Artículo de método

Evaluación de la hiperemia reactiva postoclusiva en la piel de la pata de rata mediante imágenes de contraste de manchas con láser

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DOI:

10.3791/68986

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3 de octubre de 2025

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1V.A. Negovsky Research Institute of General Reanimatology, Federal Research and Clinical Center of Intensive Care Medicine and Rehabilitology, 2Research and Development Center of Biomedical Photonics, Orel State University, 3College of Engineering and Physical Sciences, Aston University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta un método para evaluar los parámetros de hiperemia reactiva postoclusiva en la piel de una rata anestesiada utilizando imágenes de contraste de manchas láser y medición invasiva de la presión arterial.

Resumen

La imagen de contraste de manchas láser (LSCI) es una técnica moderna y no invasiva para evaluar la perfusión microvascular en humanos y animales de laboratorio. La combinación de LSCI con medición invasiva de la presión arterial (PA) y una prueba de oclusión vascular permite el estudio de la hiperemia reactiva postoclusiva (PORH), proporcionando una evaluación de la reserva de flujo sanguíneo microvascular y la reactividad vascular. Este artículo demuestra la técnica de usar el LSCI para registrar y visualizar PORH en la pata trasera de una rata bajo anestesia general. Se infla un manguito neumático especial para crear una oclusión vascular temporal (180 s) a nivel de la tibia. La evaluación de la PORH posterior (hiperemia máxima e índices cinéticos) puede proporcionar información adicional sobre los mecanismos y la gravedad del proceso patológico en estudio (shock circulatorio, insuficiencia cardíaca, hipertensión, etc.) o identificar efectos vasculares de un nuevo fármaco que no son evidentes al evaluar la perfusión en reposo. La monitorización invasiva de la PA permite el cálculo de la conductancia vascular cutánea y la consideración de los cambios en la hemodinámica sistémica, lo que es particularmente importante en modelos experimentales de enfermedades críticas. También se demostrará el uso de este enfoque para identificar la disfunción microvascular en un modelo de rata de shock hemorrágico.

Introducción

La disfunción microvascular está involucrada en la patogénesis de muchas enfermedades cardiovasculares, endocrinas y otras, comprometiendo la perfusión y oxigenación de los tejidos, y alterando los mecanismos reguladores vasomotores de la hemodinámica sistémica (por ejemplo, en la hipertensión)1. Los trastornos de la microcirculación también tienen una gran importancia fisiopatológica en los mecanismos de disfunción orgánica en pacientes críticos con traumatismos, sepsis y diversos tipos de shock (hemorrágico, séptico, cardiogénico, etc.)2.

Actualmente, se utilizan varios métodos basados en láser en estudios clínicos y preclínicos para la evaluación no invasiva de la perfusión tisular y la función microvascular: Flujometría Doppler Láser (LDF), Imágenes Doppler Láser (LDI/LDPI) e Imágenes de Contraste Speckle Láser (LSCI). Entre ellos, LSCI es el más prometedor para la evaluación no invasiva de la perfusión cutánea en la clínica. Tiene claras ventajas sobre LDF y LDI/LDPI, ya que el método es fácil de poner en práctica y ofrece visualización de toda el área de investigación con alta resolución espacial y temporal3. LSCI es una técnica que utiliza luz láser para crear patrones de manchas, que luego se analizan para visualizar la dinámica del flujo sanguíneo. Se proporcionan evaluaciones de microcirculación en tiempo real y de alta resolución, que son esenciales para diversas áreas de investigación, como neurociencia4, cirugía abdominal5, dermatología6 y otros estudios de investigación vascular 7,8, tanto en entornos clínicos como experimentales.

Una simple evaluación de los valores de perfusión cutánea en reposo a menudo no es informativa para identificar trastornos microvasculares. Esto se debe tanto a las características funcionales intrínsecas de la circulación cutánea (alta variabilidad, dependencia de la temperatura, el estrés y otros factores) como a la perfusión tisular "falsamente normal" durante la respuesta compensatoria del cuerpo (por ejemplo, un aumento del gasto cardíaco en las primeras etapas del shock séptico). El uso adicional de la carga funcional estándar permite una mejor evaluación de la microcirculación y la identificación de la disfunción microvascular oculta en condiciones de reposo1. También se sabe que LSCI es útil en la evaluación de la microcirculación cutánea bajo estímulos farmacológicos9.

La combinación de LSCI con una prueba de oclusión vascular permite una evaluación no invasiva del fenómeno de hiperemia reactiva postoclusiva (PORH), que refleja importantes parámetros funcionales de la microcirculación, en particular la reserva de flujo sanguíneo y la reactividad de la microvasculatura10. Este enfoque se usa ampliamente en estudios clínicos para identificar anomalías microcirculatorias funcionales que no son evidentes en las mediciones de perfusión basales11, pero la evaluación de PORH es rara en estudios preclínicos con animales12,13. En comparación con los estudios clínicos, el uso de una prueba de oclusión vascular en un experimento in vivo brinda al investigador oportunidades adicionales para evaluar los mecanismos de PORH, la patogénesis de enfermedades graves y la farmacodinámica de los fármacos vasoactivos. Por supuesto, estas oportunidades deben estar dentro de los límites de los estándares bioéticos modernos para el trato humano de los animales.

Este protocolo presenta un método para evaluar los parámetros de PORH en la piel de una rata anestesiada utilizando LSCI y medición invasiva de la presión arterial. Este último implica el cateterismo de la arteria carótida de la rata y permite medir la presión arterial media (PAM) y la frecuencia del pulso. Además, se pueden recolectar muestras de sangre arterial para pruebas de laboratorio (por ejemplo, análisis de gases en sangre arterial). Vale la pena señalar que este protocolo está orientado principalmente a un experimento agudo que no implica despertar al animal de la anestesia después de completar los procedimientos experimentales (por ejemplo, modelar una enfermedad crítica). El método que proponemos para evaluar la microcirculación en ratas es relativamente simple y será particularmente útil en estudios de fisiología vascular y fisiopatología comparativa, incluida la evaluación de la disfunción endotelial, así como en pruebas preclínicas de nuevos fármacos vasoactivos.

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Protocolo

Los procedimientos que se describen a continuación se realizaron como parte de un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Ética del Centro Federal de Investigación y Clínica de Medicina de Cuidados Intensivos y Rehabilitación.

1. Preparación del manguito neumático para la oclusión vascular

  1. Use un manguito neumático de un sistema de medición de presión arterial no invasivo (NIBP) para ratas para crear una oclusión vascular transitoria en la pata trasera de una rata.
  2. Conecte el manguito al manómetro aneroide y a la bomba de goma de un tonómetro mecánico convencional para medir la presión arterial en humanos. Utilice tres segmentos de tubo de plástico transparente de 3 mm (1 m de los cuales se incluye en el sistema NIBP) y un conector en T del tamaño adecuado (Figura 1).
  3. Verifique la funcionalidad y estanqueidad del sistema neumático ensamblado antes de usarlo en un animal. Confirme que la presión del manguito se mantenga a 200-220 mmHg durante varios minutos cuando esté inflado.

2. Preparación de catéter arterial, estación de trabajo e instrumentos quirúrgicos

  1. Trate el área de trabajo con alcohol al 70%. Cubra la mesa de operaciones con un paño estéril. Esterilizar catéteres e instrumentos con gas (en procedimientos de supervivencia y experimentos crónicos).
  2. Para el cateterismo de la arteria carótida, use un catéter PE-50 (DE 0,9 mm, DI 0,6 mm) de 12 cm de largo con un anillo de bloqueo a 25 mm del extremo. Para prevenir la perforación arterial, use un catéter con bordes lisos.
  3. Coloque una aguja roma de 22 G y una jeringa de 2 ml llena de solución salina heparinizada (5 UI de heparina/1 ml) en el extremo externo del catéter. Enjuague el catéter con solución salina heparinizada (0,1-0,2 ml) para asegurar la permeabilidad y prevenir la formación de coágulos.

3. Anestesia y manejo preoperatorio

NOTA: Todos los agentes anestésicos pueden deprimir la respiración y la circulación. La dosificación adecuada basada en la especie animal, la cepa, la edad y el estado de salud es fundamental para evitar una sobredosis fatal. El personal debe estar capacitado en anestesia animal y monitoreo de signos vitales. Los procedimientos deben ser aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) correspondiente u organismo de ética equivalente. Se debe tener precaución al manipular agujas, bisturíes y otros instrumentos afilados. Utilice siempre un recipiente para objetos punzantes para su eliminación inmediata. Nunca vuelva a tapar las agujas. Tenga en cuenta el riesgo de lesiones por pinchazos de agujas, que pueden transmitir agentes zoonóticos o causar traumatismos físicos.

  1. Anestesiar a la rata mediante una inyección intraperitoneal (IP) de una mezcla de solución salina de tiletamina (10 mg/kg) + zolazepam (10 mg/kg) al 2% en solución salina y xilacina (5 mg/kg) al 0,5% en solución salina. Asegúrese de que la anestesia sea adecuada comprobando la ausencia de reflejos (pellizco de los dedos de los pies).
  2. Afeitar el pelaje de las áreas anterior y posterior del cuello (incluida la región interescapular). Trate la piel en estas áreas con un antiséptico para la piel (alcohol al 70%). Coloque al animal en posición supina sobre una mesa quirúrgica con calefacción.
  3. Controle el estado del animal anestesiado evaluando regularmente la profundidad de la anestesia (movimientos espontáneos, respuesta a estímulos dolorosos), el patrón respiratorio (frecuencia, profundidad, ritmo, sibilancias), el color de la piel y las membranas mucosas. Use inyecciones adicionales de tiletamina + zolazepam 10 mg / kg IP según sea necesario.
  4. Evite una hipotermia significativa manteniendo la temperatura rectal del animal a 36,5-37,0 °C utilizando una mesa calefactora y mantas aislantes.

4. Cateterismo de la arteria carótida izquierda

  1. Hacer una incisión cutánea de 2 cm en la línea media en la superficie ventral del cuello. Con un hemostático y fórceps, diseccionar longitudinalmente los músculos y la fascia del cuello para exponer la arteria carótida izquierda y aislar una sección de 5-7 mm del vaso. Separe cuidadosamente el nervio vago de la arteria carótida, evitando lesionarla.
  2. Con una sutura de seda 4-0, coloque una corbata suelta en la parte caudal de la arteria y lime el extremo craneal del vaso. Use las mandíbulas de las pinzas microquirúrgicas colocadas debajo de la arteria para estirarla suavemente y evitar el sangrado después de la incisión.
  3. Con unas tijeras microquirúrgicas en ángulo de 45° cranealmente, haga una incisión transversal en la arteria entre las dos ligaduras (a una profundidad no mayor a la mitad del diámetro del vaso).
  4. Después de hacer una pequeña incisión en la arteria, inserte el catéter hacia el corazón hasta el anillo de fijación con la ayuda de fórceps. Mientras sostiene el catéter en la luz del vaso, apriete la ligadura caudal y haga nudos adicionales por encima del anillo de fijación del catéter.
  5. Verifique la permeabilidad del catéter aspirando una pequeña cantidad de sangre en una jeringa y enjuague el catéter nuevamente. Sujete el catéter con un portaagujas liso a 2-3 cm del anillo de fijación. Retire la aguja roma y la jeringa del catéter.
  6. Gire con cuidado a la rata en posición boca abajo. Haga una incisión cutánea de 0,5-1,0 cm en la línea media entre las escápulas con unas tijeras quirúrgicas. Tuneliza la pinza hemostática por vía subcutánea a través de la incisión dorsal hacia la ventral. Sujete el extremo exterior del catéter y, pasándolo con cuidado a través del túnel subcutáneo, llévelo a la región interescapular.
  7. Inserte una aguja roma con una jeringa de 2 ml conectada al extremo exterior del catéter.
  8. Cerrar las heridas quirúrgicas ventrales y dorsales con una aguja atraumática y sutura monofilamento 4-0.

5. Medición invasiva de la presión arterial

  1. Llene el transductor calibrado del sistema de medición de PA invasivo con solución salina heparinizada (5 UI de heparina/1 ml).
  2. Coloque al animal en posición ventral. Desconecte la jeringa de 2 ml de la aguja roma y conecte el catéter al transductor (Figura 2). Retire la pinza del catéter y enjuague la línea de presión arterial con 0.1-0.2 ml de solución salina heparinizada.
  3. Utilice un sistema de adquisición de datos para medir y registrar la presión arterial y la frecuencia cardíaca. Una pulsación bien definida en la forma de onda de la presión arterial (amplitud de 10-15 mm Hg y superior) indica la permeabilidad y el posicionamiento correcto del catéter.
    NOTA: Para medir con precisión la presión arterial, el transductor debe colocarse al nivel del corazón del animal. Si aparecen burbujas de aire en la línea de medición de la PA, retírelas para evitar la embolia gaseosa de los órganos internos.
  4. Estabilice al animal anestesiado durante 15-20 minutos antes de medir la presión arterial media (PAM) y otras variables fisiológicas de referencia.
  5. Abra la aplicación de software de adquisición de datos. En el menú Archivo , seleccione Nuevo.
  6. Asegúrese de que se seleccione la entrada física correcta (por ejemplo, Entrada 1). Haga clic en la flecha del menú desplegable en el encabezado del canal correspondiente (por ejemplo, Canal 1) y seleccione Configuración del canal.
  7. En el cuadro de diálogo, ajuste el rango de voltaje (±100 mV) para acomodar la señal esperada. Establezca las unidades de visualización en mmHg.
  8. Ajustar frecuencia de muestreo: Haga clic en el botón Frecuencia de muestreo en la barra de herramientas. Para la PA invasiva, establezca la frecuencia de muestreo en 200 Hz (200 muestras/segundo). Si los objetivos del estudio incluyen el análisis de la morfología de las ondas de pulso, aumente la frecuencia de muestreo a 1 kHz.
  9. Haga clic en el botón Inicio para comenzar a registrar los datos experimentales.
  10. Una vez que se haya capturado el segmento de datos deseado, haga clic en el botón Detener . Guarde el archivo de datos a través de Archivo | Guardar como... Dale un nombre de archivo único.

6. Medición de la perfusión cutánea mediante LSCI

  1. Limpie la superficie plantar de la pata trasera de la rata con una gasa empapada en agua para limpiar la piel.
    NOTA: No use alcohol u otras soluciones que puedan causar hiperemia de la piel.
  2. Coloque el manguito neumático en la pata trasera de la rata al nivel de la tibia y el músculo gastrocnemio.
    NOTA: Tenga cuidado al insertar los dedos y el tobillo a través de la luz del manguito para evitar dañar la membrana inflable y comprimir los tejidos blandos de la rodilla.
  3. Coloque la pata de la rata en un trozo de gasa y, además, asegure los dedos de los pies con una tira de cinta adhesiva para minimizar los artefactos de movimiento (Figura 2).
  4. Prepare el hardware y el software de adquisición de datos para registrar la perfusión cutánea utilizando el método LSCI.
    NOTA: En el trabajo presentado, el hardware consiste en una cámara monocromática de infrarrojo cercano (NIR) de alta velocidad, un objetivo de cámara, un polarizador lineal NIR y una fuente láser con el conjunto de difusores. El software consiste en una herramienta de grabación de video que captura fotogramas a una velocidad de fotogramas específica (90 fotogramas por segundo) y un tiempo de exposición (11 ms). Las dimensiones reales del área que es el campo de visión de la cámara son 16 x 16 mm.
  5. Asegúrese de que el área de interés (tarso y metatarso) esté en el punto focal del objetivo de la cámara.
  6. Ajuste la fuente láser para que la iluminación sea uniforme y no excesiva en toda el área de interés.
  7. Ajuste el polarizador lineal para minimizar la reflexión especular del objeto medido.
  8. Asegúrese de que los parámetros de una herramienta de grabación de video estén configurados correctamente, luego haga clic en el botón Capturar para grabar imágenes monocromáticas sin procesar durante 30 segundos (la grabación de línea de base, podría ser más o menos). Utilice las imágenes para calcular los valores de perfusión moteada (consulte la fórmula (2) a continuación).
    NOTA: En este estudio, se utilizó una configuración experimental especialmente desarrollada, pero cualquier dispositivo disponible comercialmente que implemente el método LSCI se puede utilizar para realizar mediciones de acuerdo con este protocolo. Se recomienda realizar mediciones LSCI en una habitación oscura para minimizar la influencia de la iluminación externa en los resultados obtenidos.

7. Prueba de oclusión vascular y evaluación de PORH

  1. Cierre la válvula de alivio de la bomba de goma.
  2. Después de capturar la perfusión cutánea basal (en reposo), infle rápidamente el manguito neumático en la extremidad del animal a una presión mayor que la presión arterial sistólica del animal (generalmente 200-220 mmHg para ocluir de manera confiable el flujo sanguíneo arterial y venoso sin causar lesiones en las extremidades).
  3. Continuar registrando la señal LSCI de la piel durante 180 s (30-300 s dependiendo de los objetivos del estudio) para confirmar la oclusión vascular y posteriormente determinar el "cero biológico" de la perfusión moteada.
  4. Desinfle rápidamente el manguito después de alcanzar el tiempo de oclusión objetivo y continúe registrando la señal LSCI de la piel durante otros 180 s (podría ser más o menos) para registrar la dinámica de PORH.
  5. Registre la forma de onda de presión arterial invasiva simultáneamente con la evaluación de la perfusión cutánea antes, durante y después de la oclusión vascular. Utilice estos datos para calcular la PAM y la conductancia vascular cutánea (ver más abajo).
  6. Obtener valores de Speckle Perfusion utilizando un algoritmo escrito en un entorno de software. El primer paso es transformar imágenes monocromáticas sin procesar en imágenes de contraste moteado. Calcule el contraste de moteado promedio usando la fórmula (1):
    figure-protocol-1    (1)
    Donde Intensidad es la intensidad de cada píxel en un momento dado.
    NOTA: El número de imágenes sobre las que se calcula el contraste podría influir en gran medida en el resultado del procesamiento. En este estudio, se utilizó un algoritmo LSCI temporal que promedia más de 90 imágenes.
  7. Convierta los valores de Contraste moteado en valores de Perfusión moteada usando la fórmula (2):
    figure-protocol-2  (2)
  8. Seleccione una región rectangular que incluya el área de interés (tarso y metatarso) para promediar los valores de Perfusión de manchas (dentro de esta región rectangular). Utilice la evolución temporal (gráfico) de la perfusión moteada obtenida por dicho procedimiento para el cálculo posterior de los parámetros estudiados.
  9. Con base en los valores de perfusión de la piel medidos, calcule los principales parámetros de PORH ( Figura 3).
  10. Calcule la conductancia vascular cutánea (CVC) usando la fórmula (3):
    figure-protocol-3   (3)
    Donde LSCIrest es el valor promedio de la perfusión de manchas de la piel registrada al inicio del estudio (unidades arbitrarias = AU); La PAM es la presión arterial media (mmHg) registrada durante el mismo período de tiempo.
  11. Calcule la conductancia vascular cutánea máxima (CVCmax) utilizando la fórmula (3) y sustituyendo los valores apropiados para hiperemia máxima (LSCImax) y MAP.

8. Procedimientos experimentales y mediciones repetidas

  1. Después de registrar la perfusión cutánea, PORH y otras variables fisiológicas de interés al inicio del estudio, realice la intervención experimental de acuerdo con el protocolo de estudio aprobado (por ejemplo, modelado del proceso patológico y/o administración de un fármaco vasoactivo).
  2. Reevaluar PORH y otras variables fisiológicas en el siguiente punto de tiempo de estudio después del desarrollo del proceso patológico simulado o el logro del efecto del fármaco administrado.

9. Fin del experimento

  1. Al finalizar el experimento agudo, eutanasia a la rata mediante inyección intraarterial de lidocaína al 2% (2 ml) bajo anestesia general profunda (tiletamina + zolazepam y xilacina). Dependiendo de las leyes y protocolos locales, use un método alternativo de eutanasia humanitaria para roedores de laboratorio que haya sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).
    NOTA: Para los procedimientos de supervivencia y la recuperación planificada del animal de la anestesia, proporcione la atención adecuada y la evaluación periódica de la condición del animal, incluida la prevención de la hipotermia y la analgesia postoperatoria adecuada (p. ej., ketoprofeno 5-10 mg / kg IM).

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Resultados

El método descrito anteriormente para evaluar la función microvascular fue aplicado por nosotros en una serie de experimentos con modelos de shock hemorrágico (pérdida de sangre del 35% del volumen sanguíneo calculado) en ratas macho Wistar que pesaban 250-300 g. En el grupo de animales con hemorragia (HS, n = 13), la evaluación de los parámetros de PORH con monitoreo simultáneo de la PA invasiva se realizó 30 min después de la finalización de la hemorragia. En el grupo de control de anim...

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Discusión

Aquí describimos una tecnología modernizada para evaluar la microcirculación cutánea y la reactividad vascular en un experimento in vivo en roedores. Para un uso exitoso y estandarizado de este método en estudios fisiológicos y farmacológicos, se deben tener en cuenta varias consideraciones adicionales. En el protocolo anterior, las ratas son anestesiadas con una combinación de tiletamina + zolazepam + xilacina, que está dictada principalmente por los estándares locales para trabajar con...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Rusa para la Ciencia en el marco del Proyecto 24-25-00310.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aguja atraumática con nailon de sutura quirúrgica, 4C-0,5x16-4/0-NMedtekhnika, RusiaN/AAzul. Longitud 75 cm. USP 4/0 (MP1.5). Para suturar una herida quirúrgica
Catéter para arteria carótida de rata con aguja de jeringa roma 22 GSciCat, Rusia N/APE-50, longitud 12 cm, OD=0,9 mm, DI= 0,6 mm.Con un anillo de fijación
Transductor de presión desechable DeltranUtah Medical Products, EE. UU.6069Cable de 12"
Llave de paso de 3 vías DiscofixC para terapia de infusión y monitorizaciónB. Braun, Alemania 16494C
HeparinaBelmedpreparaty, Bielorrusia N/AHeparina sódica 5000 UI/ml, ampollas 5 mL
LidocaínaVelpharm, RusiaN/ASolución inyectable 20 mg/ml, ampollas 2 ml
Manguito neumático "Systole"Neurobotics, RusiaN/AParte de la medición no invasiva de la presión arterial para roedores. Tipo cola de 5-10 mm (ratas)
Cloruro de sodioPharmasyntez, Rusia N/ASolución para perfusión al 0,9%, 250 mL
Software LabChart8 ADInstruments, AustraliaN/AVersión 8.1.13
Software MATLAB The MathWorks Inc., EE. UU.N/A Versión R2019b
Jeringa estéril de un solo uso, 1 ml, 3 partesCiudad de Huaian Hengchun Medical Product Co. Ltd., ChinaN/A Aguja de 27 G
Jeringa estéril de un solo uso, 2 (2,5) ml, 3 partesVogt Medical Vertrieb GmbH, Alemania1310524Aguja de 23 G
Sutura SILK-SPolytechmed, Rusia N/ANo absorbible, trenzado, hecho de seda natural con un revestimiento de silicona, negro en cassette. USP 4/0 (MP1.5). Longitud 100 m. Para ligar vasos
XylaInterchemie, Países BajosN/A Xilacina 20 mg/ml, 50 ml
Zoletil 100Virbac, Francia N/A Tiletamina HCl 50 mg/ml, zolazepam HCl 50 mg/ml, 5 ml

Referencias

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