Pruebas de biodegradación aeróbica de materiales utilizando un inóculo natural de agua de mar marina y un respirómetro de circuito cerrado

Resumen

El protocolo describe el procedimiento operativo estándar para probar materiales potencialmente biodegradables, tanto sintéticos como naturales, en condiciones aeróbicas utilizando un inóculo de agua de mar natural y un sistema automatizado de respirometría de circuito cerrado.

Resumen

La evaluación adecuada de los materiales biodegradables depende de la amplia adopción de métodos de prueba estándar. Aunque existen tales métodos, la capacidad de prueba sigue siendo limitada, limitada por el costo y el tiempo de puesta en marcha para establecer nuevos laboratorios. Este protocolo de cribado modificado se basa en el método de prueba estándar ASTM International D6691-24a, para determinar la biodegradación aeróbica de materiales plásticos en el medio marino mediante un consorcio microbiano definido o un inóculo natural de agua de mar. Evalúa la biodegradación de materiales en un entorno marino, comparando los resultados con controles positivos y negativos, y utiliza un inóculo natural de agua de mar suplementado con amonio y fosfato para evitar la limitación de nutrientes. Los materiales se exponen a esta agua de mar enriquecida con nutrientes y se incuban a 30 °C. Un respirómetro Micro-Oxymax mide la producción de biogás (dióxido de carbono,_CO2) a lo largo del tiempo. El grado de mineralización (biodegradación) se determina calculando la proporción de carbono derivado del material convertido en biogás-carbono. El porcentaje de producción de_CO2 , expresado como una fracción del contenido de carbono medido o teórico, se informa en función del tiempo. El sistema de respirometría de circuito cerrado se adapta a una gama de recipientes del reactor, preparados por triplicado para cada material, un control negativo (solo inóculo de agua de mar) y un control positivo (celulosa de cromatografía en capa fina). Este método es importante para evaluar materiales en el medio marino y aborda la prevención de la contaminación global.

Introducción

Los desechos plásticos representan una amenaza para los ecosistemas marinos y la salud humana¹. La creciente preocupación por la contaminación plástica, junto con los desechos marinos de cualquier material en el océano, subraya la necesidad de soluciones sostenibles, como una mejor gestión de los desechos al final de su vida útil y materiales biodegradables que se biodegradan fácilmente en el medio marino. A diferencia de los plásticos sintéticos tradicionales, que persisten durante décadas o siglos y generan microplásticos que se acumulan en las redes tróficas ^2,3,4, los materiales biodegradables, componentes orgánicos del carbono, pueden metabolizarse en CO₂ y metano (CH₄), o asimilarse en biomasa microbiana⁵. Por lo tanto, comprender la biodegradación de los materiales en el agua de mar es clave para cuantificar y mitigar los impactos ambientales de los desechos marinos.

La biodegradación en el medio marino se controla mediante la interacción de variables espaciotemporales, incluida la disponibilidad de luz y nutrientes, la presión, la temperatura, la composición de especies microbianas y la naturaleza fisicoquímica y la estructura del polímero, que determinan la velocidad, el grado y el mecanismo de degradación⁶. Estas variables presentan un desafío significativo para los estudios de biodegradación basados en laboratorio que simulan ambientes marinos. Este procedimiento operativo estándar (SOP) utiliza agua de mar natural como inóculo, capturando la comunidad microbiana in situ presente, y registra variables relevantes que incluyen nutrientes disueltos en agua de mar, partículas de carbono y nitrógeno, clorofila, salinidad, pH y temperatura. Este enfoque controlado basado en laboratorio optimiza las condiciones para promover la mineralización y permite mediciones directas de biodegradación que no son factibles in situ. La norma ASTM International D6691-24a, Método de ensayo estándar para determinar la biodegradación aeróbica de materiales plásticos en el medio marino mediante un consorcio microbiano definido o un inóculo natural de agua de mar (en adelante, ASTM D6691), y este POE se desarrollaron como una herramienta de cribado rápida y fiable para evaluar la biodegradabilidad de los materiales 7,8,9,10.

Alineado con ASTM D6691, una prueba de detección para la biodegradabilidad inherente de polímeros, este protocolo evalúa la biodegradación de materiales en condiciones óptimas, 30 °C, área de superficie máxima de la muestra molida y exceso de nutrientes inorgánicos (nitrógeno, 130 mg / L; fósforo, 23 mg / L)⁹, para promover la mineralización y prevenir limitaciones de nutrientes. Si bien las pruebas de detección ofrecen información inicial valiosa, podrían ser necesarias pruebas adicionales, como amarres costeros y de aguas profundas, que miden la pérdida de peso en función del tiempo, para una evaluación integral en condiciones marinas naturales. Dado que estas pruebas de amarre costero y de aguas profundas estiman la biodegradación en función de la pérdida de peso en función del tiempo^10,11, los investigadores deben realizar primero esta prueba de cribado, que mide directamente el metabolismo microbiano, antes de pasar a un experimento de amarre costero y de aguas profundas in situ, que también es más caro.

El método de prueba estándar ASTM D6691 describe los procedimientos para evaluar la biodegradación aeróbica de materiales plásticos no flotantes en entornos marinos. Esta norma, junto con las normas de especificación, como la ASTM D7081 (Especificación Estándar para Plásticos Biodegradables No Flotantes en el Medio Marino; centrada en la biodegradabilidad en un medio acuoso, actualmente retirada de ASTM y que se está volviendo a votar), proporciona un marco para certificar polímeros experimentales como biodegradables marinos ^9,12. En general, una especificación es un estándar de consenso de ASTM International que establece los requisitos que debe cumplir un material, producto o sistema. Garantiza que los materiales diseñados para biodegradarse en entornos marinos lo hagan dentro de plazos aceptables y no liberen aditivos potencialmente tóxicos, como colorantes o plastificantes.

Basándose en la norma ASTM D6691, este protocolo cuantifica la tasa y el grado de biodegradación aeróbica de los materiales (sustrato experimental) en el agua de mar natural y amplía los controles positivos de los materiales (es decir, celulosa, papel Kraft, quitina/quitosano), que históricamente han demostrado ser biodegradables en el medio marino ^7,9,10. El objetivo de este método es cribar materiales en condiciones optimizadas para ver si los materiales se biodegradan en el medio marino. El inóculo aprovecha la comunidad microbiana natural presente en el agua de mar, recolectada siguiendo las pautas específicas descritas en ASTM. Estas pautas enfatizan el uso de agua de mar con una salinidad de aproximadamente 32, recolectada de un lugar libre de contaminantes como aguas residuales, vertidos químicos o derrames de petróleo. La prueba utiliza un respirómetro automatizado de circuito cerrado con recipientes de reactor de 250 ml mantenidos a 30 ° C, cada uno con 75 ml de agua de mar y ~ 20 mg del sustrato experimental o de control⁸. La mineralización (biodegradación) se expresa como el porcentaje de biogás de carbono neto (CO_2-C) producido en relación con la masa de carbono inicial agregada. Este método no tiene en cuenta la asimilación de carbono en biomasa microbiana.

Protocolo

1. Recolección y caracterización del agua de mar

1. Identifique un sitio de recolección de agua de mar que no se vea afectado por aguas residuales, productos químicos, manchas de petróleo o una fuerte influencia del agua dulce.
2. En el sitio de recolección, registre la fuente (ubicación, latitud y longitud, profundidad de recolección, profundidad total y temperatura), la fecha de recolección de muestras y las condiciones observadas del agua.
3. Recolecte y combine muestras de agua de mar de múltiples profundidades, ubicaciones de sitios y eventos de muestreo para promover una composición de comunidad microbiana diversa.
4. En un garrafón lixiviado con ácido de 20 L, recoja de 10 a 20 L de agua de mar con una botella grande de Niskin y transpórtela de regreso al laboratorio.
5. Desde el garrafón, transfiera 1 L de submuestra de agua de mar entera a una botella de polietileno ámbar de alta densidad (HDPE) de 1 L lixiviada con ácido para el análisis de laboratorio de partículas de carbono y nitrógeno para las condiciones iniciales del agua de mar. De la muestra de 1 L, filtre (0,2 μm; acetato de celulosa con bajo contenido de nitrógeno) y recoja una submuestra de 60 ml en un frasco de polietileno lixiviado con ácido para el análisis de los componentes de nitrógeno (N) y fósforo (P) inorgánicos y orgánicos disueltos.
6. Etiquete las submuestras con el nombre del proyecto, el ID de muestra y la fecha. Mida las concentraciones de NH₄⁺ utilizando el método de indofenol (4500-NH3)^13,14 y los niveles de PO₄^3- utilizando el método de solución única (4500-P E)^13,15. Cuantificar el nitrógeno y el carbono en partículas utilizando el método de análisis elemental¹⁶. Mida las concentraciones de clorofila-a siguiendo los protocolos descritos por Parsons et ^al.17 (10150 A, 10150 C) ¹³.
   NOTA: Los análisis de calidad del agua relacionados con los nutrientes son opcionales. Este protocolo asume que los análisis son realizados por un laboratorio externo.
7. Cubra sin apretar la abertura de la garrafa para mantener las condiciones aeróbicas y almacene el agua de mar a 30 °C en la oscuridad hasta por 7 días.
   NOTA: El agua de mar también se puede airear usando una bomba de aire y un sistema de burbujeo.

2. Preparación del sustrato experimental

1. Agregue 10-15 g de sustrato experimental (es decir, polisacáridos naturales, madera, tableros de fibra, polímeros) que pueden estar en forma de gránulos, fragmentos y piezas formadas a un frasco de fresado de acero inoxidable de 50 ml con una bola de acero de 20 mm. Fresar el sustrato experimental a un tamaño de partícula uniforme (0,10-0,25 mm) antes del inicio del ensayo.
2. Sumerja el frasco de molienda en nitrógeno líquido y fradique durante 15 min hasta que el nitrógeno líquido deje de hervir.
   PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido es un líquido criogénico que puede causar quemaduras, lesiones o congelación. Lea y siga todas las hojas de datos de seguridad antes de usar. Use el equipo de protección personal adecuado.
3. Asegure la jarra de molienda en el accesorio del molino de bolas y ajuste los parámetros del instrumento a 30 Hz y 2:30 min, y pulse Start. Repita 4 veces con 30 s de enfriamiento en nitrógeno líquido entre ensayos. Si el material es un polímero con una baja temperatura de transición vítrea, realice ciclos de molienda adicionales según sea necesario para producir una distribución uniforme del tamaño de partícula.
4. Verifique la uniformidad del tamaño y caracterice la distribución del tamaño de las partículas mediante el análisis del tamiz como se describe en ASTM D1921-96¹⁸. Ensamble tamices estándar que abarquen el rango de tamaño de partícula esperado, con el tamaño de malla más pequeño en la parte inferior. Coloque la muestra molida en el tamiz superior y asegure la pila de tamiz en un agitador mecánico. Agite hasta que las partículas pasen a través de la malla. Recoja y pese el material retenido de cada tamiz para calcular la distribución del tamaño de las partículas. Use el mismo conjunto de tamices en todos los tratamientos para mantener la comparabilidad. Registre la distribución en la hoja de datos.
5. Determinar el contenido de carbono por peso seco de la submuestra del sustrato experimental molido mediante análisis elemental¹⁶.
   NOTA: Este protocolo asume que el análisis elemental es realizado por un laboratorio externo.

3. Preparación de los nutrientes adicionales para el agua de mar.

1. Llene un matraz aforado de 2 L o 4 L hasta la mitad con agua de mar. El volumen total necesario depende del número de recipientes del reactor que se utilizarán en el experimento. Cada vasija del reactor contendrá 75 ml de agua de mar. Si la fuente de agua de mar contiene altas concentraciones de materia orgánica particulada, tamizar el agua de mar a través de una malla de 20 μm para eliminar la contaminación heterogénea por partículas grandes.
2. Utilizando una balanza de precisión con sensibilidad a 0,001 g, tarar un plato de pesaje y pesar 0,5 g/L de cloruro de amonio (NH₄Cl) y luego 0,1 g/L de fosfato de potasio monobásico (KH₂PO₄) a base de 2 L o 4 L de agua de mar.
   PRECAUCIÓN: El cloruro de amonio puede causar daño o irritación ocular. Lea y siga todas las hojas de datos de seguridad antes de usar y use el equipo de protección personal adecuado.
   NOTA: Deseche los desechos monobásicos de cloruro de amonio y fosfato de potasio en contenedores dedicados a desechos peligrosos según los procedimientos institucionales y las regulaciones locales. Pequeños volúmenes de soluciones diluidas (<1%) NH₄Cl y KH₂PO₄ pueden ser elegibles para la eliminación de drenaje después de la dilución con abundante agua, si lo permiten la institución y la autoridad local de aguas residuales.
3. Agregue los nutrientes inorgánicos al matraz avolumétrico de 2 L o 4 L, lleve el volumen con agua de mar, agregue una barra de agitación y revuelva en una placa de agitación hasta que todas las sales se disuelvan. La solución debe ser transparente sin partículas visibles.
4. Submuestree 20-30 ml del agua de mar suplementada con nutrientes para medir el pH y la salinidad. Filtre 60 ml adicionales a través de un filtro de acetato de celulosa con bajo contenido de nitrógeno de 0,2 μm en una botella de polietileno lixiviado con ácido para el análisis de N y P inorgánicos disueltos siguiendo los métodos estándar del paso 1.5.
5. Mida el pH y la salinidad en un medidor de sobremesa siguiendo las instrucciones del fabricante. Se espera una disminución del pH de aproximadamente una unidad para el agua de mar sin diluir debido a la acidez del suplemento nutricional.

4. Preparación para la incubación de la vasija del reactor

1. Lixiviación con ácido de toda la cristalería, incluidos los recipientes de reactor de 250 ml para las muestras y la pipeta volumétrica de 75 ml en ácido clorhídrico (HCl) al 10% durante 24 h y enjuague 3 veces con agua desionizada.
   PRECAUCIÓN: El HCl puede causar quemaduras graves y daño ocular. Lea y siga todas las hojas de datos de seguridad antes de usar. Use el equipo de protección personal adecuado.
   NOTA: Los desechos de HCl al 10% se pueden neutralizar con bicarbonato de sodio para formar una solución neutra antes de su eliminación. Realizar la neutralización de acuerdo con los procedimientos institucionales de residuos peligrosos y las regulaciones locales aplicables.
2. Autoclave los recipientes vacíos del reactor de 250 ml lixiviados con ácido, tapas con puertos, juntas tóricas de sello de silicona y tapones de rosca en un autoclave a 121 °C durante 15 min antes del día del experimento.
3. Etiquete los viales de muestra con el número de canal/ID correspondiente a los recipientes que reciben la muestra o los materiales de control.
4. Usando la balanza analítica, tarar un vial (con tapa) y pesar 20 mg (± 0,1 mg) del experimental o control, y registrar el peso total de la lectura, y reservar. Repita para todas las réplicas experimentales y de control.
   NOTA: Asegúrese de que los pesos sean precisos. Se recomienda pesar todos los sustratos el mismo día y por la misma persona.
5. Encienda la incubadora el día anterior a agregar recipientes y ajuste la temperatura a 30 ° C. Encienda el respirómetro al menos 2 h antes de ejecutar el diagnóstico del sistema y la calibración del sensor según las instrucciones del fabricante.
   NOTA: La preparación de la vasija del reactor puede continuar una vez que la temperatura de la incubadora alcanza y mantiene 30 ± 2 °C.
6. Prepare la hoja de datos registrando los ID / réplicas de muestra y el número de canal correspondiente. Organice las vasijas del reactor y los conjuntos de tapas (tapa con puertos / junta tórica) en orden de número de canal / ID (asegúrese de que cada recipiente esté claramente etiquetado). Revise las juntas tóricas y las tapas/puertos para asegurarse de que estén limpios, secos e intactos.

5. Montaje de las vasijas del reactor

1. Utilice una pipeta volumétrica de 75 ml lixiviada con ácido y un controlador de pipeta motorizado para dispensar 75 ml de agua de mar suplementada con nutrientes en cada recipiente del reactor.
2. Retire una pipeta desechable de agua de mar (~3 ml) de cada recipiente y colóquela sobre una superficie limpia junto a él. Esta agua de mar se utilizará para enjuagar los sustratos experimentales y de control molidos del vial tarado (Figura 1).
3. Transfiera los sustratos a recipientes apropiados.
4. Coloque una junta tórica en el borde de la vasija del reactor, luego coloque una tapa de dos puertos directamente encima de la junta tórica. Asegure la junta tórica y la tapa en su lugar con una tapa de rosca.
5. Haga coincidir la vasija del reactor con sus correspondientes líneas de gas/condensación. Inserte firmemente las líneas de gas en los puertos de entrada/salida apropiados en la tapa del recipiente.
6. Encienda la plataforma del agitador a 0,05 x g (modo continuo). Realice una verificación visual para asegurarse de que todos los recipientes estén seguros, luego cierre la puerta de la incubadora.
7. Registre la temperatura de la incubadora (lectura y sonda de termistor) y la presión atmosférica con un barómetro.

Figura 1: Configuración y preparación de la embarcación. (A) Agregar agua de mar, (B) agregar la muestra y (C) agregar la junta tórica, la tapa de metal y la tapa de rosca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Inicio del sistema de respirometría

1. Inicie el software en la computadora conectada. Verifique que el sistema detecte el hardware a través de la conexión RS-232. Si no se encuentra el hardware, una notificación indicará que el dispositivo no está conectado y el programa debe reiniciarse.
2. En el menú principal del software, seleccione Herramientas > diagnóstico > Operaciones básicas. Haga clic en Guardar archivo de registro. Haga clic en Válvulas y sensores. El software indicará APROBADO o REPROBADO para cada prueba. Proceda a la calibración de dos puntos del sensor de CO₂ solo si ambas pruebas pasan.

7. Calibración del sensor de_CO2

1. Conecte una columna de cal sodada al puerto de nitrógeno en el panel posterior de la bomba de muestras para eliminar el CO₂ ambiental para una calibración cero. Asegúrese de que la cal sodada se vea blanca como la tiza y no descolorida (por ejemplo, rosa o morada).
2. Seleccione Herramientas > calibración. Haga clic en Iniciar calibración en la esquina inferior derecha. Cuando se le solicite, ajuste el flujo de muestra a 0,5 L/min utilizando el control de la bomba de muestras del panel frontal. Haga clic en Aceptar.
3. Cuando el temporizador llegue a cero, presione los botones de compensación hacia arriba y hacia abajo en el sensor de CO₂ para ajustar la lectura en la pantalla a 0.000 (o lo más cerca posible). Los valores se volverán verdes cuando estén dentro del rango aceptable. Haga clic en Siguiente gas.
4. Cuando se le solicite, conecte el cilindro de gas de calibración al puerto de calibración en el panel posterior de la bomba de muestra. Ajuste la presión de salida de gas de calibración a 5 PSIG. Asegúrese de que el exceso de gas fluya a través del accesorio en T mediante el cual el usuario pueda escuchar y sentir el gas cerca del accesorio, antes de hacer clic en Aceptar.
5. Cuando el temporizador llegue a cero, presione los botones Up y Down span en el sensor de CO₂ para ajustar la lectura en la pantalla a 2.700 (o lo más cerca posible). Los valores se volverán verdes cuando estén dentro del rango aceptable. Haga clic en Siguiente gas para completar la calibración.
   NOTA: Las concentraciones de gas en el tramo están determinadas por la mezcla de gases estándar primarios certificada, como se documenta en el certificado de análisis del proveedor.

8. Configuración del experimento en el software

1. Seleccione Experimento > configuración. Ingrese los números de canal de inicio y finalización en los menús desplegables según los canales ocupados.
   1. Establezca Umbral de actualización (%) en 0,50, Intervalo de actualización en N.A. y Ventana de actualización (s) en Automático.
   2. En Configuración miscelánea, marque la casilla Sensores de purga; asegúrese de que la medición automática de volumen, el consumo positivo de O₂ y la opción Habilitar modo de flujo abierto no estén seleccionados.
   3. Establezca el intervalo de muestra (horas) en 8.00 y la duración del experimento (horas) en N.A. Establezca las unidades de gas y tiempo según sea necesario.
   4. Si utiliza la sonda de temperatura primaria para la corrección de la temperatura de incubación, asegúrese de que no esté seleccionada la opción Introducir manualmente las temperaturas de la cámara. Marque la casilla Modo de ventilación y asegúrese de que el Modo de drenaje no esté seleccionado.
   5. Asegúrese de que el modo de ventilación anaeróbica no esté seleccionado.
2. Seleccione Configuración de la cámara. Ingrese etiquetas de canal descriptivas (por ejemplo, NegCtrl_1, PosCtrl_2, Test_PHA_3).
3. Haga clic en Utilidades. Haga clic en Celdas en la columna EN solo para canales ocupados. Haga clic en Restricción. El software indicará APROBADO o FALLIDO para cada canal. Continúe solo si se superan todas las pruebas de restricción.
4. Haga clic en Volumen para medir los volúmenes de espacio de cabeza.
   NOTA: El volumen del espacio de cabeza es igual al volumen de aire dentro del recipiente del reactor de muestra y el tubo de circuito cerrado. Confirme que los volúmenes sean razonables para el tamaño del recipiente y la longitud de la tubería.
5. Haga clic en Fuga. El software indicará PASA o FALLA para cada canal en función del volumen del espacio de cabeza. Si se produce un error en un canal, realice los siguientes pasos.
   1. Asegúrese de que la junta tórica esté limpia y libre de partículas y fibras y que esté correctamente asentada entre el borde del recipiente y la tapa de metal.
   2. Apriete la tapa del rosca. Verifique la conexión y la tubería en los puertos y accesorios de entrada / salida. Recorte los extremos de los tubos desgastados o deformados con una cuchilla afilada para garantizar un corte limpio y recto.
   3. Si el canal continúa fallando, reemplace la junta tórica por una nueva y compatible especificada por el fabricante.
6. Haga clic en Volumen para volver a medir los volúmenes de espacio de cabeza. Haga clic en Salir. Asegúrese de que la columna Volumen de la pestaña Configuración de la cámara esté rellena para todos los canales ocupados.
7. En el menú principal, seleccione Herramientas > menú de servicio. Confirme que la sonda de temperatura primaria, que mide la temperatura de la incubadora, esté a 30 °C ± 2 °C y estable.
8. Haga clic en Ejecutar. Guarde el archivo con un nombre descriptivo que incluya la fecha (por ejemplo, 030325PositiveControlValidation). Registre el nombre del archivo en la hoja de datos.
9. Seleccione Experimento > Ver > Gráficos para ver gráficos en tiempo real. La producción de biogás aparece como tasas de producción positivas de_CO2 . Los controles negativos pueden fluctuar alrededor de cero; sin embargo, su tasa promedio debe ser cero o positiva.
10. Si el sistema incluye secadores de aire de condensación, mantenga un registro diario de condensación visible en la tubería. Agite suavemente los tubos para interrumpir las obstrucciones y permitir el drenaje, si es necesario.
11. Actualice los archivos de datos (archivos de texto ASCII) al final de cada intervalo de muestreo. Los datos, incluida la temperatura, el % de gas (composición del gas), la tasa y la acumulación, se pueden descargar a varios otros paquetes de software durante el experimento o al final.
    1. Para abrir archivos .dat en una hoja de cálculo, inicie Excel y seleccione Archivo > Abrir. Vaya a la carpeta que contiene el archivo .dat. En el menú desplegable de tipo de archivo, seleccione Todos los archivos y elija el archivo deseado.
    2. Cuando el Asistente para importación de texto se lo solicite, seleccione Delimitado como tipo de archivo y haga clic en Siguiente.
    3. En Delimitadores, active la casilla Coma. Asegúrese de que no hay otros delimitadores seleccionados. La ventana de vista previa debe mostrar los datos separados en columnas. Haga clic en Finalizar para cargar los datos en la hoja de cálculo.
    4. Guarde el archivo como formato .xlsx o .csv para su posterior análisis y archivo.
12. Periódicamente, analice los datos para asegurarse de que las réplicas del tratamiento sean consistentes. El error estándar de las réplicas del tratamiento debe ser inferior al 5% de la producción media acumulada de_CO2 . Repita las pruebas que no superan este umbral.
13. Haga clic en Detener cuando se complete la incubación.
    1. Las incubaciones pueden durar de 10 a 90 días. Si los materiales de ensayo son altamente biodegradables, poner fin a la incubación cuando la producción acumulada de_CO2 se estabilice o ampliarla si no se observa degradación después de 90 días.
    2. Concluir los experimentos cuando no se observe producción neta de gas durante al menos 5 días tanto en los recipientes de control como en los de prueba. Ninguna producción neta se define como un cambio inferior al 1% en el porcentaje de biodegradación durante 5 días.
14. Apague el sistema o prepárese para el siguiente experimento.

9. Desglose del experimento

1. Registre la temperatura de la incubadora (sonda de termistor y lectura de la incubadora). Desconecte el tubo de los recipientes del reactor del respirómetro y pese cada recipiente del reactor de muestra con una balanza de precisión. Registre los pesos para determinar si se produjo alguna pérdida de peso / agua durante el período de incubación.
2. Submuestree 20-30 ml de agua de mar de cada recipiente del reactor para medir el pH y la salinidad y compare estos valores con los registrados en el paso 3.4 para verificar la estabilidad durante la incubación. Filtre 60 ml adicionales a través de un filtro de acetato de celulosa con bajo contenido de nitrógeno de 0,2 μm en una botella de polietileno lixiviado con ácido para el análisis de N y P inorgánicos disueltos siguiendo los métodos estándar del Paso 1.5.
   NOTA: Las muestras de agua de mar residual se pueden filtrar para eliminar los plásticos restantes, diluir para reducir las concentraciones de nutrientes y eliminarse mediante descarga de drenaje de acuerdo con las regulaciones institucionales y locales.
3. Enjuague los recipientes, las juntas tóricas, las tapas metálicas y los tapones de rosca con agua del grifo. Coloque la cristalería en un baño de ácido de HCl al 10% durante al menos 24 h. Autoclave y almacenar cubierto de papel de aluminio para la próxima incubación

10. Cálculo del porcentaje de biodegradación

1. Calcule el carbono total en el sustrato experimental/de control de la siguiente manera:
   
   donde el % C (contenido de carbono) se determina mediante análisis elemental.
   NOTA: El carbono total en los sustratos experimentales y de control puede sufrir la siguiente transformación bioquímica durante la incubación aeróbica:
   C + O₂ → CO₂
   Cada mmol (12 mg) de carbono orgánico del sustrato experimental/control se puede convertir en 1 mmol de_CO2 gaseoso. Un mmole de gas producido ocupa 22,4 ml a temperatura y presión estándar (STP).
2. Calcule el porcentaje de biodegradación de la siguiente manera:
   
   donde C_g = cantidad de carbono gaseoso producido a partir del sustrato experimental/control y control negativo (inóculo de agua de mar solamente), mmoles, y C_i = cantidad de carbono en sustrato experimental agregado, mmoles.
3. Calcule el error estándar, s_e, del porcentaje de biodegradación de la siguiente manera:
   
   donde n1 y n2 = número de recipientes replicados de sustrato experimental/control y de reactores de control negativo, respectivamente, y s = desviación estándar del carbono gaseoso total producido.
4. Calcule los límites de confianza (CL) del 95% de la siguiente manera:
   
   donde t = valor de distribución t para una probabilidad del 95% con (n1 + n2 − 2) grados de libertad, por lo tanto, n = 3 + 3 − 2 = 4.

11. Fin del protocolo

1. Después de completar los cálculos y el análisis de datos, compile los resultados en el informe final o ingréselos en una base de datos compartida de acuerdo con los planes de gestión de datos institucionales o del proyecto. Asegúrese de que todos los materiales se eliminen de acuerdo con las pautas institucionales de desechos peligrosos y que todo el equipo se limpie y almacene.

Resultados

Se presentan los resultados de las pruebas de biodegradación marina. La biodegradación se evaluó para cada muestra midiendo la proporción de carbono convertido en dióxido de carbono. Las parcelas de biodegradación acumulativa, de tasa y porcentual suelen exhibir una fase de retraso, seguida de una fase de crecimiento y, finalmente, una meseta. El momento y la magnitud de estas fases dependen del material de la muestra, las condiciones experimentales y la composición del inóculo de agua d...

Discusión

El rendimiento de control positivo determina la validez de la prueba. Se requiere un mínimo de 70% de biodegradación de un sustrato de control positivo biodegradable fácilmente marino (por ejemplo, celulosa de grado analítico, papel Kraft, etc.), basado en su rendimiento máximo teórico de gas. Este punto de referencia verifica condiciones favorables y suficiente actividad microbiana en el agua de mar natural durante la incubación. El incumplimiento de este umbral indica un problema poten...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.2 & micro; m, filtro de acetato de celulosa de 47 mm	Geofiltro Geotécnico	83100056	Filtrar agua de mar
Pipeta volumétrica de 100 mL	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-650-2U	Clase A; lixiviación de ácido y enjuagado con agua desionizada
Vasos de vasos de vidrio de 100-600 mL	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	50-194-5690	Clase A; lixiviación de ácido y enjuagado con agua desionizada
Esferas de fresado de 20 mm	Retsch	53680062	Acero inoxidable. Usado con tarro de molienda para la molienda criogénica de polímeros
Tarros de molienda de 50 mL	Retsch	14620216	Acero inoxidable. Utilizado con bolas de molienda Mixer Mill de 400 y 20 mm para la criogénica de polímero
Pipeta volumétrica de 75 mL	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-650-2T	Clase A; lixiviación de ácido y enjuagado con agua desionizada
Bomba de aire y sistema de burbujas	Tetra	77846	Airear agua de mar durante la estabilización previa a la incubación
Papel de aluminio	Fisherbrand	01-213-100	Cubierta para autoclavado y almacenamiento limpio
Cloruro de amonio (NH4Cl)	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	A661-500	Pico de nutrientes en el agua de mar
Balance analítico	Mettler	AT201	Pesar sustratos experimentales y de control
Autoclave	Tuttnauer	MFI-TTN-3870EA	Esterilizar recipientes y conjuntos de tapas
Micro-Oxymax base 120VAC de un solo canal	Columbus Instruments	0135-8000	Se utiliza para almacenar controles positivos y polímero
Gas de calibración	Airgas	X03NI92P3000001	Mezclas de gases estándar primarias; 2,7% dióxido de carbono, 4,5% metano, equilibrio nitrógeno
Monitor de ordenador	Dell	210-BMKK	Monitor hub USB-C Dell Pro 24 Plus. Usado con ordenador para ejecutar el software Micro-Oxymax
Guantes criogénicos	Thermo Fisher Scientific, Tempshield, Guantes Criogénicos	11-394-306	Usado para manejar nitrógeno líquido
Termómetro de esfera	Thermo Fisher Scientific, H-B Instrument Durac	13-201-433	Termómetro calibrado para la temperatura del agua de mar en el momento de la recogida
Pipetas desechables	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-711-7M	Enjuaga los laterales del recipiente para liberar el material
Gabinete controlado por temperatura y luz ENC52	Columbus Instruments	4740-4054	Mantener las condiciones de temperatura y luz
Pinzas de cantimplora	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	S07387	Se utiliza para manipular tarros de molienda en nitrógeno líquido
Matraces, 250 mL	DWK Ciencias de la Vida	14395-250	Vasos de reactores de muestra
Frascos de cascarón de vidrio con cierres tipo tapón	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	03-339-26D	Almacenamiento de muestras
Profundímetro portátil H22PX	Marine Occidental, Marina de Norcross	6849368	Determinar la profundidad del sitio de recogida de agua de mar
GPS portátil 73	Garmin	10-01504-00	Utilizado para determinar la ubicación del sitio de recogida de agua de mar
Bandeja HDPE	Thermo Scientific, Nalgene	13-359-26	Usado para usar vidrio con ácido y vidrio en lixiviación; en una solución de HCl al 10%
Ácido clorhídrico (solución de agua ácida)	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	A144-212	ACS Plus certificado, 36,5 a 38,0%. Control de sensores CO2 y cristalería con lixiviación de ácido
Campana de flujo laminar	Ciencias del Aire	FLOW-48-A	Minimizar los contaminantes en el aire durante la preparación de la muestra
Niskin grande; Solo botella Beta Plus - 8,2L horizontal, PVC	Primero la Ciencia	3-1980-H65	Para recogida de agua de mar desde el muelle o el barco
Bandeja de nitrógeno líquido	Thermo Fisher Scientific, Bel Art Magic Touch 2	11-999-063	Mantener nitrógeno líquido
Recipiente de transferencia de nitrógeno líquido, 10 L	Termo Científica	TY509X2	Almacenar y dispensar nitrógeno líquido para criomillar
Nitrógeno líquido, grado industrial, 22 PSI	Airgas	NI 180LT22	Usado para fragilizar y moler polímeros
Agitador mecánico de tamiz	Humbolt, Grainger	5DPL6	Análisis de tamiz para la distribución del tamaño de partículas
Micro-Oxymax	Columbus Instrumentts	7395-113-D64	Junta tórica sellada en silicona, puerto metálico con 3 conexiones y tapa de rosca GL45 y nbsp;
Interfaz de expansión de canal Micro-Oxymax 10	Columbus Instruments	0135-8101	Componente del Sistema de Respirometría
Micro-Oxymax Respirometer (sensor de CO2 al 3%)	Columbus Instruments	0135-8403	Infrarrojo no dispersivo
Molino mezclador 400	Retsch	207450001	Molino mezclador 400. Utilizado para la molienda criogénica de polímeros
Controlador de pipetas motorizadas	Eppendorf	4430000018	Transferir agua de mar a los recipientes de los reactores de muestreo
Botella de boca estrecha de ámbar HDPE calidad de laboratorio, 1 L	Thermo Scientific, Nalgene	02-923-5	Muestra discreta de agua de mar entera
Malla de nailon 20 micras	ELKO Filtering Co.	41718	Se utiliza para tamizar agua de mar cruda y eliminar partículas heterogéneas más grandes
Agitador orbital al aire libre	Thermo Fisher Scientific	SK4000	Mantener el movimiento orbital de los vasos del reactor durante la incubación
OptiPlex 5090 Ordenador de Pequeño Factor de Forma	Dell	C0SL03	Ordenador Desktom usado para ejecutar el software Micro-Oxymax & nbsp;
Medidor de pH/Cond	Mettler Toledo, SevenExcellence S470-Basic	30046252	Medidor de pH/conductividad de mesa para medir el inoculo inicial y final de agua de mar
Botella de polietileno, 60 mL	Qorpak	PLC-03564	Muestra discreta de agua de mar filtrada
Fosfato potásico monobásico (KH2(PO4))	Thermo Fisher Scientific, Fisher BioReactivos	BP362-500	Pico de nutrientes en el agua de mar
Equilibrio de precisión	Sartorius	Practum2102-1S	Pesar el tare y el peso total de los recipientes
Carboy redondo, 20 L	Thermo Fisher Scientific	02961A	Lixiviado con ácido para almacenamiento de agua de mar
Gafas de seguridad	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	19-181-513
Scoopula	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand, Scoopula	01-257-567	Scoopula de laboratorio de acero inoxidable
Tamices	Advantech, Grainger	40PR18-40PR55	Tamices de acero inoxidable. El número y tamaño de tamices dependerá del material que se vaya a analizar.
Sigmacell Cellulosa, Tipo 101	Sigma-Aldrich	435236-250G	Polvo, sustrato de control positivo
Bicarbonato de sodio	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	S233-500	Comprobación del sensor CO2
Sulfito de sodio, anhidro, 98%	Thermo Fisher Scientific, Thermo Scientific Chemicals	AAA1793336	Comprobación del sensor CO2
Termómetro/sonda termistor	Fisherbrand	15-079-700	Verifica la temperatura de la incubadora
Barómetro de Dial de Precisión Trazable	Fisherbrand	14-648-51	Registrar la presión atmosférica al inicio del experimento
Regulador de dos etapas de hidrógeno de media capacidad Victor, metano de dos etapas, CGA - 350	AirGas	VIC0781-3559	Regulador de gas de calibración
Matrazas volumétricas, 2 L	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	FB4002000	Clase A; ácido lixiviado y enjuagado con agua desionizada. Se usa para preparar agua de mar con hidratos nutritivos.
Bandelas de pesaje	Thermo Fisher Scientific	02-202-101	Polietileno