Este protocolo describe un sistema in vitro para modelar la infección lítica de novo del herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi utilizando viriones derivados de BAC16. El método permite la investigación de la replicación y diseminación viral temprana. La producción de virus infecciosos se cuantifica mediante ensayos de unidades infecciosas basadas en GFP y PCR en tiempo real de genomas virales encapsulados.
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Artículo de método
Establecimiento y cuantificación de la infección lítica de novo por herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi libre
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Resumen
Resumen
El herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV), un gammaherpesvirus implicado en múltiples neoplasias malignas humanas, puede sufrir replicación lítica durante la infección primaria, un proceso que contribuye a la diseminación viral, la evasión inmune y la patogénesis de la enfermedad. Sin embargo, la falta de sistemas in vitro robustos para la infección lítica de novo ha limitado los conocimientos sobre los eventos tempranos de infección. Aquí, presentamos un protocolo manejable que emplea células HCT 116 de cáncer colorrectal humano como objetivos para la infección con viriones libres de células derivadas de células productoras de iSLK reactivadas por el cromosoma 16 artificial bacteriano KSHV (BAC16). Este modelo recapitula los pasos clave en la infección primaria, incluida la entrada viral, la administración del genoma, la expresión génica lítica y la producción de progenie. La infección se sincroniza mediante espinoculación y se monitorea temporalmente. La producción de virus se cuantifica mediante un sistema de lectura dual que comprende ensayos de unidades infecciosas (UI) basados en proteínas de fluorescencia verde (GFP) y qPCR de ADN viral encapsulado. Estos enfoques permiten un análisis detallado de la cinética de replicación viral. Si bien el protocolo actual se centra en la detección de eventos en etapa tardía, el sistema es adaptable para estudiar las primeras fases de la infección a través de puntos de tiempo de muestreo modificados. Al ofrecer una plataforma reproducible y escalable para una infección productiva de novo , este sistema aborda una brecha metodológica en la investigación de KSHV y respalda estudios mecanicistas de la interacción herpesvirus-huésped y estrategias antivirales.
Introducción
El herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV) es un gammaherpesvirus humano etiológicamente relacionado con el sarcoma de Kaposi (SK), el linfoma de derrame primario (PEL), la enfermedad de Castleman multicéntrica (MCD) y el síndrome de citoquinas inflamatorias KSHV 1,2. Como todos los herpesvirus, KSHV establece una persistencia de por vida en el huésped, alternando entre fases latentes y líticas. Si bien la latencia predomina en la mayoría de las células infectadas, un subconjunto puede ingresar al ciclo lítico durante la infección primaria (de novo) o mediante la reactivación de la latencia3. La replicación lítica implica una cascada ordenada de expresión génica viral, que culmina en la replicación del genoma, el ensamblaje del virión y la liberación de la progenie. Este proceso es crítico para la diseminación viral y la progresión de la enfermedad 4,5. Los primeros estudios de la replicación lítica de KSHV a menudo se basaban en la expresión ectópica de genes virales individuales en sistemas heterólogos. Aunque informativos, estos enfoques no capturaron la regulación génica coordinada y la interacción virus-huésped presente durante la infección auténtica. El desarrollo de BAC-16, un cromosoma artificial bacteriano (BAC) recombinante que lleva el genoma completo de KSHV, permitió la producción de virus genéticamente manipulables que conservan la competencia para la replicación y la producción de viriones infecciosos6. Este sistema facilita la mutagénesis dirigida y el análisis funcional de genes virales en el contexto del genoma completo. Desde entonces, los modelos de reactivación que emplean células iSLK o BCBL-1 infectadas latentemente con BAC-16 o KSHV se han convertido en estándar para estudiar la replicación lítica de KSHV. Estos sistemas permiten la inducción sincronizada del ciclo lítico utilizando agentes como la doxiciclina (Dox) y el butirato de sodio 7,8. Sin embargo, debido a que los modelos de reactivación eluden los pasos tempranos de la infección, incluida la entrada viral, el tráfico intracelular y la decisión inicial entre la latencia y la replicación lítica, no pueden recapitular completamente la dinámica de la infección primaria.
Los modelos de infección de novo ofrecen un marco complementario para abordar estas brechas. Se ha demostrado que varios modelos celulares primarios, como las células epiteliales endoteliales y gingivales humanas, apoyan la replicación lítica después de la infección de novo por KSHV 3,9,10,11. Sin embargo, su vida útil limitada, su alto costo y su poca susceptibilidad a la manipulación genética restringen su reproducibilidad y escalabilidad para estudios mecanicistas. En este protocolo, describimos un modelo manejable y escalable de infección lítica de novo por KSHV utilizando la línea celular de carcinoma colorrectal humano HCT 116. Si bien no son un objetivo natural de KSHV, las células HCT116 exhiben una sólida permisividad a la infección y proporcionan una plataforma estable y rentable adecuada para estudios mecanicistas y aplicaciones de alto rendimiento. Dada la limitada capacidad de formación de placa de KSHV en cultivo, utilizamos el sistema BAC16 que incorpora un reportero de GFP para generar virus libres de células para la infección. Esto permite la visualización directa de las células infectadas y la cuantificación de los títulos infecciosos a través de ensayos de unidades infecciosas (UI) basados en GFP12. Para complementar esto, el ADN asociado al virión se mide mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) después del tratamiento con ADNasa, lo que ofrece un método sensible para detectar genomas virales encapsulados. Juntos, estos ensayos permiten un análisis cuantitativo resuelto temporalmente de la dinámica de replicación lítica durante la infección primaria.
Este protocolo proporciona una plataforma confiable y flexible para modelar la infección lítica de novo por KSHV in vitro, facilitando la disección de eventos tempranos en el ciclo de vida viral, lo que permite la evaluación de la función génica y la actividad antiviral.
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Protocolo
KSHV está clasificado como patógeno humano de nivel 2 de bioseguridad (BSL-2). Realice todos los procedimientos que involucren material infeccioso en un gabinete de bioseguridad certificado BSL-2. Descontamine las superficies de trabajo con etanol al 70% antes y después de cada procedimiento. Deseche todos los desechos de acuerdo con las regulaciones institucionales de bioseguridad y las pautas BSL-2 de la OMS. En la Figura 1 se proporciona una descripción general esquemática del flujo de trabajo completo. El procedimiento incluye la generación de KSHV derivado de BAC16 libre a partir de células iSLK reactivadas, infección de novo de células HCT 116, cuantificación de títulos de virus mediante ensayo de unidad infecciosa (UI) y análisis de qPCR de ADN viral asociado a viriones. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Producción de KSHV derivado de BAC16 libre de células
- Siembre cinco matraces T75 de células iSLK inducibles por Dox que albergan KSHV BAC 16 de tipo ancho (WT) (iSLK-BAC16) a aproximadamente un 80% de confluencia. Incubar a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2 durante 24 h.
- Induzca la reactivación lítica agregando 1 μg/mL de Dox y 1 mM de butirato de sodio a cada matraz. Continuar incubación durante 72-96 h.
- Monitorizar las células diariamente mediante microscopía de contraste de fase. Recoja el sobrenadante una vez >90% de las células exhiban redondeo, desprendimiento de la superficie del matraz y / o lisis visible, características del efecto citopático (CPE) indicativas de una reacción lítica robusta. Después de la recolección de sobrenadante, descontamine y deseche las células iSLK-BAC16 inducidas líticamente con lejía al 10%.
- Centrifugar los sobrenadantes recolectados a 1.500 x g durante 10 min a 4 °C para eliminar los residuos. Filtre el sobrenadante clarificado a través de un filtro de membrana de polietersulfona (PES) de 0,45 μm sin alterar el sedimento.
- Transfiera los sobrenadantes filtrados a tubos de ultracentrífuga. Granular las partículas virales por centrifugación a 25.000 x g durante 3 h a 4 °C utilizando un rotor SW28.
- Deseche con cuidado el sobrenadante en lejía al 10%. Vuelva a suspender el gránulo viral en 1 ml de medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco sin suero.
- Alícuota el virus resuspendido en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 ml con tapón de rosca. Almacenar las alícuotas a -80 °C hasta su uso. Determine los títulos infecciosos de la población de virus utilizando ensayos de unidades infecciosas (UI) basados en GFP en células SLK (consulte el paso 3).
2. Infección de novo de células HCT116
NOTA: Una alta multiplicidad de infección (MOI) es fundamental para iniciar de manera eficiente la replicación lítica en células HCT116 después de una infección de novo por KSHV. Esta condición permite una expresión génica viral robusta y una replicación productiva sin necesidad de estímulos exógenos. En la Figura complementaria 1A se proporciona un resultado representativo que demuestra el efecto dependiente del MOI sobre la producción de viriones.
- Siembre 1 x 105 células HCT116 por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos. Incubar durante 24 h a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 .
- Diluir el stock concentrado de virus en DMEM precalentado y sin suero hasta un volumen final de 250 μL para lograr una multiplicidad de infección (MOI) de 10.
- Aspirar el medio de cultivo de cada pocillo. Agregue 250 μL de virus diluido directamente a las células.
- Centrifugar la placa a 1.500 x g durante 1 h a 30 °C para sincronizar la infección (espinoculación). Transfiera inmediatamente la placa a una incubadora a 37 °C y continúe la incubación durante 1 h más.
- Aspire el inóculo y lave las células tres veces con PBS precalentado para eliminar el virus residual. Agregue 1 ml de DMEM completo a cada pocillo.
- Monitorizar la expresión de GFP en células infectadas mediante microscopía de fluorescencia a las 36 h, 60 h y 96 h después de la infección. En cada momento, recoja 1 ml de sobrenadante de cultivo de cada pocillo.
NOTA: Después de la recolección de sobrenadante, las células HCT116 infectadas con KSHV se pueden retener para aplicaciones posteriores como extracción de ARN, análisis de proteínas, inmunofluorescencia o citometría de flujo, según objetivos experimentales. - Centrifugar los sobrenadantes recolectados a 1.500 x g durante 10 min a 4 °C para eliminar los restos celulares. Transfiera los sobrenadantes clarificados a tubos nuevos. Congele rápidamente en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 °C para su posterior análisis.
3. Ensayo de unidades infecciosas (ensayo IU)
NOTA: Las células SLK son permisivas a la entrada de KSHV y apoyan la expresión génica lítica temprana. Este ensayo cuantifica las unidades infecciosas en función de la expresión de GFP en células SLK infectadas después de la exposición a sobrenadantes que contienen virus diluidos en serie.
- Siembre 1 x 104 células SLK por pocillo en una placa de 96 pocillos 24 h antes de la infección. Asegúrese de que las células se distribuyan uniformemente y alcancen una confluencia de ~60%-70% el día de la infección.
- Etiquete nueve tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para diluciones dobles en serie: Tubo 1 (sin diluir, 1:1), Tubo 2 (1:2), Tubo 3 (1:4), Tubo 4 (1:8), Tubo 5 (1:16), Tubo 6 (1:32), Tubo 7 (1:64), Tubo 8 (1:128) y Tubo 9 (1:256).
- Agregue 200 μL de sobrenadante de virus al tubo 1. Agregue 100 μL de DMEM precalentado y sin suero a cada uno de los tubos 2 a 9. Para comenzar la serie de dilución, transfiera 100 μl del tubo 1 al tubo 2 y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, transfiera 100 μl del tubo 2 al tubo 3 y repita este proceso secuencialmente a través del tubo 9, mezclando bien en cada paso.
NOTA: Cada tubo debe contener un volumen final de 100 μL. Realice todas las diluciones por triplicado. - Aspirar el medio de cultivo a partir de células SLK. Agregue 100 μL de cada dilución de virus a los pocillos designados. Utilice 27 pocillos en total (3 pocillos por dilución de 1:1 a 1:256).
- Centrifugar la placa de 96 pocillos a 1.500 x g durante 1 h a 30 °C para favorecer la adsorción del vial. Transfiera la placa a una incubadora de CO2 a 37 °C durante 1 h más.
- Retire el inóculo y agregue suavemente 100 μL de DMEM completo a cada pocillo. Incubar la placa durante 24 h a 37 °C.
- Recolecte las células y analice la expresión de GFP mediante citometría de flujo. Registre el número de células positivas para GFP por pocillo.
- Calcule las unidades infecciosas por ml (UI/ml) utilizando la siguiente fórmula13:
UI/ml = [(número de células positivas para GFP por pocillo)/volumen de inóculo (ml)] x factor de dilución. Determinar el título final del virus utilizando la última dilución con células detectables positivas para GFP
4. Cuantificación de genomas virales encapsulados por qPCR
- Agregue DNasa I a una concentración final de 100 U/ml a 400 μl de sobrenadante clarificado (consulte el paso 1 para la clarificación del sobrenadante y la eliminación de desechos). Incubar durante 15 min a 37 °C para digerir los ADN virales y celulares no encapsulados. En la Figura complementaria 1B se muestra un resultado representativo que demuestra la especificidad y eficacia del tratamiento con ADNasa.
- Agregue EDTA a una concentración final de 50 mM para detener la reacción de la ADNasa. Incubar a 75 °C durante 15 min para inactivar la ADNasa I.
- Extraiga el ADN viral del sobrenadante tratado con ADNasa utilizando el DNA Mini Kit de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Eluir el ADN viral en 30 μL de tampón de elución. Utilice 5 μL de ADN eluido para cada reacción de qPCR.
- Amplíe el marco de lectura abierto KSHV 73 (ORF 73) utilizando los siguientes cebadores: Adelante: 5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'; Reverso: 5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3.
- Prepare reacciones de qPCR por triplicado utilizando SYBR Green Master SuperMix. Configure las condiciones de ciclo de la siguiente manera: Desnaturalización inicial: 95 °C durante 3 min; Amplificación: 40 ciclos de 95 °C durante 10 s, 52 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s; Análisis de la curva de fusión: rampa estándar para la especificidad del amplicón.
- Genere una curva estándar utilizando diluciones en serie de 10 veces de ADN viral derivado de BAC-16, que van de 109 a 101 copias por reacción. Grafique los valores de Ct contra el logaritmo10 del número de copias de entrada para evaluar la linealidad del ensayo. En la Figura complementaria 1C se muestra una curva estándar representativa.
- Determine el número de copias del genoma viral comparando los valores de Ct con la curva estándar. Normalizar e informar los resultados como copias de ADN viral por ml de sobrenadante.
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Resultados
Para cuantificar el título de virus infecciosos, los sobrenadantes recolectados 72 h después de la reactivación lítica de las células iSLK-BAC16 se sometieron a una dilución en serie doble y se utilizaron para infectar las células SLK. El número de células SLK positivas para GFP en cada dilución se muestra en la Figura 2A, y las unidades infecciosas (UI) correspondientes por ml se calcularon y presentaron en
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Discusión
El modelado de la infección lítica de novo de KSHV se ha visto obstaculizado durante mucho tiempo por la fuerte propensión del virus a establecer latencia en la mayoría de los tipos de células permisivas. Aunque se ha demostrado que ciertas células primarias, como las células epiteliales endoteliales y orales, apoyan la replicación lítica después de una infección de novo 9,10, su vida útil limitada, su alto cost...
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Divulgaciones
No se declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer al Dr. Jae U. Jung (Cleveland Clinic) por compartir la línea celular iSLK-BAC16 que produce KSHV recombinante. El diseño gráfico se creó utilizando BioRender.com, para lo cual los autores poseen una licencia. Este trabajo fue apoyado por los premios NIH R21 DE028256, R01 CA140964 y R01 CA262631 a C. Liang (PI), el Premio Postdoctoral del Acelerador de Ciencias Wistar a Q. Zhu.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.45 µ m filtro de polietersulfoma (PES) | VWR | 76479-020 | |
| Biorender | Biorender | N/A | El diseño gráfico fue creado con BioRender.com, para lo cual los autores poseen una licencia |
| CFX Opus 96 Sistema de PCR en tiempo real | Bio-Rad | 184-5072 | |
| DMEM completo | El medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Sigma-Aldrich) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% (v/v); Gibco), L-glutamina 2 mM (Gibco) y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep; GenClone). | ||
| ADNasa I | Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra | M0303S | |
| doxiciclina | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| Citómetro de flujo LSR II 18 | BD Biociencia | N/A | |
| PerfeCTa SYBR Green Master SuperMix | Quantabio | 95054-02K | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 56304 | |
| butirato de sodio (NaB) | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Termo Fisher | 15575020 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
