Method Article

Método para la privación selectiva del sueño REM usando el chasquido selectivo de la nariz para olvidar el REM (SNiFFer)

DOI:

10.3791/69042

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April 21st, 2026

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1Department of Humanics, University of Tsukuba, 2International Institute for Integrative Sleep Medicine, Tsukuba Institute for Advanced Research (TIAR), University of Tsukuba, 3Division of Neurophysiology, Department of Physiology and Cell biology, Kobe University School of Medicine, 4Institute of Systems and Information Engineering, University of Tsukuba, 5Institute of Medicine, University of Tsukuba

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentamos un protocolo novedoso para la privación selectiva del sueño por movimiento ocular rápido (REM) en roedores.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El sueño se clasifica ampliamente en etapas de Movimiento Ocular Rápido (REM) y no REM, y se han desarrollado diversas técnicas de privación de sueño para estudiar sus funciones. Los métodos tradicionales —como la estimulación mecánica o dejar caer al animal durante el sueño REM— suelen conducir a una rápida habituación y efectos no intencionados del estrés, lo que dificulta la interpretación. Aquí presentamos un método novedoso, suave y suave para la privación del sueño REM en roedores: SNiFFer. Se sabe que los roedores son muy sensibles a los estímulos nasales. En este método, un pincel suave acaricia suavemente la nariz del animal durante el sueño REM, activando de forma fiable la excitación. Para aplicar selectivamente esta técnica durante el sueño REM, utilizamos un sistema de clasificación de las etapas del sueño basado en electroencefalografía (EEG) basado en IA. La intervención se activó solo durante los episodios de REM, y se incluyó un grupo de control con yugo, recibiendo el mismo patrón de estimulación independientemente del estado de sueño. Además, aplicamos SNiFFer en un paradigma de Condicionamiento por Traza de Miedo para comprobar si la privación de sueño REM en un plazo de 6 horas tras el aprendizaje interfiere con la consolidación de la memoria. En comparación con los controles con yugo, los animales tratados con SNiFFer mostraron una disminución significativa en la duración total de episodios REM y episodios REM, lo que indica la especificidad y eficacia del método. En conclusión, la técnica SNiFFer ofrece un enfoque táctil altamente selectivo y mínimamente invasivo para la privación de sueño REM en ratones. Permite un control preciso de las condiciones experimentales y abre nuevas posibilidades para investigar el papel del sueño REM en la memoria y la cognición, con un toque sensible.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El sueño con movimientos oculares rápidos (REM) desempeña un papel fundamental en procesos cognitivos como la consolidación de lamemoria 1,2. Para investigar la importancia funcional del sueño REM en el cerebro, la privación de sueño REM se emplea comúnmente como un enfoque experimental. Actualmente, cuatro métodos principales se utilizan ampliamente para inducir la privación de sueño REM en roedores: el métododel disco giratorio 1, el métodode maceta 3, el método del sopladorde aire 4 y las técnicas de estimulaciónfísica 5,6. Aunque los métodos de disco giratorio y maceta son muy eficaces para eliminar el sueño REM, a menudo introducen un estrés considerable en el animal, como la exposición al agua o fatigafísica 7, lo que puede desconcertar la interpretación de los resultados conductuales y fisiológicos. De manera similar, los métodos de inhalación y los métodos convencionales de estimulación física tienden a entregar estímulos amplios y no específicos al cuerpo, lo que resulta en variabilidad en la intensidad del estímulo y en una elección limitada de gruposde control 4,8.

Realizamos una comparación completa de la literatura que abarca más de seis décadas de investigación sobre privación del sueño REM, que se proporciona en el Archivo Suplementario 1 y la Tabla Suplementaria 1. Incorporamos estudios históricos, mecanicistas, neuroquímicos, hormonales y conductuales fundamentales de las principales líneas de investigación, incluyendo Jouvet, Rechtschaffen, Bergmann, Tufik, Andersen y Borbély. La Tabla Suplementaria 1 organiza los trabajos clave cronológicamente. Rastrea la evolución metodológica de las técnicas de privación del sueño REM y resume sus principales hallazgos biológicos, neuroquímicos, hormonales, inmunológicos, termorreguladores y conductuales. Dado que el presente manuscrito está estructurado como un artículo de métodos en lugar de una revisión histórica exhaustiva, esto se ha añadido como información complementaria.

Para abordar estas limitaciones, desarrollamos un método novedoso que ofrece alta selectividad para la privación de sueño REM. Esta técnica está diseñada para privar selectivamente a los roedores del sueño REM de manera precisamente controlada. En este enfoque, limitamos el estímulo a la nariz del animal, una de las zonas más sensibles enroedores 9. Además, empleamos un sistema de clasificación de las etapas del sueño en tiempo real realizado por IA para detectar e interrumpir episodios de sueño REM con especificidad temporal10. Este sistema de IA se refiere a la señal EEG en los últimos 4 s de época de un solo canal y evalúa las fases actuales de sueño del ratón. Esta configuración también permite la implementación de grupos de control con yugo, lo que permite intervenciones temporalmente ajustadas. Aunque se clasifica como una técnica de privación del sueño REM basada en la estimulación física, nuestro protocolo difiere de los métodos convencionales. Primero, aplicamos análisis en tiempo real de las etapas del sueño usando IA para una intervención precisa y consistente específica de REM. En segundo lugar, limita la región de estimulación solo a la parte superior de la nariz, que es una de las zonas más sensibles enratones 6, lo que resulta en una variación mínima en la duración y fuerza de la estimulación. Por último, acabamos de crear un grupo de control con yugo que recibió cantidades idénticas de estimulación para controlar los factores de confusión. Este protocolo propone un método para investigar funciones específicas del sueño REM.

Para evaluar la utilidad de este método, lo aplicamos para investigar el papel del sueño REM en la consolidación de la memoria de miedo. Estudios previos han informado que la privación de sueño REM afecta la consolidación de la memoria de miedo dependiente del hipocampo, incluyendo los recuerdos de miedoretardados 11,12. Sin embargo, existen evidencias contradictorias sobre el impacto de la privación de sueño REM en los procesos de memoria que activan circuitos cerebrales distribuidosy complejos 5,13. La consolidación de la memoria de miedo traza requiere la asociación de un choque en el pie (estímulo incondicionado), una señal auditiva (estímulo condicionado) y el intervalo de traza entre ambos, un proceso conocido por reclutar múltiples regiones cerebrales, incluyendo el hipocampo, la corteza prefrontal medial y laamígdala 14. Por ello, privamos a los ratones del sueño REM durante 6 horas inmediatamente después del condicionamiento de miedotraza 15, una ventana temporal conocida por ser crítica para la consolidaciónde la memoria 16. Utilizando este protocolo, evaluamos el efecto de la privación de sueño REM en la consolidación de los rastros de memoria que dependen de la actividad coordinada de los sistemas neuronales distribuidos. Este artículo presenta un método novedoso que describe un protocolo experimental detallado que prueba sus efectos.

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Protocol

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Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Tsukuba. En este estudio se utilizaron ratones macho y hembra C57BL/6J (11–13 semanas, 20–35 g). La lista completa de materiales e instrumentos utilizados en este estudio se proporciona en la Tabla de Materiales.

1. Implantación quirúrgica de electrodos EEG17

  1. Anestesia y preparación del animal
    1. Induce anestesia con isoflurano al 4% mezclado con aire en 3 minutos. Se confirmó una anestesia adecuada por la ausencia del reflejo de retirada de los pedales y el tono muscular, junto con patrones respiratorios estables.
    2. Afeita la cabeza dorsal y la región del cuello desde la nuca hasta la zona entre los ojos usando una afeitadora eléctrica. Cuando un ratón indica estar despierto, como el movimiento de los bigotes, induce anestesia de nuevo.
  2. Fijación de la cabeza y exposición al cráneo
    1. Asegura al animal en un marco estereotáxico, asegurando la alineación nasal y craneal. Desde ese momento hasta el final de todo el procedimiento quirúrgico, la anestesia se mantuvo continuamente mediante un sistema de bomba vaporizadora de isoflurano.
    2. Aplica pomada oftálmica en ambos ojos para evitar la sequedad corneal. Elimina cualquier vello restante con una crema depilatoria.
    3. Haz una incisión en la línea media del cuero cabelludo y retrae suavemente la piel para exponer el cráneo desde la línea posterior de la oreja hasta la línea anterior de los ojos. Retira el tejido mucoso con un hisopo de algodón.
  3. Identificación y nivelación de monumentos
    1. Identificar bregma y lambda; Ajusta el brazo estereotáxico para que estos puntos queden nivelados dentro de ±0,05 mm. Verifica que las coordenadas laterales ±3,0 mm del bregma también estén niveladas (±0,05 mm).
  4. Taladrado y colocación de tornillos
    1. Marque las siguientes coordenadas relativas a la bregma. Perfora cuatro agujeros piloto como estas coordenadas. Anterior–Posterior / Medial–Lateral: +1,5 mm / ±1,5 mm, –3,0 mm / ±1,7 mm.
    2. Implanta tornillos de grabación EEG en cada orificio y fíjalos con gel pegamento a base de cianoacrilato. Agrupa y cubre el cráneo y los cables expuestos con una fina capa de cemento dental.
  5. Cuidados postoperatorios
    1. Administrar 0,5 mL de solución de glucosa al 5% y 0,13 mL de ibuprofeno (o analgésico equivalente).
    2. Devuelve al ratón a su jaula de origen, una jaula cilíndrica de Plexiglás (21,9 cm de diámetro, 31,6 cm de altura) situada dentro de una cámara aislada (45,7 x 50,8 x 85,4 cm). La cámara se mantiene a una temperatura de 23,5 ± 2,0 °C, una humedad relativa del 50,0% ± 10,0%, y un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas (fase clara: 9:00 a 21:00).
    3. Coloca al animal en una jaula de recuperación calentita. Espera delante de la jaula hasta que un ratón se despierte. Tras la cirugía, los animales se mantuvieron en alojamientos individuales y no se les devolvió a alojamientos grupales durante toda la duración del experimento.

2. Manejo y habituación

  1. Calendario para experimentación
    1. Comienza el manejo durante la fase ligera, 24–48 horas después de la cirugía. Continúa durante cuatro días consecutivos.
  2. Procedimiento quirúrgico
    1. El primer día, pon un ratón a mano durante 2 minutos para 2 veces. Coloca el ratón sobre la palma abierta del experimentador con los dedos extendidos y la palma hacia arriba. Coloca la palma ligeramente más arriba que el antebrazo, ya que los ratones tienden a trepar naturalmente a superficies elevadas. Permite que el ratón se mueva libremente sin restricciones; Si el ratón intenta subirse al antebrazo, devuélvelo suavemente a la palma sujetando suavemente la base de la cola. Cada intervalo dura más de 20 minutos. Esto debe realizarse durante la fase de luz.
      NOTA: Si un ratón salta de la mano o la muerde, usa tela o papel de seda para cubrir la mano solo el primer día. La ropa se puede reutilizar y debe limpiarse cada dos semanas.
    2. En los días 2–4, deja un ratón a mano durante 2 minutos durante 3 veces. Cada intervalo y el periodo conducido son los mismos que el día 1. Evalúa la habituación de forma conductual: los ratones no habituados suelen intentar escapar saltando o mordiendo con fuerza, mientras que los acostumbrados exploran activamente la palma con intentos mínimos de escape y poca o ninguna mordida violenta.
    3. Al final de la última sesión de manipulación, conecta el ratón al cable de grabación EEG.
      NOTA: Cuando el material de la cama sea excesivo para dificultar la nariz del ratón, recóllelos manualmente y retíralos durante la sesión de manipulación o en el momento de la conexión.

3. Registro de EEG de referencia

  1. Empieza desde los días postoperatorios 5 y 6. Grabar EEG continuo de 11:00 a 17:00 cada día. Si el material de cama obstruye el acceso al nariz del ratón, retira gradualmente el exceso de cama para asegurar un acceso nasal claro y minimizar la molestia al animal para el proceso posterior.

4. Condicionamiento del miedo18,19

  1. Comienza el día 7 (u 8) postoperatorio entre las 10:00 y las 11:00. Como preparación, rociar un 70% de etanol en la cámara de acondicionamiento (30 x 25 x 24 cm), que consta de paredes acrílicas transparentes y un suelo de rejilla de acero inoxidable (varillas de 2,0 mm de diámetro separadas por 6,0 mm).
  2. Protocolo de entrenamiento (total de sesiones 1.100 s)
    1. Entrega cinco señales auditivas (sonido ascendente de 20 s, 5–20 kHz a 1,25 Hz, duración de 0,8 s) a 180 s, 400 s, 620 s, 840 s y 1060 s. Combina cada señal sonora con el amortiguador de pie (1,0 mA, 2 s) entregado a 218 s, 438 s, 658 s, 878 s y 1098 s.

5. Privación del sueño REM

  1. Grupo de privación del sueño REM (grupo RSD)
    1. Inmediatamente después del condicionamiento por miedo (ZT2-ZT8), monitorizar el EEG en tiempo real activando el sistema de clasificación de las etapas del sueño basado en IA para permitir la detección en tiempo real del sueño REM. Al detectar sueño REM, hacer cosquillas suaves en la nariz del animal con un pincel suave hasta que se vuelva a despertar, con una latencia media desde el inicio del estímulo hasta la activación de 0,89 ± 0,063 s (media ± SEM).
    2. Durante el experimento, la excitación se definió como una respuesta conductual al estímulo táctil, específicamente al movimiento de los bigotes tras la estimulación. Anota la marca temporal de cada cosquilla para su análisis posterior.
      NOTA: El movimiento de cosquilleo se realizó sin un patrón direccional fijo (por ejemplo, de un lado a otro, hacia arriba o circular), manteniendo una estimulación táctil ligera y constante limitada a la parte superior de la nariz. Si la nariz está obstruida, la estimulación se dirige hacia la región vibrisal (bigote), que normalmente está expuesta. Si el ratón está de espaldas al pincel, gira la jaula según sea necesario para asegurar un acceso libre a la zona nasal. Al usar una jaula con tapa abierta, también puede aplicarse estimulación desde arriba para asegurar un acceso nasal o vibrisal constante.
  2. Grupo de control con yugo (grupo con yugo)
    1. Empareja cada ratón con yugo con un equivalente privado de REM. Aplica cosquillas nasales al ratón enamorado en sincronía con los episodios REM de su pareja, coincidiendo tanto con el inicio como con la duración. Cada ratón utiliza el mismo pincel dedicado durante todo el experimento de privación del sueño REM. Después de cada uso, rocía el cepillo con agua ligeramente ácida y limpiádelo con papel higiénico. Deja al menos un intervalo de 24 horas entre usos para asegurarte de que el pincel limpio esté completamente seco.

6. Pruebas de memoria

  1. Prueba de recuerdo contextual (Prueba A)
    1. Empieza desde 24 horas (±3 horas) después de la privación de sueño. Devuelvo el ratón a la cámara de acondicionamiento original (con un 70% de olor a etanol). Graba el comportamiento de congelación durante 5 minutos.
  2. Prueba de recuerdo con señal sonora (Prueba B)
    1. Realiza la sesión 3 horas después de la Prueba A.
    2. Preparación del contexto: Rociar agua en el contexto B (prisma triangular (30 cm de altura) que consta de tres paredes con largos laterales de 31 cm, 24 cm y 24 cm. Dos de las paredes están cubiertas con papel blanco, y la tercera es de acrílico transparente a través del cual se ve un rectángulo azul en el fondo. La estructura tiene un suelo de plástico y un techo acrílico transparente).
    3. Graba el comportamiento de congelación durante 6 minutos. Da una sola señal auditiva de 180 s idéntica a la del entrenamiento a 180 s.

7. Análisis de datos

  1. Puntuación en la etapa del sueño (Figura 1C-G)17
    1. Para cada Vigilia/NREM/REM, calcula la cantidad total, el número de episodios, la duración media de los episodios y el número de transición del sueño basándose en datos calificados por expertos humanos. Criterios de cada etapa a continuación.
      Estela: Baja amplitud, alta frecuencia (β/γ)
      NREM: Alta amplitud, baja frecuencia (δ)
      REM: De baja amplitud, dominante theta
  2. Calidad de privación (Figura 1B)
    1. Evalúa la etapa del sueño durante la cual se aplica cada estímulo de cosquillas comparando su marca temporal con datos EEG anotados por un experto humano.
  3. Comportamiento de congelación (Figura 1H,J-K)
    1. Utiliza FreezeFrame4 (Actimetría) para cuantificar la inmovilidad (excluyendo la respiración) durante pruebas de condicionamiento por miedo y de recuerdo.
      1. Inicia el software FreezeFrame 4 y selecciona el modo Grabadora . Desde el menú Archivo (esquina superior izquierda), especifica la carpeta de destino para guardar los archivos de grabación. En los cuatro campos de entrada blancos del panel izquierdo, introduce identificadores únicos correspondientes a cada ratón, asegurando la alineación con las cuatro ventanas de visualización de archivos en el lado derecho de la pantalla.
      2. Haz clic en el panel de Protocolo en la parte inferior de la interfaz y define los parámetros de grabación, incluyendo la duración total de la grabación y el tiempo de las señales auditivas y las descargas de pies según el diseño experimental.
      3. Haz clic en Referencia en el centro de la pantalla para obtener la imagen de referencia de fondo. Coloca el ratón en la cámara de acondicionamiento y luego haz clic en Inicio para empezar a grabar.
  4. Análisis de índice de discriminación (Figura 1L)
    1. Calcular el índice de discriminación mediante la siguiente fórmula:
      Congelación en 5 minutos de media en el examen A - congelación en los primeros 3 minutos media en la prueba B) / congelación máxima en 5 minutos media en la prueba A, congelación en los primeros 3 minutos media en la prueba B.
  5. Análisis del índice de reactividad de choque (Figura 1I)
    1. Utiliza la pista manual para medir el movimiento bidimensional de los animales 2 antes y después del shock, en el punto de inicio de la sesión de condicionamiento del miedo. Calcula el índice de reactividad por choque mediante la siguiente fórmula:
      movimiento durante el choque - movimiento preshock / movimiento durante el shock + movimiento preshock

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Implantación quirúrgica de electrodos EEG
Los ratones deben ser completamente anestesiados durante la cirugía. Si presentan signos de fallo de la anestesia, como dificultades, deben ser retirados del protocolo. De manera similar, si el sangrado dura más de 10 s, puede causar daños graves en el cerebro del ratón, por lo que se recomienda retirarlo de la experimentación. Después de la cirugía, la mayoría de los ratones suelen despertarse en menos de 1 hora. Su marcha y ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo permite la privación selectiva del sueño REM en ratones con ratones control con yugo. A diferencia de métodos tradicionales como la maceta y la técnica de disco giratorio, este sistema permite la implementación de grupos control finamente emparejados, en los que los animales reciben la misma estimulación en el mismo momento circadiano. Además, este enfoque minimiza la variabilidad en la ubicación de la estimulación, una limitación común de los métodos convencionales de man...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no declaran intereses en competencia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Y. Nakata por la clasificación de la etapa del sueño. Agradecemos a todos los miembros del IIIS. Este trabajo está apoyado por subvenciones de AMED JP21zf0127005, JP21km0908001, JP23wm0525003, la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (26H02428, 24H00894, 23H02784, 22H00469, 16H06280 a M.S., 23K19393 y 24K18212 a I.K., 25KJ0664 a C.K., 24H00893 a T.N.), y la Fundación Científica Takeda.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5% de glucosaOtsukba35061410
Cabezal de 6 pinesHirose172-0989
AdhesivoKonishi16351
Máquina anestésicaShinano SeisakushoSN-487-0T
Carcasa de crimpadoHirose688-9095
Vaso de crimpadoHirose688-8982
Freezeflame4Asociados de MedicinaRRID:SCR_014429Versión 4.104
GraphPad PrismGraphPadRRID:SCR_002798Versión 10.5.0
IbuprofenoIndustria Química de TokioI0415
IsofluranoViatris901036504
Loctite454HenkelUFI:  MAK2-7WRP-G202-F235
Ratón (C57BL/6J)El Laboratorio JacksonRRID: IMSR_JAX:00066411,0 - 13,0 semanas de edad en sesión de condicionamiento por miedo
PincelNamurataiseidou4943668000448SDflat nº 8, longitud de la punta: 8,2 mm; Ancho: 18,8 mm
Líquido ProviniceShofu21400BZZ00451000250 mL
Polvo ProviniceShofu21400BZZ00451000250 g
SleepSignRecorderKISSEI COMTECRRID:SCR_018200Versión 1.2.10
Tornillo de acero inoxidableYamazakiN/Aφ 1.0 y tiempos; 2.0
Instrumentos estereotaxicos estándarALA Scientific68038
Aceite de girasolSigma-AldrichS5007-250ML
Petrolato blancoTaiyo PharmaceuticalK09-TS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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