Estudio experimental sobre la muscona que reduce la actividad de la vía NF-κB al dirigirse a IL-1R1 para atenuar la lesión por estrés oxidativo en las células de Schwann

Resumen

Este artículo estudia el efecto de la muscona, el principal componente del almizcle, sobre la proliferación y apoptosis de las células de Schwann. Los resultados ilustran preliminarmente el mecanismo potencial del almizcle que reduce la actividad de la vía NF-κB al inhibir IL-1R1 para atenuar la lesión por estrés oxidativo en la parálisis de Bell.

Resumen

El mecanismo subyacente de cómo el almizcle natural trata la parálisis de Bell no está claro. Este estudio tiene como objetivo revelar el mecanismo potencial del almizcle en el tratamiento de la lesión de los nervios periféricos in vitro. Para lograr esto, se estableció un modelo de lesión por estrés oxidativo en células de Schwann (SC) utilizando cloruro de cobalto (CoCl₂). Para evaluar los efectos protectores de Muscone (Mus) sobre esta lesión y explorar su mecanismo, se emplearon ensayos de viabilidad celular, transfección de ARNip, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR), western blotting, tinción de inmunofluorescencia y análisis ultraestructural de células. Como resultado, se indica que la intervención de Mus mejoró la proliferación de SC y el ARNm de S-100b bajo hipoxia, al tiempo que redujo las especies reactivas de oxígeno (ROS) y elevó los niveles de superóxido dismutasa (SOD). Mus mejoró el estrés oxidativo y la inflamación en SC hipóxicas al reducir IL-1β y TNF-α. Además, Mus moduló indicadores clave involucrados en el metabolismo del oxígeno, la reparación celular y el neurometabolismo, incluidos C-JUN y GDNF. La IL-1R1, localizada en la membrana SC, se reguló al alza por hipoxia, pero se reguló significativamente a la baja después de la intervención de Mus. Mus también inhibió la expresión de los componentes de la vía NF-κB (IRAK1, IKK, p65, p50) y aumentó la IκB-α. Críticamente, la abolición de la expresión de IL-1R1 a través de la eliminación de siRNA mostró un efecto consistente con Mus. Se concluye que al suprimir la IL-1R1, Mus atenuó la inflamación en SC hipóxicas a través de la inhibición de la vía NF-κB. Este estudio indicó el papel de IL-1R1 en la disfunción SC inducida por hipoxia. Además, Mus podría ser un medicamento potencialmente eficaz para tratar la parálisis de Bell.

Introducción

La muscona (Mus), 3-metilciclopentadecanona, se aisló del extracto natural de almizcle de ciervo ya en 1906¹. El almizcle, una valiosa y eficaz medicina tradicional china (MTC), tiene amplios efectos curativos como detumescencia, antiinflamación, reanimación y promoción de la circulación sanguínea². La medicina tradicional china que contiene almizcle se ha utilizado para una variedad de enfermedades comunes, incluida la enfermedad del sistema nervioso central³, la desintoxicación⁴, los tumores gastrointestinales⁵, la hepatitis viral⁶ y la enfermedad coronaria⁷, etc. Como ingrediente farmacéutico activo del almizcle, Mus ha demostrado excelentes efectos biológicos que involucran antiinflamatorios⁸, antioxidantes ^8,9, reparación de daños neuronales y alivio del infarto de miocardio¹⁰, etc. Mecánicamente, los estudios han demostrado que Mus puede reducir la liberación de citoquinas inflamatorias como la interleucina (IL)-1β, IL-6, el factor de necrosis tumoral (TNF)-α, las especies reactivas de oxígeno (ROS)^1,8 y regular la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK), el factor nuclear kappa-potenciador de la cadena ligera de las células B activadas (NF-κB), AKT/diana mecanicista de la rapamicina (mTOR) y la vía^CaN/Erk1/2 1^{. 8,11}, etc.

En China, se ha informado que algunos médicos han tratado con éxito la parálisis de Bell con almizcle natural de acuerdo con registros de literatura anteriores y experiencia clínica 12,13,14,15. Mus no es un medicamento recomendado en las pautas de diagnóstico y tratamiento, pero en áreas médicas subdesarrolladas o para algunas personas que no pueden usar esteroides o medicamentos antivirales, Mus puede ser otra opción preferida. El análisis de la literatura en los últimos años también muestra que el almizcle es la medicina china más utilizada en las prescripciones de parches de medicina china publicadas y en los estudios de puntos de acupuntura para el tratamiento de la parálisis facial periférica¹⁶. Aunque hay muchos estudios farmacológicos y médicos sobre Mus, aún se desconoce cómo el almizcle curó exactamente la parálisis de Bell y cuáles son los mecanismos neuroquímicos y biológicos celulares subyacentes.

La parálisis de Bell, una parálisis facial idiopática aguda, es el resultado de una disfunción del nervio facial periférico, que inerva todos los músculos faciales. El signo más notable de los síntomas de parálisis de Bell es la debilidad y la caída de los músculos faciales en un lado. Aunque la parálisis facial de Bell no pone en peligro la vida, puede afectar la calidad de vida del paciente e incluso causar ansiedad y depresión. Lo que es particularmente preocupante es que hasta el 30% de los pacientes sufren secuelas a largo plazo, que incluyen sincinesis, contractura, paresia facial permanente y asimetría facial, incluso con el tratamiento adecuado. Por lo tanto, encontrar la resolución de la parálisis de Bell y disminuir el riesgo de parálisis son nuestros principales objetivos. El conocimiento actual sobre el mecanismo patogénico de la parálisis de Bell sigue sin estar claro. Investigaciones recientes han demostrado que la reactivación de virus puede ser la principal causa de la parálisis de Bell, y estos virus pueden causar un edema neuronal e inflamación para desencadenar el ataque de la parálisis de Bell.

Sobre la base de evidencia reciente, planteamos la hipótesis de que Mus alivia los síntomas de la parálisis de Bell al mejorar el daño por estrés oxidativo al nervio facial. Este estudio indicó experimentalmente los efectos terapéuticos de Mus, revelando que la IL-1R1 regulada al alza en SC activa la vía NF-κB, causando daño celular. De manera crucial, demostramos que Mus inhibe la señalización de NF-κB al regular a la baja IL-1R1. Nuestros hallazgos identificaron el papel de la regulación positiva de IL-1R1 en SC expuestos a estrés oxidativo in vitro y posicionaron la administración de Mus como una estrategia terapéutica novedosa.

Protocolo

Esta investigación experimental se llevó a cabo con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Número de aprobación: LL-240077).

Cultivo celular e intervención farmacológica
Las células de rata Schwann (SC) se cultivaron en el medio celular de Schwann, que consistía en medio basal, 5% de suero bovino fetal, 1% de suplemento de crecimiento de células de Schwann, 1% de penicilina y 1% de estreptomicina. Todas las células se mantuvieron en una atmósfera de_CO2 al 5% a 37 °C. Cuando se les permitió crecer hasta una densidad del 70-80%, los SC se dividieron en cuatro grupos (n = 5 por grupo): (1) grupo NC; (2) grupo NC+CoCl₂ ; (3) grupo NC+CoCl₂+Mus; (4) Grupo NC+CoCl₂+siIL-1R1+Mus.

Se sabe que el cloruro de cobalto (CoCl₂), un agente empleado con frecuencia para imitar la hipoxia, desencadena respuestas similares a las de la hipoxia, como impedir la degradación y estabilización de factores inducibles por hipoxia y la acumulación de proteína HIF-1α¹⁵. De acuerdo con el método modificado basado en Osuru et ^al.17, en el grupo NC+CoCl₂ y en el grupo NC+CoCl₂+Mus, los SC se cultivaron en Schwann Cell Medium suplementado con 240 μM de CoCl₂ durante 8 h, en condiciones atmosféricas de 95% de aire y 5% de_CO2 a 37 °C en una incubadora humidificada (21% de O₂). Luego, en los grupos de Mus, se aplicó la intervención de 1,25 μg/mL de Mus durante 24 h adicionales. Mientras tanto, en el grupo NC+CoCl₂+siIL-1R1+Mus, los SC se trataron primero con 24 h de infección por ARNip, luego se cultivaron continuamente con 240 μM de CoCl₂ durante 8 h, seguido de la intervención de 1,25 μg/mL de Mus durante 24 h adicionales, como en los grupos anteriores. El diagrama de flujo del proceso experimental se muestra en la Figura 1.

Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad de los SC se determinó utilizando el reactivo de ensayo cell counting kit-8 (CCK-8) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los SC cultivados a una densidad de 5 × 10⁵ células/pocillo se sembraron en una placa de cultivo celular de 96 pocillos con 100 μL de medio de crecimiento completo a 37 °C en una atmósfera humidificada al 5% de CO₂ . Cuando la confluencia alcanzó el 70-80%, se agregaron 10 μL de solución de CCK-8 a cada pocillo, y las placas se incubaron durante 1 h a 37 °C. La densidad óptica (OD) de las placas de 96 pocillos se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas y se calculó la viabilidad celular. Las células se dividieron en cuatro grupos: grupo NC, grupo NC + CoCl₂ , grupo NC + CoCl₂ + Mus y grupo NC + CoCl₂ + siIL-1R1 + Mus. Los resultados experimentales se corrigieron utilizando un pocillo en blanco (medio + solución CCK8). Tasa de supervivencia celular = [(grupo experimental - pocillo en blanco)/(grupo NC - pocillo en blanco)] × 100%.

Transfección de ARNip
La transfección se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante de un reactivo comercial de transfección in vitro siRNA/miRNA utilizando dúplex sintéticos de siRNA de siIL-1R1 (AUAGUCUUGGAUUUUCUCCAA, GGAGAAAAAUCCAAGACUAUGA) con una concentración de 100 ng/μL durante 24 h. Después de la transfección de siIL-1R1, las expresiones de siIL-1R1 se evaluaron mediante la realización de análisis de RT-qPCR después de 24 h de transfección¹⁸, y se debe garantizar que la eficiencia sea superior al 80%

Ensayo inmunoenzimático (ELISA)
Los sobrenadantes post-cultivo se recolectaron y centrifugaron en condiciones específicas del grupo (2950 g, 20 min, 25 °C). Los niveles extracelulares de IL-1β, TNF-α, ROS y SOD se analizaron mediante ELISA siguiendo las instrucciones del kit. Las lecturas finales de absorbancia a 450 nm se obtuvieron utilizando un lector de microplacas.

Aislamiento de ARN y PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)
Siguiendo las instrucciones del fabricante, se extrajo el ARN total de las células cultivadas utilizando el reactivo TRizol. Los genes diana (IL-1β, TNF-α, S-100b, IL-1R1) se amplificaron en 20 μL de reacciones de mezcla de qPCR SYBR durante 40 ciclos en un instrumento de PCR. La normalización de los datos utilizó β-actina, con especificidad de PCR verificada mediante análisis de curva de fusión. El método 2^−ΔΔCt cuantificó la expresión relativa de cinco muestras independientes ensayadas por triplicado. Los cebadores se enumeran en la Tabla 1.

Western blot
Después del tratamiento, las SC de todos los grupos experimentales se incubaron durante 24 h y se cosecharon. La proteína total se extrajo utilizando un kit de extracción de proteína total. Los lisados de proteínas se combinaron con tampón de carga de electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) desnaturalizado a 98 °C durante 5 min y separado (20 μg por carril) en geles de poliacrilamida SDS al 10-12%. Las proteínas resueltas se transfirieron electroforéticamente a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas se bloquearon con leche en polvo descremada al 5% durante 60 min a temperatura ambiente, luego se incubaron durante la noche a 4 °C en un volumen de 6 ml con los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo anti-HIF-1α (1:1000), anticuerpo anti-GAPDH (1:1000), anticuerpo anti-IL-1R1 (1:1000), anticuerpo anti-C-JUN (1:1000), anticuerpo anti-GDNF (1:1000), anticuerpo anti-IRAK1 (1:1000), anticuerpo anti-IKK (1:1000), anticuerpo anti-p65 (1:800), anticuerpo anti-p50 (1:900), anticuerpo anti-IκB-α (1:900) y anticuerpo anti-β-actina (1:1000). Después del lavado, las membranas se sondearon con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 60 min a 25 °C. Las señales de proteínas se detectaron utilizando Image Studio Digits Ver 4.0. Las intensidades de banda se cuantificaron con el software ImageJ y se normalizaron a la expresión de β-actina y GAPDH. Se realizaron tres experimentos independientes.

Inmunofluorescencia
La localización de IL-1R1 en SC se evaluó siguiendo a Zhao et ^al.19. Coseche las células durante la fase de crecimiento logarítmico mediante tripsinización, vuelva a suspenderlas en medio fresco completo y triture completamente para obtener una suspensión unicelular uniforme. Siembre las células en placas de cultivo que contengan cubreobjetos estériles. Una vez que las células hayan alcanzado la confluencia completa, enjuáguelas 1-2 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), retire con cuidado los envoltorios de cubierta y fije las células adherentes con paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 min, permeabilice con Triton X-100 al 0,05% (10 min) y bloquee con suero de cabra al 5% (1 h). La incubación primaria utilizó mAb de IL-1R1 anti-rata de conejo. Después de los lavados con PBS, las muestras se incubaron con IgG anti-conejo de cabra conjugada con FITC durante 2 h a temperatura ambiente. Agregue agentes de montaje solubles en agua al cubreobjetos para el montaje. Las células inmunomarcadas se visualizaron y cuantificaron utilizando un microscopio de fluorescencia con la longitud de onda de excitación de 492 nm y la longitud de onda de emisión de 520 nm.

Análisis de ultraestructura
Siguiendo el protocolo¹⁹ de Zhao et al., los SC se fijaron en glutaraldehído al 2,5% y se fijaron durante la noche a 4 ° C en tetróxido de osmio al 1%. Las muestras se sometieron a una serie de deshidratación de etanol / acetona. Las secciones ultrafinas (80 nm) se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo antes del examen ultraestructural con un microscopio electrónico de transmisión.

Eliminación de reactivos químicos peligrosos
El medio y las soluciones que contienen CoCl₂ se recogen en un contenedor designado para residuos de metales pesados. Todos los materiales desechables que han entrado en contacto con los líquidos antes mencionados, incluidas las puntas de pipeta, los tubos de centrífuga y los guantes, se clasifican como residuos peligrosos de metales pesados y se transfieren a una empresa autorizada de gestión de residuos peligrosos aprobada por las autoridades pertinentes para su eliminación adecuada. Deseche la solución de paraformaldehído residual en un contenedor de residuos de aldehído dedicado. Los consumibles usados deben recolectarse como desechos de aldehído y procesarse por la misma empresa de gestión de desechos peligrosos con licencia.

Análisis estadístico
Las comparaciones multigrupo se analizaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Tukey en GraphPad Prism 8.0. La significación estadística se definió como P < 0,05. Los datos se presentan como media ±± desviación estándar (DE).

Resultados

Efectos protectores de Mus sobre la lesión por estrés oxidativo de las células de Schwann in vitro
La expresión de HIF-1α exhibió cambios en respuesta a variaciones en circunstancias hipóxicas²⁰. Para modelar la hipoxia, los SC se expusieron a CoCl₂, que indujo con éxito la hipoxia como lo confirman los niveles elevados de proteína HIF-1α, un marcador de hipoxia canónico, a través de western blot (Figura 2A). La...

Discusión

La parálisis de Bell es una parálisis idiopática del nervio facial periférico caracterizada por debilidad facial unilateral. La vaina de mielina realiza varias funciones cruciales en el funcionamiento efectivo de las neuronas²³. Asegura la conducción suave de los impulsos nerviosos, apoya a las neuronas suministrando factores nutritivos y ayuda en el proceso de regeneración²⁴ . Por lo tanto, la pérdida de mielina en el sistema nervioso peri...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de digestión de tripsina al 0,25% (sin EDTA)	Servicebio	G4002
10 cucharadas	Eubiotecnología	BF0153
10-180 KDPretimiento de marcador de proteína de color preteñido	Eubiotecnología	P0069
5% de leche en polvo descremada	Beyotime Biotechnology, China	P0216-300g
anticuerpo anti-C-JUN	Señalización celular, EE. UU.	#9165T
anticuerpo anti-GAPDH	abcam, Reino Unido	AB245355
anticuerpo anti-GDNF	Señalización celular, EE. UU.	#47808
anti-HIF-1&alfa; anticuerpo	Señalización celular, EE. UU.	#14179
anticuerpo anti-IKK	Señalización celular, EE. UU.	#2682
anticuerpo anti-IL-1R1	Señalización celular, EE. UU.	#6775	para WB
anticuerpo anti-IL-1R1	Tecnología de proteínas	84094-6-RR	para inmunofluorescencia
anticuerpo anti-IRAK1	Señalización celular, EE. UU.	#4395
anti-Iκ B-&alfa; anticuerpo	Señalización celular, EE. UU.	#8943
Anticuerpo anti-p50	abcam, Reino Unido	ab305263
Anticuerpo anti-P65	abcam, Reino Unido	AB16502
anti-rata IL-1R1 mAb	Beyotime Biotechnology, China	AF7212
anticuerpo anti-β-actina	abcam	AB179467
Kit de cuantificación de proteínas BCA	Eubiotecnología	WB2123
Reactivo de ensayo kit de recuento de células-8 (CCK-8)	Beyotime Biotechnology, China	C0048M
Cloruro de cobalto (CoCl2)	Macklin, China	C804815
Estrella EuECL	Eubiotecnología	WB2131
Suero fetal bovino (FBS)	Bergolin, China	PWL001
IgG anticonejo de cabra con etiqueta Fitc	Servicebio	GB22303
Microscopio de fluorescencia	Nikon
Reactivo de transfección in vitro de ARNip/miARN Hieff Trans	YEASEN, China	40806ES01
Anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) IgG de cabra anti-ratón marcada con Hrp	Servicebio, China	GB23301
Kit ELISA IL-1β, TNF-α, ROS y SOD	BOSTER, China	BES1762K, BES0481K, BES5018K, BES2920K
Muscone (Mus)	Aladino, China	M141496
Tampón PBS	Servicebio	G4202
Solución de penicilina-estreptomicina, 100x	Procell	PB180120
Membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF)	Millipore, Estados Unidos	IPFL00010
Células de rata Schwann (SC)	Procell Ciencias de la Vida y Tecnología China	CM-M111
Tampón de lisis RIPA	Eubiotecnología	WB2116
Medio de celda Schwann	ScienCell, Estados Unidos	1701
Búfer de carga SDS-PAGE	Beyotime Biotechnology, China	P0015
Tampón de carga de proteína SDS-PAGE, 5x	Eubiotecnología	WB2122
si-IL-1R1	Gen universal	RX0114371
Kit de preparación para gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE)	Eubiotecnología	WB2118
Mezcla de qPCR SYBR	Beyotime Biotechnology, China	D7260
Kit de extracción de proteínas totales	Beyotime Biotechnology, China	PP123-01
Microscopio electrónico de transmisión	Hitachi	HT7800
Trizol	Beyotime Biotechnology, China	R0011
Interpolación-20	Eubiotecnología	WB2114
Agentes de montaje solubles en agua	Absenta, China	ABS9240
Amortiguador de transferencia occidental	Eubiotecnología	WB2129