Establecimiento y evaluación de un modelo murino inducido por extracto soluble en agua de Candida albicans de arteritis coronaria asociada a la enfermedad de Kawasaki

La enfermedad de Kawasaki (EK), una forma de síndrome de ganglios linfáticos mucocutáneos, es una enfermedad autoinmune que ocurre en niños menores de 5 años y se acompaña de vasculitis febril ^1,2,3. Los estudios indican que los cursos no tratados o de tratamiento que exceden los 10 días de EK grave son propensos a inducir complicaciones cardiovasculares graves, principalmente aneurismas coronarios y estenosis de las arterias coronarias ^4,5. La ruptura de aneurismas coronarios puede conducir a un shock cardiogénico o incluso a la muerte súbita, que es la principal causa de cardiopatía adquirida en niños ^6,7. A pesar de que la aplicación de inmunoglobulina intravenosa ha mejorado significativamente el pronóstico, su etiología y patogénesis siguen sin estar claras, lo que restringe el desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas ^8,9. Por lo tanto, establecer modelos animales que puedan simular con precisión las características de las enfermedades humanas se ha convertido en una necesidad urgente para la investigación actual.

Actualmente, un obstáculo importante en la investigación de la enfermedad de Kawasaki es la ausencia de modelos animales bien caracterizados que recapitulen completamente la patología de la enfermedad humana. Entre los diversos modelos desarrollados ahora, el modelo de vasculitis inducido por extracto de pared celular de Lactobacillus casei (LCWE) es un sistema relativamente maduro y este modelo puede causar arteritis coronaria. Es ampliamente utilizado para estudiar el mecanismo de desregulación inmune y citoquinas específicas en vasculitis similares a KD^10,11. El modelo de vasculitis inducido por el extracto soluble en agua de Candida albicans (CAWS) también ha atraído mucha atención debido a su alta similitud con las características patológicas de la enfermedad de Kawasaki humana^12,13. Después de la optimización y mejora sistemáticas por parte de múltiples equipos de investigación, el modelo inducido por CAWS se ha convertido en una herramienta importante para la investigación de la enfermedad de Kawasaki¹⁴. Aunque el CAWS puede inducir inflamación de las arterias coronarias mediante inyección intraperitoneal, tiene limitaciones en el sentido de que no puede reproducir completamente el proceso patológico exacto de la vasculitis EK humana. Por ejemplo, no se encontraron neutrófilos en la patología tardía de la KD¹⁵ humana, pero la infiltración de neutrófilos aún ocurrió en este modelo hasta 16 semanas después de la inyección de CAWS¹⁶. Además, el mecanismo de vasculitis causada por CAWS no ha sido completamente aclarado en la actualidad, lo que limita la comprensión y aplicación profunda del modelo⁹. Este estudio tiene como objetivo establecer un modelo animal estandarizado de EK optimizando el protocolo de inducción de CAWS, dilucidando el mecanismo de la enfermedad y facilitando el desarrollo de terapias dirigidas.

Este estudio utilizó CAWS para establecer un modelo animal más estandarizado de la enfermedad de Kawasaki. A través de experimentos sistemáticos de optimización de dosis, se determinó que la inyección intraperitoneal de 8 mg diarios durante cinco días consecutivos era el régimen de administración óptimo. Este régimen puede inducir lesiones de las arterias coronarias de manera estable mientras mantiene una alta tasa de supervivencia en animales. Además, exploramos más a fondo el papel de la disfunción mitocondrial en la formación de fibrosis durante la fase crónica de la EK, con un enfoque en el posible mecanismo del canal aniónico dependiente de voltaje 1 (VDAC1), una proteína clave que regula la apoptosis mitocondrial, durante la transición de la inflamación a la fibrosis¹⁷. Cabe destacar que, a través del análisis de colocalización de autofagosomas/lisosomas en este estudio, se observó una función de autofagia anormal en este modelo. Este modelo optimizado proporciona una herramienta importante para estudiar sistemáticamente la patogénesis de las lesiones de las arterias coronarias en la enfermedad de Kawasaki y evaluar nuevas estrategias de tratamiento.

Todos los experimentos de investigación con datos de animales fueron aprobados por el comité de ética del Hospital Popular Afiliado Huai'an No.1 de la Universidad Médica de Nanjing (KY-2024-250-01). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de CAWS

1. Inocular Candida albicans en caldo de dextrosa Sabouraud según el protocolo establecido por Duong et ^al.18. Luego, cultive el caldo inoculado anaeróbicamente a 37 ° C durante 48 h en una cámara anaeróbica sellada con una mezcla de gases.
   NOTA: Para garantizar la esterilidad del medio de cultivo, la condición de cultivo anaeróbico a 37 °C debe controlarse estrictamente para evitar la contaminación por bacterias diversas.
2. Enjuague repetidamente con medio limitante de C e incube a 37 °C durante 48 h a una velocidad de rotación de 4,5 x g.
3. Añadir un volumen igual de etanol anhidro y dejar reposar toda la noche a 4 °C.
4. Centrifugar a 4,5 x g durante 15 min a 4 °C, retirar el sobrenadante, añadir un volumen igual de etanol anhidro al precipitado y dejar reposar toda la noche a 4 °C.
5. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante, agregue 50 ml de acetona al precipitado, centrifugue y seque el precipitado. Disuelva el precipitado en solución salina normal estéril para su uso posterior.

2. Construcción de un modelo de ratón de la enfermedad de Kawasaki

1. Seleccione ochenta ratones machos C57BL/6 de grado SPF de 4 a 6 semanas y alójelos en condiciones controladas con libre acceso a alimentos y agua.
   NOTA: Para minimizar la posible interferencia de las fluctuaciones del nivel de estrógeno en las respuestas inmunes e inflamatorias, solo se utilizaron ratones machos en este estudio preliminar de establecimiento y caracterización del modelo¹⁹.
2. Divida los ratones en 4 grupos de manera uniforme mediante el método de tabla de números aleatorios, incluidos 3 grupos de inyección de dosis diferentes de CAWS (4 mg, 8 mg, 12 mg) y 1 grupo de control de solución salina normal, con 20 ratones en cada grupo.
3. Prepare el polvo de CAWS en tres concentraciones de 40 mg/ml, 80 mg/ml y 120 mg/ml utilizando solución salina normal estéril (NaCl al 0,9%). Inyecte al grupo experimental 0,1 ml de CAWS por la mañana del 1º al 5º día del experimento, y administre un volumen igual de solución salina normal al grupo de control en el mismo horario.
   NOTA: La inyección intraperitoneal se realizó con una jeringa de insulina de 1 ml. Cuando opere, coloque el ratón con la cabeza más baja y la cola más alta para evitar daños en órganos como el intestino grueso y delgado cuando se inserta la jeringa.
4. Use una balanza electrónica a las 9 a.m. todos los días para pesar simultáneamente el alimento restante en el comedero y calcular el consumo de alimentos de 24 horas para cada jaula de ratones.
5. En los días 3, 7, 14 y 28 después de la última inyección, seleccione y sacrifique al azar 3 ratones de cada grupo en cada punto de tiempo.
6. Coloque a los ratones en una cámara cerrada precargada con aire ambiente. Introducir CO₂ comprimido a un caudal del 30% del volumen de la cámara por minuto. Después de 5 min, se realizó una luxación cervical para confirmar la muerte.
7. Recolecte y pese muestras de corazón. Observe las lesiones inflamatorias del corazón y los vasos sanguíneos mediante tinción de HE.

3. Estándares de tinción y clasificación de HE

1. El corazón y el arco aórtico (alrededor de 3 mm × 3 mm) se aislaron rápidamente. Realizar una esternotomía mediana de acuerdo con el método descrito²⁰. Separe rápidamente el corazón del arco aórtico (aproximadamente 3 mm × 3 mm). Los tejidos recolectados se fijaron en formalina tamponada neutra al 10% durante 24 h.
2. Después de la fijación, deshidrate los tejidos a través de una serie de etanol graduado (etanol al 70% durante 1 h, etanol al 80% durante 1 h, etanol al 95% durante 1 h y etanol al 100% durante 1 h), limpie en xileno e incruste en parafina. Finalmente, secciona los bloques en rodajas continuas de 5 μm.
3. Para la tinción de H&E, tiñe las secciones con hematoxilina durante 5 min, enjuague con agua corriente durante 10 min, contratiñe con eosina durante 2 min y luego proceda con la deshidratación y el montaje²¹.
   NOTA: Según el grado de lesión de la íntima vascular, se clasifica en tres grados: El grado I se caracteriza principalmente por hinchazón endotelial y agregación de neutrófilos; El grado II se manifiesta como degeneración del músculo liso, infiltración de células inflamatorias y daño a los orgánulos; El grado III se presenta con lesiones graves como necrosis y desprendimiento endotelial, y depósito de fibrina.

4. Tinción tricrómica Masson

1. Después de la fijación, deshidrate las muestras de tejido a través de una serie de etanol graduado, claro en xileno e incrustado en parafina.
2. Después del desparafinado, hidrate las secciones a través de una serie de etanol graduado a agua destilada en preparación para la tinción.
3. Tiña los núcleos con hematoxilina de hierro de Weigert durante 5 min, enjuaga bien con agua corriente y luego tiñe el citoplasma con fucsina ácida roja de Lichun durante 5 min.
4. Diferenciar con ácido fosfomolíbdico al 1% durante 1 min, luego teñir directamente las fibras de colágeno con azul de anilina durante 3 min. Enjuague rápidamente con ácido acético glacial al 1%.
   NOTA: Controle estrictamente el tiempo del paso de diferenciación para garantizar la especificidad de la tinción.
5. Después de la deshidratación con etanol y xileno, volviéndose transparente, selle la película neutra.
6. Enjuague las secciones manchadas con agua corriente para eliminar el exceso de tinte.
7. Deshidrate las secciones a través de una serie de etanol graduado, transparente en xileno y montado con goma neutra.
8. Observe las secciones bajo un microscopio óptico con un aumento constante. Las fibras de colágeno deben aparecer azules, las fibras musculares y el citoplasma rojos, y los núcleos de color azul profundo.

5. Tinción de inmunofluorescencia

1. Fije las secciones de células o tejidos y bloquee con BSA al 5% durante 1 h para reducir la unión inespecífica.
2. Use suero normal del mismo origen de la especie que el anticuerpo secundario, dilúyalo con PBS en una proporción de 1:10 y colóquelo sobre la muestra. Séllalo a temperatura ambiente durante 30 min. Después de sellar, enjuague suavemente dos veces con PBS.
3. Incubar las secciones con el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C. Después del lavado con PBS, agregue el anticuerpo secundario fluorescente e incube en la oscuridad durante 1 h.
4. Tinción del núcleo con DAPI, sellado con agente de montaje antienfriamiento y observación bajo microscopía confocal.

6. Inmunohistoquímica

1. Después del desparafinado y la hidratación de las secciones de parafina, realice la reparación de antígenos y bloquee la peroxidasa endógena.
2. Incubación de anticuerpos y desarrollo del color: Primero, bloquee con suero normal, luego incube el anticuerpo primario y el anticuerpo secundario marcado con HRP en secuencia y, finalmente, el desarrollo del color DAB. Controle el grado de reacción bajo un microscopio.
3. Vuelva a teñir los núcleos celulares con hematoxilina. Después de la deshidratación y la transparencia, selle las placas y observe la señal positiva de color amarillo parduzco bajo un microscopio.
   NOTA: El experimento debe establecer controles y controlar estrictamente las condiciones para la restauración y el desarrollo del color.

7. Detección de autolisosomas

1. Cocultivar macrófagos RAW264.7 con esporas de Candida albicans en una proporción adecuada (10:1), e incubar a 37 °C y 5% de CO₂ durante 4 h, 8 h, 12 h, 16 h, 20 h, 24 h, 28 h, 32 h, 36 h, 40 h, 44 h y 48 h para establecer un modelo fagocítico.
2. Lavar tres veces con PBS preenfriado para eliminar las esporas no fagocíticas.
3. Primero, bloquee las muestras con BSA al 5% durante 30 min. A continuación, incubar sucesivamente con el anticuerpo primario contra LC3 (dilución 1:200) a temperatura ambiente durante 1 h, seguido del anticuerpo secundario marcado con Alexa Fluor 488 a temperatura ambiente durante 30 min.
4. Agregue la sonda de lisosoma Lyso-Tracker Red directamente a las células para visualizar la localización lisosomal. Finalmente, contratiña los núcleos con DAPI (1 μg/mL) durante 5 min.
   NOTA: Todo el proceso de operación debe llevarse a cabo en la oscuridad para garantizar que el tiempo de incubación y la concentración del anticuerpo se controlen con precisión.

Inicialmente, evaluamos sistemáticamente los cambios patológicos miocárdicos inducidos por diferentes dosis de CAWS en ratones. No se observaron muertes en el grupo de control de PBS, el grupo de CAWS de 4 mg y el grupo de CAWS de 8 mg (n = 20 en cada grupo). Por el contrario, la respuesta inflamatoria en el grupo de 4 mg fue leve y no cumplió con los requisitos de modelado. La tasa de mortalidad fue mayor en el grupo de CAWS de 12 mg (9/20, 45%), y las muertes ocurrieron entre el 3º y el 10º día después de la inyección. Estos hallazgos sugieren que una dosis de 12 mg puede causar daño inflamatorio local excesivo y toxicidad sistémica. Por lo tanto, esta dosis se excluyó de estudios posteriores. La dosis de 8 mg finalmente se seleccionó como el régimen de dosificación óptimo porque podría inducir eficazmente una arteritis coronaria significativa mientras mantenía una tasa de supervivencia aceptable y reacciones adversas locales mínimas. (Figura 1A). Finalmente, se determinó que la inyección intraperitoneal de 8 mg de CAWS era la dosis óptima de modelado. Los resultados de la tinción de HE del grupo experimental mostraron un proceso dinámico típico de inflamación y fibrosis. Al tercer día, se produjo una infiltración inflamatoria focal, compuesta principalmente por neutrófilos y monocitos perivasculares. Al séptimo día, el rango inflamatorio se expandió al intersticio miocárdico, acompañado de una inflamación significativa de las células miocárdicas y edema intersticial. Al día 14, la inflamación alcanzó su punto máximo y se produjo un trastorno de la disposición de las fibras miocárdicas y una necrosis focal. Al día 28, aunque se alivió la inflamación, se había formado fibrosis temprana (Figura 1B y Figura 2A). Por el contrario, la estructura miocárdica se mantuvo normal en todos los puntos temporales en el grupo de control. Todos los resultados se confirmaron mediante una evaluación doble ciego, que verificó que una dosis de 8 mg de CAWS podría inducir de manera estable un modelo de lesión miocárdica consistente con las características de la enfermedad de Kawasaki.

Posteriormente, se empleó el método de tinción tricolor de Masson para investigar si la vasculitis similar a la enfermedad de Kawasaki inducida por CAWS daría lugar a una fibrosis persistente que rodea las arterias coronarias (AC). Los resultados experimentales mostraron que en el grupo de ratones inyectados por CAWS, se detectaron depósitos obvios de fibras de colágeno alrededor de las paredes de las arterias coronarias inflamadas y la aorta, y estas áreas fibróticas coincidieron en gran medida con las ubicaciones de distribución de la infiltración de células inflamatorias. Por el contrario, los ratones en el grupo de control de PBS solo mostraron una tinción de colágeno débil, que estaba confinada dentro del rango estructural normal de la pared vascular (Figura 2A). El análisis cuantitativo mostró que se produjo un depósito significativo de fibras de colágeno a los 14 días, y el grado de fibrosis fue estadísticamente diferente al del grupo control (Figura 2C).

Dado que el cambio patológico central en la enfermedad de Kawasaki es la respuesta inmunoinflamatoria de la pared vascular, que implica la acción coordinada de múltiples células inmunes22,23, a continuación exploramos los cambios característicos del microambiente inmune en el modelo CAWS a través de la tinción de inmunofluorescencia (IF). Al 14º día después de la inyección de CAWS, se realizó la tinción de IF de marcadores de células inmunitarias en los tejidos cardíacos de ratones inyectados con CAWS. Los resultados experimentales mostraron que en el día 14 del modelado para ratones en el grupo de tratamiento con CAWS, la infiltración de células T CD3+, células T citotóxicas CD8+, macrófagos tipo CD86+ M1, macrófagos F4/80+ y células asesinas naturales NK1.1+ en arterias coronarias y tejidos miocárdicos aumentó significativamente en comparación con el grupo de control de PBS (Figura 2B,D). Al analizar sistemáticamente los cambios de expresión de estos marcadores inmunes, no solo verificó que el modelo CAWS podía simular con precisión las características inmunológicas de la enfermedad de Kawasaki humana, sino que, lo que es más importante, reveló el posible mecanismo de diferentes subconjuntos de células inmunes en la aparición y desarrollo de la enfermedad, proporcionando una base teórica para el desarrollo posterior de estrategias de intervención inmune dirigidas.

La investigación ha establecido que la disfunción mitocondrial es un mecanismo clave subyacente a la fibrosis miocárdica 24,25,26. Se reconoce que bajo estrés inflamatorio, el canal aniónico dependiente de voltaje 1 (VDAC1), una proteína crítica para el control de calidad mitocondrial, puede desencadenar una apertura anormal de los poros de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP) cuando su expresión está regulada al alza. Esto, a su vez, induce la apoptosis y activa los fibroblastos17,27. Para explorar este mecanismo, evaluamos la expresión de VDAC1 en la fase crónica mediante inmunohistoquímica. Nuestros hallazgos revelaron que, en comparación con el grupo de control de PBS, la expresión de la proteína VDAC1 en el tejido miocárdico de los ratones en el grupo tratado con CAWS se elevó significativamente 28 días después del modelado (Figura 3). Las señales positivas se localizaron predominantemente en áreas fibróticas y alrededor de los vasos sanguíneos, lo que indica que la disfunción mitocondrial mediada por VDAC1 puede contribuir a la fibrosis miocárdica en el modelo de enfermedad de Kawasaki. Estos datos proporcionan evidencia experimental sobre los mecanismos moleculares de la lesión miocárdica inducida por CAWS.

Estudios anteriores han encontrado que la disfunción mitocondrial mediada por VDAC1 está involucrada en el proceso de fibrosis miocárdica de la enfermedad de Kawasaki, pero su mecanismo específico aún no se ha aclarado. Dado que el mantenimiento de la homeostasis mitocondrial depende de la función normal del sistema autofagia-lisosomal. Especulamos que VDAC1 puede exacerbar la fibrosis al influir en la formación o función de los autofagolisosomas, lo que lleva a una acumulación mitocondrial anormal. Para verificar esta hipótesis, primero establecimos un modelo de infección por esporas de Candida albicans en macrófagos (RAW264.7) (Figura 4) y detectamos los cambios dinámicos del flujo autofágico y la actividad lisosomal en el modelo. Los resultados experimentales muestran que la formación de lisosomas de autofagia aumenta en la etapa temprana (dentro de las 2-3 h posteriores a la infección celular), mientras que el flujo autofágico se bloquea en la etapa posterior (3-4 h después de la infección celular). El cambio del flujo de autofagia se puede evaluar mediante el cambio de tinción por fusión después de la colocalización de autofagosomas y lisosomas. Este resultado confirma que la disfunción de los autofagolisosomas puede conducir a un deterioro de la depuración celular.

Figura 1: Análisis histopatológico del corazón y las arterias coronarias. (A) Curvas de supervivencia de ratones inyectados con PBS o diferentes dosis de CAWS (4 mg, 8 mg y 12 mg; n = 20 por grupo). (B) Se presentaron los resultados de la tinción de HE del corazón en el grupo de tratamiento con CAWS (8 mg) en diferentes puntos temporales (3 d, 7 d, 14 d, 28 d). Barras de escala: 1500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Análisis de la fibrosis del colágeno y la infiltración de células inmunitarias. (A) Los resultados de la tinción de Masson del grupo CAWS 8 mg y el grupo de control. Las fibras de colágeno presentan un color azul característico, las fibras musculares y el citoplasma son rojos y el núcleo celular es azul oscuro. Las flechas indican esporas de hongos. Barras de escala: 1500 μm. (B) Resultados de tinción de inmunofluorescencia del grupo CAWS 8 mg y del grupo control (células T CD3+ marcadas con CD3, células T citotóxicas CD8+ marcadas con CD8, macrófagos tipo M1 marcados con CD86, macrófagos F4/80+ marcados con F4/80+ y células asesinas naturales NK1.1+ marcadas con NK1.1). Barras de escala: 200 μm. (C) Evaluar el grado de fibrosis cardíaca. El grado de fibrosis cardíaca se evaluó en función del porcentaje de área de tinción tricromática en el tejido cardíaco del campo visual con un aumento de 800x. El método específico es el siguiente: debido a que las fibras de colágeno se tiñen de verde brillante con tintes aniónicos macromoleculares, se observaron 100 campos visuales con un aumento de 800 veces (todos los cortes con un grosor de 5 μm) y el grado de fibrosis cardíaca se determinó por el porcentaje de área verde en el área total. Cuanto mayor sea el porcentaje, más grave será la fibrosis. (D) El porcentaje de células inmunes se analizó estadísticamente de acuerdo con los resultados de la tinción de inmunofluorescencia, ***p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis inmunohistoquímico de la expresión de VDAC1 en el grupo PBS y el grupo CAWS el día 28. (A) Análisis inmunohistoquímico de la expresión de VDAC1. Barra de escala: 800 μm. Las partículas negras marrones son resultados positivos. (B) Análisis estadístico del porcentaje de células inmunohistoquímicamente positivas para VDAC1, p < 0,001. (C) Análisis estadístico de la puntuación H de la inmunohistoquímica VDAC1. Los datos se derivaron de múltiples réplicas biológicas (n = 20 ratones por grupo), y los resultados se expresaron como media ± desviación estándar y se analizaron estadísticamente (***p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Detección de autolisosoma después de la fagocitosis de Candida albicans por células RAW264.7 de ratón. (A) Las flechas indican esporas de hongos. Barras de escala: 25 μm. El cambio del flujo de autofagia se puede evaluar mediante el cambio de tinción por fusión después de la colocalización de autofagosomas y lisosomas. (B) Un análisis de curso temporal de la tasa de formación de autolisosomas cuantifica los parámetros relevantes. Los resultados se expresaron como media ± desviación estándar y se analizaron estadísticamente (***p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.