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Artículo de método

In vivo Registro de pinzas de parche de células completas de neuronas peptidérgicas hipotalámicas en larvas de pez cebra

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DOI:

10.3791/68943

⸱

22 de agosto de 2025

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Shanghai University, 2Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este artículo presenta un protocolo para el registro in vivo de la actividad eléctrica de las neuronas peptidérgicas hipotalámicas utilizando electrofisiología de pinza de parche de células enteras en larvas intactas de pez cebra.

Resumen

El hipotálamo es una antigua región del cerebro que regula diversos aspectos de la fisiología y el comportamiento, incluidos el sueño y la vigilia, el apetito, la homeostasis energética, la ansiedad, la depresión y la interacción social. Poblaciones neuronales específicas en el hipotálamo ejercen sus efectos a través de la liberación de neurotransmisores y neuropéptidos. El registro de pinzas de parche de células completas es un enfoque indispensable para estudiar las funciones de estos factores en la transmisión sináptica y la función cerebral. Sin embargo, es un desafío acceder a las neuronas hipotalámicas para registros electrofisiológicos en mamíferos intactos debido a su ubicación en lo profundo del cerebro. Como resultado, nuestra comprensión de las propiedades intrínsecas y las funciones fisiológicas de las neuronas hipotalámicas es limitada. El pez cebra larvario es un modelo alternativo útil para estudiar las neuronas hipotalámicas debido a su cerebro vertebrado transparente y pequeño, pero bien conservado. Aquí, presentamos un protocolo para grabaciones de pinzas de parche de células enteras in vivo de neuronas hipotalámicas en larvas intactas de pez cebra. Usando esta técnica, podemos registrar las neuronas peptidérgicas en el hipotálamo, examinar las respuestas de estas neuronas a los estímulos sensoriales y explorar sus efectos en las neuronas posteriores. Esta técnica experimental proporciona un enfoque útil para estudiar las funciones fisiológicas de las neuronas neuropeptidérgicas hipotalámicas en animales intactos.

Introducción

Como modelo animal vertebrado popular, el pez cebra (Danio rerio) se usa ampliamente en la investigación en neurociencia y tiene varias ventajas1. Su complemento de genes y arquitectura cerebral está altamente conservado con los mamíferos, y tienen un rico repertorio de comportamiento, lo que los hace útiles para estudiar los mecanismos genéticos y neuronales que subyacen a comportamientos como el sueño, la ansiedad, la depresión y la interacción social 2,3,4,5,6 . Su pequeño tamaño y bajos costos de mantenimiento los hacen ideales para la detección de genes o medicamentos de alto rendimiento destinados al tratamiento de enfermedades neuropsiquiátricas 7,8. Finalmente, la transparencia óptica de las larvas de pez cebra, combinada con técnicas avanzadas de microscopio de hoja de luz y la disponibilidad de múltiples reporteros fluorescentes, los hace particularmente adecuados para monitorear la actividad neuronal y astroglial a resolución celular en todo el cerebro 9,10,11.

El hipotálamo del pez cebra, ubicado en lo profundo del diencéfalo ventral, se conserva anatómica y molecularmente con el hipotálamo de los mamíferos, pero es 2-3 órdenes de magnitud más pequeño, lo que proporciona un sistema más simple para estudiar la función del hipotálamo12. Las neuronas hipotalámicas forman extensas conexiones sinápticas con múltiples regiones del cerebro, incluido el tálamo, el tronco encefálico, la glándula pituitaria y el telencéfalo, a través de las cuales regulan la homeostasis fisiológica, la señalización neuroendocrina y los comportamientos autónomos13,14. Dicha modulación del comportamiento y la fisiología se basa en gran medida en los neuropéptidos, que son aminoácidos de cadena corta que actúan uniéndose a los receptores acoplados a proteínas G (GPCR)15. En contraste con la liberación de neurotransmisores de aminoácidos de acción rápida en la sinapsis, los neuropéptidos pueden difundirse a distancias más largas a través de la transmisión de volumen y mediar efectos moduladores lentos sobre la transmisión sináptica y la excitabilidad neuronal16.

Estudios recientes en pez cebra han revelado diversas funciones de los neuropéptidos hipotalámicos a través de enfoques multidisciplinarios como imágenes de calcio en todo el cerebro, secuenciación de ARN unicelular, análisis de comportamiento de alto rendimiento y mapeo de circuitos neuronales 4,12,17,18. Estas técnicas emergentes han transformado nuestra capacidad para caracterizar la diversidad celular a gran escala, unir los mecanismos moleculares con las funciones de los neuropéptidos a nivel de circuito y mapear los circuitos neuronales que subyacen a comportamientos específicos19,20. Sin embargo, estos enfoques siguen siendo limitados en su capacidad para resolver la dinámica fisiológica rápida y los mecanismos sinápticos precisos que subyacen a la función de los neuropéptidos.

La técnica patch-clamp, desarrollada por Neher y Sakmann, sigue siendo el estándar de oro para investigar la fisiología neuronal debido a su resolución temporal y precisión biofísica incomparables, lo que permite la medición directa de las fluctuaciones del potencial de membrana, las corrientes sinápticas y la dinámica de los canales iónicos21,22. Esta técnica es particularmente valiosa para estudiar las células neuropeptidérgicas, cuyos patrones característicos de estallido e influencias neuromoduladoras requieren una medición electrofisiológica directa para comprender completamente sus funciones en el comportamiento y la homeostasis 15,16,23.

Aquí, hemos desarrollado un protocolo optimizado que permite registros confiables de pinzas de parche de células completas de neuronas peptidérgicas hipotalámicas de larvas de pez cebra, a pesar de los desafíos técnicos que plantea la ubicación anatómica profunda de estas neuronas. Esta metodología proporciona acceso directo a la actividad eléctrica de estas células, lo que permite una investigación detallada de sus respuestas a estímulos visuales y auditivos (Figura 1). Al integrar la electrofisiología patch-clamp con la optogenética, podemos caracterizar con precisión la conectividad funcional entre los circuitos hipotalámicos y las neuronas aguas abajo (Figura 2 y Figura 3), facilitando el estudio de los neuropéptidos en la homeostasis fisiológica y el control del comportamiento. Este enfoque cierra una brecha crítica en la investigación en neurociencia, permitiendo la exploración mecanicista de la función de las neuronas hipotalámicas a nivel biofísico, celular y de circuito simultáneamente.

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Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Institucional (IACUC) de la Universidad de Shanghai (protocolo animal YS 2025-169) y el IACUC del Instituto de Tecnología de California (protocolo animal 1836). El pez cebra de 5 a 7 días después de la fertilización (dpf) se alimentó con rotíferos y se utilizó para experimentos. En esta etapa de desarrollo, el sexo no está determinado. Para la reproducción se utilizaron peces cebra adultos sobre un fondo de nácar [mitfa(w2/w2)]24 .

1. Soluciones y recetas

  1. Prepare un medio E3 que contenga 5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl2 y 0,33 mM de MgSO4. Ajuste la solución con NaOH a pH 7.2. Almacene a temperatura ambiente para usar dentro de 1 mes.
  2. Preparar la solución extracelular que contiene 134 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 2,1 mM de CaCl2, 1,2 mM de MgCl2, 10 mM de HEPES y 10 mM de glucosa. La osmolalidad de la solución extracelular es ~ 290 mOsmol L-1. Ajuste la solución con NaOH a pH 7.8. Conservar a 4 °C para su uso en el plazo de 1 mes.
  3. Preparar la solución intracelular que contiene 100 mM de K-gluconato, 10 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 2 mM de Mg-ATP, 0,3 mM de Na-GFP, 10 mM de HEPES y 10 mM de EGTA. La osmolalidad de la solución intracelular es ~ 280 mOsmol L-1. Ajuste la solución con KOH a pH 7.4. Alícuota 100 μL de la solución interna en tubos de microfuga y guárdelos a -20 °C para su uso en el plazo de 1 año.
    NOTA: Se recomienda la adición de Mg-ATP y Na-GTP para registros prolongados y estables. La solución intracelular debe filtrarse a través de una membrana de 0,22 μm, que elimina las partículas y los contaminantes microbianos que podrían comprometer la formación de sellos o provocar la obstrucción de la pipeta.
  4. α-bungarotoxina: Disuelva 1 mg de α-bungarotoxina en 1 ml de medio E3 hasta una concentración final de 1 mg/ml. Alícuota 20 μL de la solución en tubos de microfuga y guárdelos a -20 °C para su uso en el plazo de 1 año.
  5. Agarosa de bajo punto de fusión: Disolver 0,75 g de agarosa en 50 ml de medio E3 en una botella de vidrio hasta una concentración final del 1,5%. Calentar la mezcla en un horno microondas hasta que la agarosa se derrita y la solución parezca clara y homogénea. Mantener la agarosa derretida a 42-45 °C en un baño de agua para su uso en el plazo de 1 mes.

2. Preparación y disección del pez cebra

  1. Coloque un solo pez adulto macho y hembra que contenga un transgén deseado, por ejemplo, Tg (hcrt: RFP) pez 25, en un tanque de apareamiento y sepárelos con un divisor transparente durante la noche. En la mañana del segundo día, retire el divisor para permitir que los peces se reproduzcan. Recoja los embriones fertilizados en el fondo del tanque y devuelva los peces adultos a sus tanques de origen a primera hora de la tarde.
  2. Criar los embriones en una placa de Petri de 9 cm de diámetro con medio E3 que incluya azul de metileno al 0,0005%. Colocar los embriones en un incubador a 28,5 °C con ciclos de luz:oscuridad de 14:10 h. Cambie la solución E3 todos los días.
    NOTA: El azul de metileno en medio E3 se usa para prevenir el crecimiento de hongos hasta 3 días después de la fertilización (dpf), pero se reemplaza con medio E3 solo a 3 dpf, ya que el azul de metileno puede afectar el metabolismo celular y la función mitocondrial en etapas posteriores del desarrollo26.
  3. Cribar larvas de peces bajo un microscopio estereoscópico de epifluorescencia con un aumento máximo (~115x) a partir de unos 3 dpf. Coloque peces individuales en gotas de agua (más grandes que su tamaño corporal) para facilitar la clasificación. Para los peces de más de 3 dpf, anestesiar el pescado con 3 ml de medio E3 que contenga 0,01% de tricaína para suprimir la actividad locomotora espontánea. Recolecte larvas con expresión de fluoróforo brillante en el hipotálamo.
    NOTA: Use guantes de nitrilo, gafas de seguridad y una bata de laboratorio cuando manipule tricaína. El exceso de tricaína debe eliminarse como residuo químico de acuerdo con los protocolos para animales.
  4. Después de la detección, lave la tricaína con medio E3 inmediatamente y vuelva a colocar estas larvas en la incubadora. Agregue ~ 5 ml de solución de alimentación que contenga rotíferos en la placa de Petri a partir de 5 dpf hasta el día de los experimentos. Cambie la solución E3 y alimente a los peces con rotíferos todos los días.
  5. A 5-7 dpf, recolecte peces larvales que parezcan sanos y muestren locomoción activa. Transfiéralos a una placa de Petri pequeña (3,5 cm de diámetro) con una pipeta de vidrio.
  6. Retire el agua alrededor del pescado y agregue 20 μL de 1 mg / mL de α-bungarotoxina sobre el pescado durante ~ 30 s. Luego, lave el medicamento agregando ~ 3 ml de medio E3 en la placa de Petri.
    NOTA: Use guantes de nitrilo, gafas de seguridad y una bata de laboratorio cuando manipule α-bungarotoxina. El exceso de α-bungarotoxina debe eliminarse como residuo químico de acuerdo con los protocolos animales.
  7. Cubra la placa de Petri con papel de aluminio para mantener el pescado en la oscuridad y paralizarse gradualmente.
    NOTA: La α-bungarotoxina es un bloqueador del receptor de acetilcolina que actúa específicamente sobre la unión neuromuscular, paralizando así al pez sin afectar al sistema nervioso. Los peces aún pueden sentir los estímulos ambientales y la función cerebral es normal después de la parálisis 9,27.
  8. Verifique si hay parálisis después de ~ 15 minutos con un microscopio estereoscópico y seleccione un pez paralizado que muestre un latido cardíaco normal y una circulación sanguínea robusta en el cerebro y el cuerpo.
  9. Transfiera el pescado a una cámara de registro hecha a medida, que es una placa de Petri de 35 mm con un orificio de 10 mm de diámetro en el centro y un cubreobjetos de vidrio de 20 x 20 mm pegado en la parte inferior para cubrir el orificio. Retire el agua y agregue ~ 200 μL de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5%.
  10. Coloque el pez con el lado dorsal hacia arriba en la agarosa con fórceps (Dumont # 5). Cuando la agarosa se haya solidificado por completo, agregue la solución extracelular para cubrir la agarosa. La agarosa tarda entre 5 y 10 minutos en solidificarse por completo.
  11. Corta y retira la agarosa por encima de la cabeza del pescado con un microcuchillo. Luego, haga una pequeña incisión en la piel por encima del ventrículo cerebral entre el tectum óptico y el cerebelo con una micropipeta de vidrio con una abertura de punta de ~ 1 μm para que la pipeta avance hacia el siguiente paso del cerebro.
  12. Elimine los restos de tejido o los coágulos de sangre alrededor del orificio de disección con una pipeta de vidrio rota.

3 Registro de pinza de parche de célula completa

  1. Prepare micropipetas de registro con una abertura de punta de ~1 μm y una resistencia de ~20 MΩ utilizando capilares de borosilicato el día del experimento. Guarde las micropipetas estiradas en un recipiente y utilícelas el mismo día para evitar la contaminación.
  2. Encienda la computadora, la cámara CCD, el monitor, el amplificador, el digitalizador, el micromanipulador y el software asociado. El amplificador y el digitalizador deben estar encendidos antes de abrir el software.
  3. Mueva con cuidado el pez a una plataforma electrofisiológica donde se realizará el experimento de la abrazadera de parche.
  4. Perfunda el pescado con una solución extracelular oxigenada a ~ 2 ml por minuto usando una bomba peristáltica para mantener la salud y la viabilidad celular de los peces.
  5. Mueva la cámara de grabación con un traductor X-Y (hecho a medida) para centrar el pez en el campo visual de un objetivo 4x bajo un microscopio vertical.
  6. Cambie a un objetivo de 60x y mueva el traductor para visualizar la región del hipotálamo objetivo. Ajuste el contraste de interferencia diferencial (DIC) de Nomarski con luz infrarroja de 900 nm para obtener la mejor visualización de las células.
  7. Encienda la fuente de luz de excitación de fluorescencia (por ejemplo, bombilla de mercurio) y utilícela para visualizar neuronas fluorescentes en el hipotálamo. Localice neuronas sanas que muestren fluorescencia brillante y límites celulares claros, lo que a menudo indica una buena salud celular y facilita registros electrofisiológicos de alta calidad.
  8. Rellene lentamente una micropipeta de grabación con solución intracelular utilizando una punta fina de microcargador.
  9. Fije el electrodo al cabezal del amplificador y apriete la perilla para evitar fugas de aire. Aplique una ligera presión positiva (~150-200 mBar) en el interior de la micropipeta a través del tubo conectado al soporte, lo que evita que los contaminantes en la interfaz aire-solución entren en la punta del electrodo.
  10. Baje la micropipeta en la solución de baño con un micromanipulador en modo rápido y coloque la punta de la micropipeta sobre el orificio diseccionado debajo del objetivo 4x.
  11. Cambia el micromanipulador al modo lento y cambia el objetivo al de 60x. Avance la punta de la pipeta de vidrio lentamente a través del orificio de disección y a lo largo del ventrículo entre los dos hemisferios tectales.
  12. Lleve la punta de la pipeta ortogonalmente hacia una célula fluorescente objetivo vista tanto con DIC como con fluorescencia. Una vez que la punta de la pipeta toca la membrana celular, se forma una pequeña hendidura.
    NOTA: Para visualizar tejidos profundos como el hipotálamo, se utiliza IR-DIC de 900 nm junto con filtros polarizadores y analizadores que están finamente ajustados para IR-DIC.
  13. La liberación de la presión positiva rápidamente cuando la punta toca una celda permite que la celda forme un sello con la pipeta. Simultáneamente, aplique una breve presión negativa a través del tubo conectado al soporte.
    NOTA: El valor de resistencia en el software debe aumentar rápidamente a > 1 GΩ, lo que indica que se ha formado un sello de alta resistencia. Cuando la célula hipotalámica fluorescente se registra con éxito, debe haber una membrana celular fluorescente dentro de la punta de la micropipeta de registro.
  14. Sujete la celda a -60 mV y espere 1-2 minutos hasta que la línea de base y la resistencia de acceso sean estables. Aplique un breve pulso eléctrico o una succión suave por la boca para romper la membrana celular debajo de la punta de la micropipeta.
  15. Compensar la corriente capacitiva y la resistencia en serie en una configuración de software electrofisiológico. Descarte los datos si la resistencia en serie es mayor de 100 MΩ y varía > 20% en las grabaciones.
  16. Aplique un pulso de voltaje de 1 s -10 mV en modo de voltaje para monitorear la resistencia intrínseca de la membrana antes y después de los experimentos. Deseche la celda si la resistencia de la membrana o el potencial de membrana varía mucho.
  17. Primer registro en modo de pinza de voltaje (VC) cuando la celda se mantiene en un valor negativo. Después de establecer una grabación estable, cambie al modo de pinza de corriente (IC) si es necesario.
    NOTA: Es posible que el giga-sello no sea estable poco después de la ruptura, por lo que sujetar la celda a -60 mV en modo VC durante unos minutos al comienzo de un experimento puede proporcionar mejores condiciones celulares.
  18. Procese el análisis de datos electrofisiológicos y la detección de picos sin conexión con MATLAB una vez finalizado el experimento.
  19. Después de los experimentos, sacrificar a los peces larvales con hipoclorito de sodio (NaClO) al 1,5% y eliminarlos de acuerdo con los protocolos institucionales de cuidado de animales.

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Resultados

En este manuscrito, presentamos una técnica mejorada de registro de pinza de parche de células enteras in vivo para investigar las neuronas hipotalámicas en el pez cebra intacto, centrándonos particularmente en las neuronas de hipocretina (Hcrt).

Como se presenta en la Figura 1, nuestra metodología permite registros electrofisiológicos directos de estas neuronas en lo profundo del cerebro en un animal intacto (Figura 1A), sup...

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Discusión

El protocolo descrito aquí permite grabaciones de pinzas de parche de neuronas peptidérgicas en el hipotálamo larvario del pez cebra, una de las regiones cerebrales más profundas y técnicamente difíciles de acceder. Debido a la dificultad inherente de esta preparación, los registros exitosos de la pinza del parche requieren una atención meticulosa a algunos parámetros críticos, a saber, la calidad de la pipeta, la técnica de aproximación, la pureza de la solución y la salud del tejido. E...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses ni nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al Dr. Daniel Wagenaar por su ayuda en el diseño de dispositivos para experimentos optogenéticos. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NS122172 R35 y R34 NS126800 de los Institutos Nacionales de Salud a DAP, y el Programa de Introducción de Talentos en el Extranjero de Shanghai a R.Z.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AmplificadorAxón700B
Capilares de vidrio de borosilicatoSutterBF100-58-10
Cámara CCDDage-MTIIR-1000 (en inglés)
Ordenadores para registros electrofisiológicosDellPrecisión 3660
DigidataAxón1440A
Jaula de FaradayHecho a medida
FórcepsF.S.T.Dumont #5
IncubadoraLonroyGZP-150B
Filtro de membranaMillipore SigmaSLGV004SL
Micro cuchilloF.S.T.10318-14
ObjetivoOlimpoMplan 5X/0.1; UMPlanFI/IR 60X/0.9w
Bomba peristálticaMás tiempoBT100-1L
Soporte para pipetasNarishigeH-7para disección
TiradorInstrumento Sutterpág. 97
Estereomicroscopio para cribado y disección fluorescenteOlimpoSZX16
EstimuladorA.M.P.IMaestro8
Micromanipulador tridimensionalInstrumento SutterMPC-325
Microscopio DIC infrarrojo verticalOlimpoBX51WI
Mesa de aislamiento de vibracionesTMC61-541-06
Monitor de vídeoSUNSPOSP-717
Baño de aguaYihengHWS-12
Traductor X-YHecho a medida

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