de 50 μm aproximadamente en bregma ± 0,5 mm para las condiciones Control y Tween20. Las barras representan la desviación media ± estándar. Las mediciones individuales se muestran en puntos. La comparación estadística se realizó utilizando una prueba t no emparejada; El valor p se indica en el gráfico. Se identificaron y eliminaron valores atípicos usando el método del rango intercuartílico (IQR) (n = 1 para ambos grupos), resultando en un tamaño final de grupo de n = 3 para controles y n = 14 para Tween20. (F) Cambios normalizados de peso a lo largo del tiempo tras la cirugía de embolia microvascular en el momento 0. Los pesos se normalizaron al nivel base de cada animal en la cirugía. Las líneas muestran la media ± DS por grupo (Control, n = 4; Tween20, n = 5) con Control en azul y Tween20 en naranja oscuro. La significación estadística entre grupos en cada momento se evaluó utilizando pruebas t de dos colas no apareadas. (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Inyección de microesferas y microscopía de dos fotones in vivo

Durante la inyección de microsferas, los catéteres recubiertos con BSA al 5% mostraron que muchas microesferas se adherían a la superficie del catéter, y las microesferas en flujo a menudo estaban agrupadas, lo que podría causar oclusiones mayores (véase Vídeo Suplementario 1). Además, añadir un 5% de BSA a la mezcla de microsfera para evitar adherencias y agrupaciones no es deseable debido a una posible respuesta inmune en la inyección43,44. Para evitar esto, se utilizó una solución Tween20 al 0,1% en la mezcla de microesferas, resultando en un número visiblemente mayor de microesferas fluyendo a través del catéter y en el número deseado (> 20) de microesferas en la ventana de imagen (Figura 4 y Vídeo suplementario 2). La Figura 4A,B muestra una imagen general de la corteza cerebral en microscopía de fluorescencia 0,5 h después de la cirugía de embolia microvascular. Cada punto blanco representa una microesfera que ocluye un capilar en la microvasculatura cerebral. La figura 4C,D muestra la proyección 2D de las imágenes z-stack de dos fotones como ejemplo. Las microesferas están causando embolias microvasculares cerebrales con perfusión alterada, indicada por la ausencia de tinte intraluminal aguas abajo de la microsfera (Figura 4E y Vídeo suplementario 3). Además, estas embolias provocan alteraciones en la BBB con la extravasación del tinte FITC-Dextran (Figura 4F,G).

Estos resultados están en consonancia con el bajo número de microesferas adheridas al catéter y el mínimo agrupamiento de microesferas, que se observó en el catéter durante la inyección de la mezcla microsfera-Tween. Sin embargo, un gran número de microesferas se agruparon en los últimos 20 μL de la mezcla de microsferas en el catéter, que no debe inyectarse para evitar la posible aparición de un infarto grande (véase Vídeo suplementario 4).

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Figura 4: Microscopía in vivo de dos fotones de microesferas alojadas. Ejemplos de imágenes fluorescentes in vivo y de dos fotones de microesferas alojadas en la corteza del ratón. (A) Visión fluorescente a través de la ventana craneal de las microsferas de la logia. (B) Imagen fluorescente del ROI seleccionado. (C,D) Imágenes de microscopía de dos fotones de microesferas atrapadas en la microcirculación cerebral con ROI seleccionado para imágenes detalladas. Las imágenes de la pila Z se representan en 2D calculando la desviación estándar de las intensidades de píxeles a lo largo de la pila Z. (E-G) Imágenes representativas in vivo de microscopía de dos fotones que muestran tres embolias microvasculares cerebrales. Las flechas rojas resaltan áreas de extravasación con FITC-Dextran, indicando la interrupción del BBB y la fuga de colorante. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla suplementaria 1: Especificaciones del sistema de microscopio de dos fotones. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria 2: Ajustes de microscopio de dos fotones para FITC-dextrán e imagen de microsferas. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria 3: Configuración del sistema de criomicrotomo para imagen de ratón con microsferas de microsfera de microsfera de pequeña imagen fluorescente 3D en 3D. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria 4: Especificaciones del sistema de criomicrotomo de imagen fluorescente 3D pequeña para imagen cerebral de ratón con microesferas azules. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria 5: Configuración del sistema de criomicrotomo de imagen fluorescente 3D grande para imagen de ratón completo con microesferas rojas. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla Suplementaria 6: Especificaciones del sistema de criomicrotomo de imagen fluorescente 3D grande para imagen de ratón completo con microesferas rojas. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Vídeo suplementario 1: Catéter recubierto de BSA al 5% con adhesión de microesfera a la pared del catéter y agrupamiento de microesferas en los 25 mg/mL de mezcla de microesferas FITC-Dextran durante la inyección. Por favor, haz clic aquí para descargar este vídeo.

Vídeo suplementario 2: Catéter recubierto con Tween20 al 0,1% con cierta adhesión de microesferas a la pared del catéter pero sin agrupamiento de microesferas en el FITC-Dextrán de 25 mg/mL con mezcla Tween20 al 0,1% con microesferas durante la inyección. Por favor, haz clic aquí para descargar este vídeo.

Vídeo suplementario 3: Segmentación 3D de oclusiones microvasculares por microesferas. Por favor, haz clic aquí para descargar este vídeo.

Vídeo suplementario 4: Volumen final de la inyección de microesfera con alta concentración microesférica en 25 mg/ml de FITC-Dextrán con mezcla Tween20 al 0,1%. Por favor, haz clic aquí para descargar este vídeo.

Archivo suplementario 1: Adherencia de microesferas a la validación de las puntas de la pipeta. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Evaluación inmunohistoquímica de la cobertura CD45 a 1, 7 y 28 días después de la cirugía de microembolia comparando los hemisferios ipsilateral y contralateral. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

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Para modelar embolias microvasculares, se describió un protocolo para inyectar microesferas en la circulación cerebral de ratones que permite el estudio de la microembolia mediante microscopía de dos fotones in vivo . Este método optimizó el atrapamiento de microesferas en el cerebro, con múltiples microesferas atrapadas en los primeros 500 μm de la corteza ipsilateral, permitiendo una imagen efectiva de dos fotones.

Un alto recuento de microsferas en la zona cortical del cerebro es crucial para la imagen in vivo de dos fotones. La pérdida de microesferas se minimizó durante la preparación de la mezcla de microsferas recubriendo las puntas de la pipeta con un 5% de BSA o 0,1% Tween20, reduciendo la adhesión de la microesfera (véase Archivo Suplementario 1). Aunque no se pudo cuantificar el número exacto de microesferas adheridas, las mediciones de intensidad media mostraron el efecto de los recubrimientos. Además, Tween20 pareció evitar el agrupamiento de microesferas en el catéter, lo que resultó en un número visualmente mayor de microesferas singulares fluyendo a través del catéter, aunque esto no está cuantificado. Esto reduce el riesgo de oclusiones de grandes vasos y la posible formación de grandes regiones isquémicas e hipóxicas, lo cual es indeseable dado el objetivo de modelar embolizaciones microvasculares. Además, los ratones mostraron menos pérdida de peso y se recuperaron más rápidamente a los pesos preoperatorios cuando se les inyectó una mezcla de microesferas que contenía bajas concentraciones de Tween20. Tween20 es un dispersantecomúnmente utilizado 45,46,47, por lo que no se espera que las bajas concentraciones utilizadas en este estudio causen toxicidad ni efectos adversos sobre la integridad del BBB. Además, nuestros datos muestran que la fuga de BBB ocurre solo cerca (o después de) el alojado de la microsfera y no de forma sistemática, sin causar un aumento significativo en la cobertura total de leucocitos (véase Archivo Suplementario 2), lo que apoya el uso del 0,1% de Tween20. En general, la adición de Tween20 contribuye a reducir la agrupación de microesferas y a un aumento en la entrega de microesferas a la circulación cerebral, confirmado por el recuento de microesferas en cortes cerebrales, y da lugar a suficientes microesferas visibles para la microscopía de dos fotones. Aunque el uso de Tween20 aumenta el número de microesferas alojadas en el cerebro, la variabilidad en la inyección de microesferas persiste. Varios factores pueden contribuir a esta variación. Primero, la formación de trombos dentro del catéter o vasculatura puede hacer que las microesferas se adhieran al coágulo. En segundo lugar, la presencia de burbujas de aire puede interferir con una entrega suave. Finalmente, una restauración incompleta del flujo sanguíneo en el CCA o ICA puede alterar la hemodinámica, promoviendo potencialmente la adhesión de la microesfera a la pared del vaso o el agrupamiento dentro del lumen. Desafortunadamente, estas desviaciones no pueden detectarse durante el procedimiento de inyección.

Las microesferas de poliestireno son más densas que el agua, lo que provoca una distribución desigual una vez que la mezcla de microsferas se carga en el catéter. La mayoría de las microsferas se asientan cerca de la pared del catéter, donde la fricción del fluido ralentiza su movimiento en relación con el flujo central más rápido. Esto finalmente resulta en una acumulación de microesferas dentro de los últimos 20 μL del catéter. Se debe evitar inyectar esta parte concentrada, ya que puede causar grandes émbolos y eventos isquémicos. Para evitar esto, el volumen de mezcla de microesferas debe prepararse al doble del volumen de inyección previsto.

La cirugía de embolia microvascular requiere una formación y precisión considerables. Uno de los pasos más técnicos implica colocar una sutura alrededor del PPA, el OA y las ramas laterales del ICA para asegurar la entrega precisa de la mezcla de microsferas en el círculo de Willis y el territorio MCA. Este paso se complica por la proximidad del nervio vago cerca del CCA, el pequeño diámetro de los vasos y el espacio quirúrgico limitado, lo que dificulta la colocación de las suturas sin causar daño nervioso o lesión vascular.

Aunque un clip de vaso puede considerarse como alternativa a ligar temporalmente la PPA mediante sutura, introduce riesgos adicionales. Los clips pueden desprenderse sin querer, lo que provoca la reapertura de la nave. Además, usar un segundo clip en el PPA junto al clip existente en el ICA aumenta la probabilidad de desprendimiento del clip ICA debido al espacio limitado. Si esto ocurre, provocará una hemorragia significativa y, sin intervención inmediata, puede provocar la interrupción prematura del experimento. Por lo tanto, no se recomienda cerrar el PPA con un clip para recipientes.

El protocolo actual emplea un catéter, en lugar de una jeringuilla33, para la inyección en microsfera. Este enfoque ofrece un mejor control sobre la velocidad y volumen de inyección, y permite la inyección de las microesferas de forma más remota (por ejemplo, dentro de una modalidad de imagen como un microscopio o un escáner de resonancia magnética).

Elegir la ECA en lugar de la CCA como punto de entrada permite que la CCA permanezca completamente abierta durante el procedimiento de inyección, lo que ayuda a mantener una perfusión cerebral más fisiológica durante todo el procedimiento quirúrgico. Además, inyectar las microesferas a través de la ECA en lugar de la CCA tiene otrasventajas 48: i) reducción del tiempo total de operación durante la reperfusión; ii) menor riesgo de sangrado durante la inyección y tras la finalización de la cirugía; iii) con el método de entrada de la CCA, se forma una estenosis y trombosis inestables en la ACC tras retirar laaguja 49. Esto provocará alteraciones en el flujo sanguíneo, así como el riesgo de formación de microtrombos, que pueden acabar en el cerebro. Además, entrar a través del CCA implicaría un gran riesgo de cerrar permanentemente el CCA, lo que puede resultar en una repercusión cerebral subóptima durante el periodo de supervivencia tras la cirugía, agravada por la alta variación en el círculo de Willis en ratones50,51

Aunque está totalmente optimizado, el protocolo presenta algunas limitaciones. En primer lugar, la observación de que las microesferas viajan más lentamente a lo largo de las paredes del catéter y no están distribuidas uniformemente durante la inyección sugiere que se introducen menos microesferas en la ACI de lo esperado. A pesar del uso de Tween-20 para reducir la adherencia, algunas microesferas aún se adhieren a las puntas de la pipeta, el tubo de Eppendorf y el catéter. En consecuencia, el número real de microesferas inyectadas probablemente sea menor que las 7,2 x 104 partículas calculadas por ratón. No obstante, suficientes microesferas llegan a la circulación cerebral para permitir la obtención de imágenes mediante microscopía de dos fotones. El protocolo de inyección y la composición de la mezcla están optimizados para microesferas de poliestireno de 10 μm. Si se modifican los materiales utilizados (puntas, tubos, catéteres) o el tamaño de las microesferas, tanto la solución como el procedimiento de inyección deben reevaluarse en consecuencia. En segundo lugar, estudios que investigan el mejor método para la oclusión de grandes vasos mediante oclusión intralumínica del MCA han demostrado que la entrada del sistema vascular mediante ligadura permanente de la ECA provoca isquemia de los músculos masticadores y de deglución52. Esto puede provocar una disminución de la ingesta de alimentos en ratones y, por tanto, una pérdida excesiva de peso, deterioro de la función motora y un aumento del déficit neurológico. Sin embargo, esta afirmación ha sido contradicha por otros48. En este estudio, el control de peso mostró una caída esperada tras la cirugía pero una recuperación rápida a los pesos prequirúrgicos en pocos días, lo que indica que los ratones sí se recuperan y comen y beben normalmente tras la ligadura permanente de ECA. Aunque se monitorizó el peso de los animales, esto es solo un indicador indirecto del bienestar del animal y no descarta completamente deficiencias funcionales como déficits masticatorios o motores locales. No se realizaron evaluaciones directas sobre la recuperación funcional, lo que es una limitación de este estudio. Otro estudio comparó la entrada del sistema vascular a través de la CCA o ECA y mostró que la entrada a través de la CCA puede resultar en una alteración de la reperfusión de la circulación cerebral, concluyendo que el método de entrada de ECA espreferido 53. Tercero, la colocación correcta y segura del catéter sin introducir burbujas de aire, coágulos de sangre ni fugas, y sin obstruir el flujo en el CCA y el ICA requiere una práctica significativa. Por último, a diferencia de otros métodos de microoclusión como la fototrombosis usando la inyección de Rose-Bengal22, no se puede predecir dónde se alojarán finalmente las microesferas en la circulación.

El presente estudio deliberadamente no incluye grupos de control negativos (simulados) ni positivos (fototrombosis), ya que estos no aportarían valor adicional para el objetivo principal. El éxito de este modelo se define por el número de microesferas alojadas en la microcirculación cerebral, especialmente en la zona de la ventana craneal, para permitir una microscopía in vivo de alta resolución. Un procedimiento simulado, por definición, no produciría microsferas en el área objetivo y, por tanto, no ofrecería una comparación relevante para el punto final de imagen in vivo . De manera similar, la inclusión de un modelo de fototrombosis abordaría un mecanismo fisiopatológico fundamentalmente diferente y, por tanto, está fuera del alcance de este trabajo, que se centra en caracterizar el modelo de embolia microvascular en lugar de comparar metodologías. No se llevaron a cabo análisis histológicos más amplios de las embolias y su posible efecto sobre la BBB o tejido neuronal local, ya que el estudio estaba diseñado para priorizar la visualización 3D in vivo sobre la validación a nivel de tejido.

El protocolo quirúrgico detallado tanto para la preparación de la ventana craneal como para el modelo de embolia microvascular apoya una investigación fiable y reproducible de los cambios microvasculares asociados a la embolia microvascular y la aparición de infartos cerebrales silenciosos en todo el hemisferio ipsilateral. La preparación y la inyección optimizadas de la mezcla de microsferas mejoran aún más la consistencia y validez de este enfoque experimental.

Divulgaciones

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Los autores no declaran conflictos de interés.

Agradecimientos

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Los autores desean expresar su sincero agradecimiento al Dr. Iwan Dobbe por desarrollar el software Articulus , que se utilizó para las reconstrucciones in situ de imágenes 3D. También agradecemos al Prof. Dr. Nikolaus Plesnila por proporcionar amablemente ratones TIE2-GFP (Jackson Laboratory, Stock No. 003658) utilizados para la cría interna.

Este estudio fue financiado por Amsterdam Neuroscience (de 813294 a I.M.), Amsterdam Cardiovascular Sciences (llamada de equipos 2021 y 2023 a I.M.) y la Dutch Heart Foundation (03-006-2021-T019 a I.M.).

Esta investigación también está financiada por la Dutch Heart Foundation y The Brain Foundation Netherlands, y se lleva a cabo en colaboración y con el apoyo de la Dutch CardioVascular Alliance, 01-002-2022-0126 CONTRAST 2.0. Además, este trabajo fue financiado en parte por financiación sin restricciones de Stryker, Medtronic y Penumbra. Las fuentes de financiación no participaron en el diseño de estudios, el seguimiento, la recopilación de datos, los análisis estadísticos, la interpretación de resultados ni la redacción de manuscritos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aguja calibre 27 (0,1x16 mm)Terumo-Aguja calibre 27 (Paso 2.1.2.)
Software Articulus--Software de análisis 3D (Pasos 4.2.2 y 4.3.3)
Betadine 30 ml (100 mg/ml)Mylan8712207037612Betadina/yodo (Paso 1.1.8. & 2.2.10.)
C& Monómero BSun Medical7111Componente del superpegamento (Paso 1.3.1.)
Cuchillas quirúrgicas de acero al carbono (n.15)Swann-Morton205Hoja para arañar el cráneo (Paso 1.2.4.)
Carprofeno (50 mg/ml)Zoetis-Medicación para el dolor (pasos 1.1, 1.6, 2.2 y 2.8)
CatalizadorSun Medical7110Componente del superpegamento (Paso 1.3.1.)
Catéter (DI 0,31 DO 0,64 mm)Freudenberg228-0661Catéter transparente (Paso 2.1.1.)
Gancho de papel de seda fabricado por Costom--Gancho de tejido (Paso 2.3.4.)
Puntas de algodón--Punta de algodón (Paso 1.1.8, 1.2.4 y 1.5.1.)
Vidrio de cubiertaInstrumentos Warner64-0724Cristal de la cubierta craneal de la ventana (Paso 1.4.2.)
Barra de cabeza de ratón hecha a medida--Barra de cabeza para soporte de imagen (Paso 1.3.2.) 
Soporte de imagen para ratones personalizado y nbsp;--Imagen del soporte de ratón (Paso 1.4.1. & 3.1.1.)
Marco estereotáctico personalizado--Marco estereotáctico (Paso 1.1.7.)
Fluido para cimientos dentalesKulzer64707937Componente del cemento dental (Paso 1.3.3.)
Polvo de cemento dentalKulzer64707945Componente del cemento dental (Paso 1.3.3.)
Broca dental y nbsp;Saeshin  L-206Ejercicio (Paso 1.4.3.)
Dexametasona (4 mg/ml)Centrafarm-Medicación preoperatoria (Paso 1.1.4)
Pinzas de disecciónBraun-AesculapBD023RPinzas (Paso 1.2.2. & 2.3.2.)
Broca de muelas PK/100,5 (0,5mm)Bellas Ciencias19007-05Broca (Paso 1.4.3.)
Duratears (3,5 g)Alcon-Pomada para los ojos (Paso 1.1.8. & 2.2.7.)
Pegamento epoxi (1g)Pattex9H PSMG3XPegamento epoxi (Paso 1.5.2. & 2.1.1.)
Pinzas micro finas rectasHerramientas científicas finasDumont #5Pinzas micro finas (Paso 2.6.6.)
FITC-Dextran (70 KDa)Sigma-AldrichFD70SSolución FITC-Dextran (Paso 2.5.2.)
Isoflurano (1000 mg/g)Laboratorios Karizoo S.A.118938Anestesia (Paso 1.1.6. & 2.2.5.)
gran criomicrotomo de imagen fluorescente 3D  Hechos a medida-FICS grandes-3D (Paso 4.3.3)
Lidocaína (100 mg/ml)Aspen-Anestesia local (Paso 1.2.3. y 2.2.10)
Microtijeras Vannas 3-3/8 de pulgadaBraun-AesculapOC498RMicrotijeras (Paso 2.6.2)
Pinzas de microsutura con mango redondoBraun-AesculapFD280RMicroforeceptores (Paso 2.3.3.)
Pinzas para atar microsuturas con mango redondo dobladoBraun-AesculapFD281RMicroforeceptores doblados (Paso 1.5.1. & 2.3.3.)
Micro clip vascularBraun-AesculapFD562RClip de recipiente (Paso 2.6.1.)
Microcatéter (ID: 0,23114 mm DI, 0,27432 mm)MicrolumenMicro-catéter (Paso 2.1.1.)
Almohadilla térmica para ratón y sonda rectalStoelting53800RAlmohadilla térmica (Paso 1.1.2. & 2.2.2.)
NG2-DsRed ratonesJackson Laboratory, Bar Harbor, EE. UU., Nº de Stock 008241
Monolaroto de sorbitano de polietileno glicolSigma-Aldrich9005-64-5Tween20 (Paso 2.5.2.)
FluorEsferas de poliestireno azul (365/415)InvitrogenF8829Microsferas azules (Paso 2.5.1.)
FluorEsferas de poliestireno rojo (580/605)InvitrogenF8834Microesfera roja (Paso 2.5.1.)
Jaula de recuperación--Jaula de recuperación (Pasos 1.6.2. y 2.8.2.)
Corte inverso de aguja curva de 3/8 (12 mm) con suturaBbraun0762067Sutura (Paso 2.7.5)
Ropivaca y el diyo; Ne (2 mg/ml)--Medicación y nbsp; (Paso 1.1.5.)
pequeño criomicrotomo de imagen fluorescente 3D y nbsp;  Hechos a medidaPequeños-3D-FICS (Paso 4.2.2)
SpongostanEthiconMS0005Spongostan (Paso 1.4.6.)
Microscopio quirúrgicoEuromex Microscopen B.V.NZ.1903-BMicroscopio para cirugía (Paso 1.2. 2.1.1.)
Tijeras quirúrgicasBraun-AesculapBC303RTijeras quirúrgicas (Paso 1.2.2. & 2.3.2.)
Bomba de jeringuilla (para jeringuillas de 1 ml)Aparato Havard70-22081 ml de bomba de jeringuilla (Paso 2.5.6.)
Hilo, 100 m y nbsp; 4/0 1,5   BbraunF1134035Hilos 4/0.15 (Paso 2.4.3.)
Ratones TIE2-GFPLaboratorio Jackson, Bar Harbor, EE. UU., Stock No. 003658
Plumero ultra puroThorlabsCA6-EUAire comprimido (Paso 1.2.5.)
Transparente universal de polímeroSun MedicalT058EComponente del superpegamento (Paso 1.3.1.)

Referencias

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  1. Hilkens, N. A., Casolla, B., Leung, T. W., de Leeuw, F. E. Stroke. Lancet. 403 (10446), 2820-2836 (2024).
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